Name: Detección de microARN en tumores de próstata por el cuantitativo PCR en tiempo real (qPCR) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprende a detectar microARN en tumores de próstata mediante qPCR cuantitativo en tiempo real. Este método permite cuantificar biomarcadores moleculares con alta sensibilidad para investigación oncológica.

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Este trabajo fue financiado por la Sociedad Canadiense del Cáncer del Instituto de Investigación, conceder ninguna. 019038.

<html> 1. Recogida de muestras de próstata <ol><li> Recoger las muestras de la próstata en el momento de la prostatectomía. La muestra se orienta utilizando puntos de referencia anatómicos. La próstata y las vesículas seminales están pintadas de la siguiente manera: verde, lado derecho, lado izquierdo azul. </li><li> Una sección media transversal al azar de la próstata se toma perpendicularmente a la superficie rectal, se congelaron en nitrógeno líquido, y se almacenó a -80 ° C 9. </li><li> Rebanadas de muestras depositadas son fotocopias, orientado (anterior, posterior, derecha e izquierda), quadrisected. Las secciones se cortan con el criostato. </li><li> Las secciones se tiñeron con H &amp; E y revisado por un patólogo para determinar y delimitar las áreas tumorales en comparación con lo normal en las diapositivas de colores y una imagen correspondiente. Las áreas marcadas son usadas como una guía para indicar las zonas de la que extraer el tejido tumoral de que el ARN se extrajo en los pasos subsiguientes. </li></ol>romper &quot;&gt; 2. Aislamiento de ARN total, incluidos el miRNA, a partir de muestras <ol><li> Colocar las muestras congeladas de próstata en hielo seco y refiriéndose a la delineada fotocopia, cortar una pequeña porción del tumor de próstata (entre 50 a 100 mg). </li><li> Homogeneizar el tejido del tumor de próstata en 1 ml de reactivo TRIzol. Las cantidades en los siguientes pasos se basan en el uso de 1 ml de reactivo TRIzol. </li></ol> Nota: Aquí hemos utilizado reactivo TRIzol para extraer ARN, sin embargo otros kits que aíslan pequeños ARN que contienen ARN total también se puede utilizar. <ol start="3"><li> Se incuban las muestras homogeneizadas durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 0,2 ml de cloroformo para las muestras y agitar enérgicamente durante 15 segundos. Incubar las muestras durante 3 minutos a temperatura ambiente, luego se centrifuga a 12.000 xg durante 15 minutos a 4 ° C. </li><li> Transferir la fase acuosa superior incolora a tubos nuevos, y añadir 0,5 ml de alcohol isopropílico.Incubar las muestras durante 10 minutos a temperatura ambiente, luego se centrifuga a 12.000 xg durante 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento que contiene el ARN. Lavar el precipitado de ARN con 1 ml de etanol al 75%. Vortex la muestra y de re-sedimento por centrifugación durante 5 minutos a 7.500 xg a 4 ° C. </li><li> Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y secar el pellet de ARN durante 5-10 minutos, asegurándose de que el precipitado de ARN no está completamente seca. Vuelva a disolver en agua libre de nucleasa apropiado para el tamaño de pellets. Medir la concentración de ARN utilizando el espectrofotómetro NanoDrop 1000 (absorbancia medida a 260 nm y 280 nm). </li><li> Compruebe la calidad y la integridad de las muestras de ARN utilizando Agilent Bioanalyzer. </li></ol> 3. La transcripción inversa del ARN <ol><li> La transcripción inversa del ARN se realizó utilizando el Kit de miScript transcripción reversa de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Qiagen). Este kit incluye untranscriptasa inversa y una polimerasa poli (A). El tampón miScript RT incluye Mg 2 +, dNTPs, oligo-dT primers y cebadores aleatorios. </li><li> Utilizar entre 10 pg y 1 g de ARN para sintetizar ADNc. Si utiliza más de 1 mg de ARN, ampliar la reacción linealmente con el volumen apropiado. </li><li> Prepare una mezcla maestra que contiene 5 veces miScript RT Buffer (4 l), Reverse miScript Mix transcripción (1 l), y el agua libre de ARNasa para que las reacciones a volumen final de 20 l. También se incluyen plantillas de ARN (hasta 1 g) en la mezcla maestra. </li><li> Se incuban las muestras durante 60 minutos a 37 ° C, seguido inmediatamente por una incubación durante 5 minutos a 95 ° C. Este paso puede realizarse en una máquina de PCR, calentando baño bloque, o agua. Termocicladores son el método más adecuado y preciso. Guarde el cDNA en el hielo para el corto plazo, y -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo. </li></ol> 4. Generación de una curva estándar <ol><li> Antes de experperimento con miARNs diana, una curva estándar se genera mediante el uso de cDNAs de concentraciones conocidas en contra de sus puntos de cruce (CP) (Figura 2). </li><li> Preparar una serie de diluciones de dos veces, 10 veces, 50 veces, 250-veces, y 1250-pliegue del cDNA original de una muestra que se sabe que tiene una expresión sustancial de su gen de interés. </li><li> Ejecute el PCR como se especifica en la Sección 5 &quot;en tiempo real PCR para la detección de miRNA&quot;, con la salvedad de que ADNc está en diluciones en serie no es una dilución 40x estática. </li><li> Realizar un análisis utilizando el software de RelQuant (Roche) para generar la curva estándar. </li></ol> Nota: una nueva curva estándar se debe generar para cada gen de interés. 