El cultivo y aplicaciones de la Rotación de biorreactor de pared de los vasos Derivado de modelos 3D de las células epiteliales

Este protocolo no convencional presenta un sistema sencillo y robusto para cultivar células epiteliales humanas en modelos tridimensionales organotípicos que reproducen el tejido humano in vivo. Primero, las células epiteliales se cultivan hasta formar una monocapa confluente en un frasco de cultivo de tejidos, se cosechan y luego se combinan con microesferas portadoras en el biorreactor STLV. Se hace girar el STLV sobre la plataforma para crear un entorno de caída libre constante con bajo esfuerzo cortante del fluido, lo que permite que las células se adhieran y crezcan sobre las microesferas y formen agregados celulares tras 96 horas y aproximadamente cada día posterior.

Reponga el medio en el SDLV para compensar el metabolismo celular tras la formación de agregados; tome muestras para imagen por microscopía óptica semanalmente para monitorear la progresión del desarrollo una vez que se haya completado la formación de agregados y la diferenciación celular. Siembre los agregados para análisis experimentales y ensayos posteriores. En última instancia, este sistema puede generar modelos organotípicos similares a los in vivo para una gran variedad de investigaciones científicas.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el cultivo celular convencional es que las células epiteliales se diferenciarán y polarizarán en agregados similares a tejidos, comportándose así morfológica y funcionalmente de manera similar al tejido humano auténtico. Este sistema de modelo 3D proporciona una mayor comprensión de la biología de las células epiteliales, las interacciones entre hospedador y patógeno, y la compleja interacción entre los tipos celulares que pueden introducirse en el sistema. Dra. Andrea Radkey.

Un postdoctorado en mi laboratorio demostrará ahora este procedimiento para desintoxicar el biorreactor lateral de giro lento. Cubra los puertos abiertos con tapones de seguridad. Llene el STLV con etanol al 95 % y equilibre durante 24 horas.

Retire el etanol, luego llene con agua destilada esterilizada e incube durante 24 horas utilizando las herramientas proporcionadas por el proveedor, afloje todos los tornillos y retire el tapón central del STLV. Colóquelos en una bolsa de esterilización y autoclave a 110 grados Celsius durante 20 minutos. Vuelva a armar el STLV y repita la desintoxicación para asegurar la esterilidad.

A continuación, apriete los tornillos del STLV. Conecte la llave de paso esterilizada de un solo sentido a cada puerto. Ahora retire los émbolos de una jeringa de bloqueo de aguja de 10 mililitros y de una jeringa de bloqueo de aguja de cinco mililitros, y mantenga los émbolos dentro de sus envoltorios.

Para mantener la esterilidad, atornille las jeringas a la llave de paso. Proceda a añadir DPBS a la jeringa de 10 mililitros hasta que el STLV esté lleno y comience a llenarse la jeringa de 5 mililitros. Luego, sustituya los émbolos estériles en cada jeringa y elimine las burbujas residuales en el biorreactor alternando entre los émbolos de las jeringas.

Cierre las llaves de paso y conecte el STLV a la plataforma vertical giratoria. Gire durante un mínimo de 24 horas para monitorear fugas en un tubo cónico de 50 mililitros. Añada 15 mililitros de DPBS a 250 miligramos de microperlas de CytoDex y autóclave después de enfriar.

Elimine el DPBS lavando tres veces con medio de cultivo para las células epiteliales. Agite el tubo para resuspender las perlas. Luego, resuspenda las perlas en 15 mililitros de medio de cultivo.

Primero, cultive un vez diez a la séptima, células epiteliales como monocapas en matraces de cultivo de tejidos. Recoleccione las células y cuéntelas, y determine la viabilidad celular mediante exclusión de azul de trian. Tinción, agregue las células a las perlas preparadas.

Lave el tubo cónico para asegurar que todas las células sean transferidas. A continuación, retire el DPBS y las jeringas del STLV. Asimismo, retire el tapón del puerto central utilizando una pipeta serológica de 10 mililitros.

Cargue la suspensión de microesferas con células epiteliales en el STLV. Enjuague el tubo cónico una vez para transferir todas las células y microesferas. Luego reemplace el tapón del puerto central.

A continuación, retire los émbolos de una jeringa de cinco mililitros y de una jeringa de 10 mililitros y vuelva a colocar los émbolos en sus envoltorios. Para mantener la esterilidad, conecte los puertos en pulgadas de la jeringa con llaves de paso abiertas. Llene el STLV con medio.

Sustituya los émbolos y cierre la llave de paso. Ahora equilibre la nueva cultura de STLV sembrada en un incubador a 37 grados Celsius durante 30 minutos sin rotación. Después de retirar el STLV del incubador, abra la llave de paso.