5. PCR en tiempo real para la detección de miRNA <ol><li> PCR en tiempo real de miRNAs se ha realizado mediante miScript SYBR Green PCR kit de ensayo y miScript Primer acuerdo a las instrucciones del fabricante (Qiagen). Prepare una mezcla maestra que contenía2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, 10x Primer miScript Universal, ensayo 10x Primer miScript, y el agua libre de RNasa. Prepare una mezcla maestra para una reacción de volumen de 20 l. </li><li> El Ensayo de imprimación es específica para el miARN de interés. Para reconstituir 10x Ensayo imprimación miScript, centrifugar el vial brevemente, y añadir 550 l de tampón TE, pH 8,0. Vortex el vial brevemente para mezclar, cebadores alícuotas a volúmenes más pequeños, y almacenar a -20 ° C. Dos cebadores se requiere:. Cebadores para el gen diana y el gen de referencia RNU6B usedas es el gen de referencia. </li><li> Diluir las alícuotas de cDNA adicionales 40x y almacenar a -20 ° C. </li><li> ADNc sirve como molde para la PCR. Utilice 2 l de cDNA diluido 40x y dispensar a los 20 l luz de ciclo, los capilares (Roche). </li><li> Añadir 18 l de la mezcla maestra a cada capilar, y centrifugar utilizando un adaptador capilar. </li><li> Coloque los vasos capilares en un capilar basada en tiempo real termociclador, como LightCycler 3.5 Real-Time PCR System con un formato de carrusel 32-capilar. </li><li> Ejecutar el programa de ciclos de PCR como sigue: Para activar la polimerasa HotStarTaq que está en el 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, pre-incubar a 95 ° C durante 15 minutos. Seguido por 50 ciclos de: La desnaturalización, 15 s, 94 ° C; Recocido, 30 s, 55 ° C; Extensión, 30 s, 70 ° C. </li><li> Selección de una muestra para ser el calibrador, y establecer su importe objetivo normalizado a 1. Comparar la expresión relativa de los genes miARN en todas las otras muestras en el calibrador. </li></ol> Nota: En un estudio, la misma muestra de calibración se debe utilizar para mantener la consistencia de los resultados. 6. Análisis de datos <ol><li> Curvas de amplificación de la reacción de PCR se representan de forma gráfica y numérica por la versión del software Molecular bioquímicos LightCycler 3.5 (Roche). Cuantificar las reacciones en la &quot;cuantificación&quot; ficha, unaª exportar los datos a un archivo de texto. </li><li> Importar los datos al software de análisis RelQuant (Roche) para generar resultados de la cuantificación. Importación de archivos separados para gen diana, el gen de referencia, y los datos estándar de la curva. </li><li> Especifique la posición del calibrador para tanto el objetivo como gen de referencia. También debe especificar las posiciones de las muestras. Los datos se expresan como el objetivo para hacer referencia a relación de las diferentes muestras, dividido por el objetivo de proporción de referencia del calibrador. La curva estándar generada previamente por un miRNA particular y limpieza de genes se utiliza como patrón de referencia para la extrapolación de los datos cuantitativos de los genes miARN objetivos de concentraciones desconocidas. </li><li> Tres repeticiones de muestras son analizadas como un grupo y las concentraciones medias y desviaciones estándar de la triplicado, se calcula. Si uno de los triplicados es incompatible con el resto del conjunto, se excluyó por el programa. </li></ol> 7. Los resultados representativos &lt;clase p = &quot;jove_content&quot;&gt; Un ejemplo de qPCR análisis sobre muestras de próstata se muestra en la Figura 3. Los resultados se representan numéricamente, así como gráficamente. Los gráficos que muestran los niveles de expresión del gen de referencia, U6, comenzar la amplificación exponencial a aproximadamente ciclo 20, mientras que la expresión del gen diana, MIR-98, mostró una amplificación retraso aproximadamente en el ciclo 25. Los datos de este experimento se exporta como archivo de texto y analizadas por el software de análisis RelQuant. Las posiciones de los capilares que contienen el calibrador y las muestras se especifican. Figura 4 ilustra cómo el calibrador está dispuesto a ser 1, y la expresión de otras muestras relativas al calibrador. <img src="/files/ftp_upload/3874/3874fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Varios pasos en miScript transcripción inversa y PCR en tiempo real. <img src="/files/ftp_upload/3874/3874fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Una curva estándar se genera mediante una serie de diluciones de dos veces, 10 veces, 50 veces, 250-veces, y 1250-pliegue del cDNA muestra original. <img src="/files/ftp_upload/3874/3874fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Roche Molecular bioquímicos LightCycler Software muestra la información completa de la experiencia gráfica y de texto. Cuantitativa en tiempo real las parcelas de amplificación de PCR muestran un aumento en la fluorescencia de las muestras diferentes. <img src="/files/ftp_upload/3874/3874fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Datos de la Figura 4. Se cuantificaron utilizando el software de análisis de RelQuant LightCycler. Por lo general, tres réplicas de las muestras se analizan como un grupo y las muestras que producen resultados claramente inconsistentes son excluidos y las concentraciones medias y desviaciones estándar de la triplicado, se calcula.

<ol><li>Reinhart, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in plants.</a> Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).</li>
<li>Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+microRNA+Mir-14+suppresses+cell+death+and+is+required+for+normal+fat+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism.</a> Curr. Biol. 13, 790(2003).</li>
<li>Bueno, M. J., Perez, deC. astro, I,, Malumbres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+proliferation+pathways+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Control of cell proliferation pathways by microRNAs.</a> Cell Cycle. 7, 3143-3143 (2008).</li>
<li>Friedman, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92(2009).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-281 (2004).</li>
<li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+microRNA+dysregulation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 704(2009).</li>
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<li>Gordanpour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-221+Is+down-regulated+in+TMPRSS2%3AERG+fusion-positive+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">miR-221 Is down-regulated in TMPRSS2:ERG fusion-positive prostate cancer.</a> Anticancer Res. 31, 403-403 (2011).</li>
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<li>Ambs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+profiling+of+microRNA+and+messenger+RNA+reveals+deregulated+microRNA+expression+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer.</a> Cancer Res. 68, 6162(2008).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+miR-34a+inhibits+prostate+cancer+stem+cells+and+metastasis+by+directly+repressing+CD44%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44.</a> Nat. Med. 17, 211(2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Expresiones aberrantes de algunos miRNAs han sido encontrados en los tumores de próstata en comparación con el tejido normal de 10, y algunos de estos miRNAs han sido mencionados como potenciales nuevos agentes terapéuticos contra el cáncer de próstata 11. Por lo tanto los niveles de expresión de miRNAs aberrantes pueden ser útiles biomarcadores de diagnóstico y / o pronóstico. La metodología qPCR en tiempo real se presenta aquí proporciona un ensayo para la cuantificación exacta de los niveles de ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Reactivo TRIzol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596 </td></tr><tr><td> miScript Kit de transcripción reversa </td><td> Qiagen </td><td> 218061 </td></tr><tr><td> Los ensayos miScript Primer </td><td> Qiagen </td><td> Experimento específica </td></tr><tr><td> miScript SYBR Green PCR kit </td><td> Qiagen </td><td> 218073 </td></tr><tr><td> LightCycler 3.5 Real-Time PCR System </td><td> Roche </td><td></td></tr><tr><td> Light Cycler capilares </td><td> Roche </td><td> 04929292001 </td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 espectrofotómetro </td><td> Thermo Scientific </td><td> 2538 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 Bioanalyzer </td><td> G2943CA </td><td></td></tr></tbody></table>

detección de microarn en tumores de próstata por el cuantitativo pcr en tiempo real (qpcr)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