Retire cualquier burbuja utilizando los émbolos y cierre la llave de paso. Luego, configure el STLV para que gire continuamente a 20 RPM dentro del incubador. Después de 96 a 120 horas, cambie el medio retirando las jeringas y abriendo ambas llaves de paso, inclinando ligeramente el STLV para permitir que los microgránulos y las células sedimenten.

Una vez asentado, retire aproximadamente el 75 % del medio del puerto lateral utilizando jeringas para realizar el protocolo de alimentación. Nuevamente, continúe reponiendo el medio según sea necesario según el metabolismo celular. También supervise el crecimiento y la viabilidad de los agregados cada cinco a siete días.

Para evitar la rotura de agregados, utilice una punta de pipeta de 1000 microlitros que haya sido cortada aproximadamente dos centímetros desde el extremo y esterilizada. Retire cuidadosamente 200 microlitros de agregados del puerto central y reparta en dos tubos de 1,5 mililitros. Utilice un alícuota para monitorear la viabilidad celular. Después de separar las células de las perlas, evalúe la viabilidad mediante exclusión con azul de tripano.

Tinción para la obtención de imágenes de agregados celulares. Añada de 0,5 a un mililitro de medio al segundo alícuota de agregado de 1,5 mililitros y transfiera a una pequeña placa de Petri utilizando una punta de pipeta de 1000 microlitros cortada. Imagen de los agregados con la punta de pipeta.

Al utilizar un microscopio óptico invertido para algunos modelos de células epiteliales, es necesario transferir los agregados a un recipiente desechable partido por la mitad para aumentar la aireación del cultivo aproximadamente una semana antes de recolectar los agregados. Para el análisis, retire las jeringas del STLV y vierta alrededor del 50 % del medio a través del puerto lateral. Retire el tapón central y vierta cuidadosamente todo el contenido en un tubo cónico de 50 mililitros a través del puerto central.

Lave el STLV dos veces con cinco mililitros de medio y combine los lavados con los agregados recolectados. A continuación, transfiera los agregados del tubo cónico de 50 mililitros al Harv. Después de una semana, recolecte cuidadosamente los agregados para posibles formatos de ensayo; los ensayos y análisis mostraron que los agregados epiteliales humanos diferenciados se cultivaron en el sistema de biorreactor STLV.

Las imágenes de SEM y TEM se obtuvieron de células vaginales humanas cultivadas en el STLV durante 39 días. Obsérvese que los agregados tridimensionales muestran características ultraestructurales similares a las de los tejidos, como microarrugas, invaginaciones, vesículas secretoras intracelulares y microvellosidades en la superficie apical. Las imágenes de microscopía confocal de inmunofluorescencia de células vaginales tridimensionales indican la expresión de mucina y marcadores específicos de células epiteliales y diferenciación terminal. Los fenotipos fisiológicamente relevantes también sirven como una excelente plataforma para evaluar la toxicidad de compuestos.

El ensayo MTT, un método comúnmente utilizado para medir la viabilidad celular, el metabolismo o la proliferación, puede emplearse para medir la toxicidad frente a diversos productos químicos y compuestos. Alternativamente, mida la toxicidad tras el tratamiento con compuestos de ensayo mediante exclusión de azul de tripano. En este ejemplo, tras el tratamiento con NONOXINOL nueve, los agregados vaginales mostraron una respuesta de toxicidad similar a la de los modelos explicantes cervicales X, pero un perfil diferente en comparación con monocapas.

Los agregados tridimensionales son funcionalmente responsivos, por ejemplo, tras la estimulación con moléculas derivadas de microbios que son reconocidas por los receptores tipo toll. Los agregados responden y secretan citoquinas proinflamatorias, incluyendo la proteína IL seis y la expresión del ARN mensajero del receptor de progesterona. También se puede observar en las células vaginales un receptor que responde a la estimulación hormonal.

Los agregados tridimensionales no solo tienen la capacidad de responder a moléculas de patógenos y hormonas, sino que también pueden soportar funcionalmente una infección por el virus del herpes simple tipo dos. Una imagen de microscopía confocal de agregados vaginales tridimensionales infectados con el VHS-2 demuestra la infección. Las propiedades físicas y funcionales de las células individuales dentro de los agregados también se pueden cuantificar mediante citometría de flujo, por ejemplo, mediante un ensayo de citometría de flujo para medir la expresión superficial de muck en células vaginales individuales.

Los agregados vaginales tridimensionales expresaron un porcentaje menor de muck uno en su superficie en comparación con las monocapas después de su desarrollo. Esta técnica permitió a los investigadores en los campos de la biología de tejidos y las enfermedades infecciosas estudiar la estructura y las respuestas fisiológicas a estímulos. Al utilizar estos modelos organotípicos, mejoramos la recapitulación de la biología humana.