Los microARN (miRNA) son de cadena sencilla, 18-24 nucleótidos de largo, no codificantes moléculas de ARN. Ellos están involucrados en prácticamente todos los procesos celulares incluyendo el desarrollo de 1, 2 la apoptosis y la regulación del ciclo celular 3. MiRNAs se estima que regulan la expresión de 30% a 90% de los genes humanos 4 mediante la unión a sus ARNs diana mensajero (ARNm) 5. La desregulación generalizada de los miRNAs se ha informado en diversas enfermedades y subtipos de cáncer 6. Debido a su prevalencia y la estructura única, estas pequeñas moléculas tienden a ser la próxima generación de biomarcadores, agentes terapéuticos y / o objetivos. Los métodos utilizados para investigar la expresión de miRNA son SYBR Green I con base de tinte, así como Taqman-qPCR basado en la sonda. Si los miRNAs se utiliza con eficacia en el ámbito clínico, es imprescindible que su detección en muestras clínicas frescas y / o archivados ser exacto, reproducible, y specific. qPCR ha sido ampliamente utilizado para la validación de expresión de miRNAs en los análisis de todo el genoma, tales como estudios de microarrays 7. Las muestras utilizadas en este protocolo fueron de pacientes que se sometieron a prostatectomía radical por cáncer de próstata clínicamente localizado, sin embargo otros tejidos y líneas celulares se pueden sustituir in biopsias de próstata fueron broche de congelados en nitrógeno líquido después de la resección. Las variables clínicas y la información de seguimiento para cada paciente se recogieron para su análisis posterior 8. La cuantificación de los niveles de miRNA en muestras de tumores de próstata. Los pasos principales en el análisis de qPCR de los tumores son: extracción de RNA total, síntesis de ADNc, y la detección de productos específicos qPCR utilizando miRNA-cebadores. El ARN total, que incluye mRNA, Mirna, y otros pequeños RNAs fueron extraídos de las muestras con el reactivo TRIzol. Sistema de Qiagen miScript fue utilizado para sintetizar cDNA y realizar qPCR (Figura 1). MiRNAs endógenos no son polyadenylated, tanto durante el proceso de transcripción inversa, un poli (A) polimerasa polyadenylates el miARN. El miARN se utiliza como una plantilla para sintetizar cDNA utilizando oligo-dT y la transcriptasa inversa. Una secuencia de etiqueta universal en el extremo 5 &#39;de los cebadores de oligo-dT facilita la amplificación de cDNA en el paso de PCR. Amplificación por PCR producto es detectado por el nivel de fluorescencia emitida por SYBR Green, un colorante que se intercala en el ADN de doble cadena. Cebadores específicos miARN, junto con una imprimación universal que se une a la secuencia de etiqueta universal amplificar secuencias específicas miARN. Los ensayos Primer miScript están disponibles para más de un millar de miRNAs específicos de los humanos, y cientos de ratón específicos de miRNAs. Método de cuantificación relativa se utiliza aquí para cuantificar la expresión de miRNAs. Para corregir la variabilidad entre las diferentes muestras, los niveles de expresión de un miARN objetivo se normaliza a los niveles de expresión de un gen de referencia. La elección de un GEne en que para normalizar la expresión de los objetivos es crítico en el método de cuantificación relativa de análisis. Ejemplos de genes de referencia típicamente utilizados en esta capacidad son la RNU6B ARN pequeño, RNU44, y RNU48 ya que se consideran para ser expresado de forma estable en la mayoría de las muestras. En este protocolo, RNU6B se utiliza como el gen de referencia.

Cuantitativa de la polimerasa en tiempo real de reacción en cadena (PCR cuantitativa) es un método rápido y sensible para investigar los niveles de expresión de microARN (miRNA varias) moléculas en las muestras tumorales. El uso de este método de expresión de cientos de moléculas de diferentes miARN puede ser amplificada, cuantificado y analizado desde la misma plantilla de cDNA.

Detección de microARN en tumores de próstata por el cuantitativo PCR en tiempo real (qPCR)

Los microARN (miARN) son moléculas de ARN no codificantes, de cadena sencilla y con una longitud de 18 a 24 nucleótidos. Participan en prácticamente todos los procesos celulares...

El objetivo general del siguiente experimento es cuantificar los niveles de expresión de moléculas de microARN en tejido prostático normal y en cáncer de próstata mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Esto se logra primero extrayendo ARN total de tejidos prostáticos. Eso incluye microARN y otros ARN pequeños.A continuación, el ARN se transcribe inversamente para generar ADNc. Luego, se realiza una PCR en tiempo real con colorante cyber green utilizando el ADNc como molde para amplificar y cuantificar la expresión de microARNs en tiempo real. Se obtienen resultados que muestran la expresión relativa de microARNs en diversas muestras de próstata basados en PCR cuantitativa en tiempo real.La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos es que ofrece una gran sensibilidad, precisión, reproducibilidad, y además es rápida y rentable. Este método puede utilizarse para responder preguntas clave en el campo de la biología del cáncer, ya que la expresión de microARNs a menudo se correlaciona con genes que participan intensamente en el proceso del cáncer. Por lo tanto, podemos usar la PCR cuantitativa para evaluar la expresión de microARNs y observar cómo se correlaciona con variables clínicas.Estos biomarcadores podrían utilizarse potencialmente como herramientas tanto diagnósticas como pronósticas. Podrían ayudarnos a diagnosticar el cáncer de próstata, así como a determinar qué cánceres de próstata son agresivos. Además, existe la posibilidad de que estos biomarcadores actúen como agentes terapéuticos.Este método no solo puede aportar información sobre la génesis del tumor de próstata, sino que también podría aplicarse a otros tipos de cáncer y enfermedades. Recolecte muestras de próstata en el momento de la ectomía y oriente el espécimen utilizando referencias anatómicas. Pinte la próstata y las vesículas seminales de la siguiente manera: lado derecho de color verde, lado izquierdo de color azul.Tome una sección transversal media aleatoria del tejido perpendicular a la superficie rectal, congele la muestra y almacénela a menos 80 grados Celsius. Tome una fotocopia y oriente las secciones de los especímenes, dividiéndolas en cuatro partes iguales. Consulte con un patólogo para determinar las áreas tumorales frente a las normales en la imagen correspondiente.Utilice las áreas marcadas como guía para identificar el tejido tumoral con el fin de extraer ARN para aislar ARN. Comience colocando muestras de próstata congeladas sobre hielo seco y consulte la fotocopia delimitada. Corte una pequeña porción del tumor de próstata.Homogenice el tejido tumoral de próstata en un mililitro de reactivo triol. Incube las muestras homogenizadas durante cinco minutos. A temperatura ambiente, añada 0,2 mililitros de cloroformo a las muestras y agite vigorosamente durante 15 segundos.Incube las muestras durante tres minutos a temperatura ambiente, luego centrifugue a 12.000 ×g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Transfiera la fase acuosa superior incolora a tubos nuevos y agregue 0,5 mililitros de alcohol isopropílico. Incube las muestras durante 10 minutos a temperatura ambiente, luego centrifugue a 12.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.Aspire cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el precipitado que contiene el ARN. Añada un mililitro de etanol al 75 % al precipitado de ARN, vortexee la muestra y sedimente mediante centrifugación durante cinco minutos a 7 500 × g a cuatro grados Celsius. Nuevamente, aspire el SNAT y seque el precipitado de ARN durante cinco a diez minutos, asegurándose de que no quede completamente seco.Rojo, disuelva el precipitado en agua libre de nucleasas y utilice un espectrofotómetro para medir la concentración del ARN. Utilice un bioanalizador para verificar la calidad e integridad de las muestras de ARN. Transcriba inversamente el ARN a ADNc utilizando un kit de transcripción inversa según las instrucciones del fabricante.Para generar una curva estándar, prepare una serie de diluciones del ADN original a partir de una muestra que se sabe que tiene una expresión considerable del gen de interés. Realice PCR en tiempo real preparando una mezcla maestra basada en un volumen de reacción de 20 microlitros de quant dos x. Detecte la mezcla maestra de PCR con verde cyber, cebador universal microscript 10 x, ensayo de cebador microscript 10 x y agua libre de ARN.Incluya dos conjuntos de cebadores, uno para el gen diana y otro para el gen de referencia, en este caso RNU6B. Pipete dos microlitros de cada dilución de ADNc en tubos capilares individuales para el termociclador ligero y agregue 18 microlitros de la mezcla maestra. Utilice un adaptador capilar para centrifugar. Coloque los capilares en un termociclador en tiempo real basado en capilares y ejecute el programa de PCR de la siguiente manera: 95 grados Celsius durante 15 minutos, seguido de 50 ciclos de 94 grados Celsius durante 15 segundos.55 grados Celsius durante 30 segundos y 70 grados Celsius durante 30 segundos. Seleccione una muestra como calibrador y establezca su cantidad normalizada del objetivo en uno. Compare la expresión relativa del microARN en todas las demás muestras con respecto al calibrador para generar curvas de amplificación.Para las reacciones de PCR, utilice el software Molecular Biochemicals Light Cycler versión 3.5 en la pestaña de cuantificación. Cuantifique las reacciones y exporte los datos a un archivo de texto. Importe los datos al software de análisis REL Quant para generar los resultados de cuantificación.Importe archivos separados para el gen diana, el gen de referencia y los datos de la curva estándar. Especifique la posición del calibrador tanto para el gen diana como para el gen de referencia, así como las posiciones de las muestras. Los datos se expresan como la relación del diana respecto al de referencia de diferentes muestras dividida por la relación del diana respecto al de referencia del calibrador.Utilice la curva estándar generada previamente para un microARN y un gen de referencia particulares como patrón de referencia para extrapolar datos cuantitativos de microARN. Objetivos de concentraciones desconocidas. Analice tres muestras como un grupo y calcule las concentraciones medias y las desviaciones estándar de las réplicas triplicadas.Si uno de los tres replicados es inconsistente con el resto del conjunto, el programa lo excluirá. Aquí se muestra un ejemplo del análisis A-Q-P-C-R de muestras de próstata. Las gráficas muestran que los niveles de expresión del gen de referencia U seis comienzan la amplificación exponencial alrededor del ciclo 20, mientras que la expresión del gen diana, MIR 98, mostró una amplificación retardada alrededor del ciclo 25.Los datos de este experimento se exportaron como un archivo de texto y se analizaron mediante el software de análisis requ, especificando las posiciones de los capilares que contienen el calibrador y las muestras. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un día si se lleva a cabo correctamente. La fiabilidad de esta técnica depende de la calidad del ARN.Por lo tanto, es importante tener un cuidado adicional al manipular el ARN porque puede degradarse muy fácilmente.

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Vamos a demostrar la configuración y el análisis de pre-microRNA-96 y las matrices de QPCR utilizando un robot, así como con la mano con una pipeta de Thermo Scientific multicanal Matrix.

Perfiles de Pre-micro ARN y microRNAs utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) Arrays

A continuación se describe un reverso transcriptasa optimizado multiplex PCR cuantitativa (QRT-PCR) en combinación con el protocolo de una plataforma de microfluidos como un costo y el tiempo efectivo instrumento de cribado de alto rendimiento para los microRNA (miRNA) los niveles de expresión, especialmente cuando se trabaja con cantidades limitadas de muestras.

Perfiles de microARN de alto rendimiento: Multiplex Optimizado QRT-PCR en la escala de nanolitros de la IFC Fluidigm dinámica ArrayTM

Se describe un protocolo de PCR en tiempo real para perfilar microRNAs en el líquido cefalorraquídeo (LCR). Con la excepción de los protocolos de extracción de ARN, el procedimiento se puede extender a ARN extraído de otros fluidos corporales, células cultivadas o muestras de tejido.

Líquido cefalorraquídeo MicroRNA perfiles utilizando cuantitativa en tiempo real PCR

Molecular señalización a través de estrógeno y microRNAs son fundamentales en el desarrollo y el crecimiento del cáncer de mama. El estrógeno activa los receptores de estrógeno, que son factores de transcripción. Muchos factores de transcripción pueden regular la expresión de microRNAs, y microARN regulados por estrógenos se puede perfilar el uso de diferentes técnicas a gran escala.

Perfiles de microARN regulados por estrógeno en las células del cáncer de mama

MicroRNAs circulantes han surgido recientemente como biomarcadores prometedores y novedosos para varios tipos de cáncer y otras enfermedades. El objetivo de este artículo es discutir tres plataformas basados ​​en sondas diferentes en tiempo real PCR y métodos que están disponibles para cuantificar y determinar la abundancia de microRNAs en circulación.

PCR en tiempo real basada en sondeos Enfoques para la medición cuantitativa de microRNAs

Aquí describimos un protocolo simplificado para análisis de expresión de microARN (miARN) en tejidos clínicos archivados de cáncer de próstata (PCa) fijados en formol, incluidos en parafina (FFPE) o congelados frescos que emplean PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR) e hibridación in situ (ISH).

Los análisis de expresión de miRNA en tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata

El objetivo de este protocolo es utilizar la microdisección de captura láser como un método eficaz para aislar poblaciones puras de tipos celulares de tejidos prostáticos heterogéneos para el análisis de ARN posterior.

Laser-captura microdisección de Human Prostática epitelio de Análisis de ARN

Aquí presentamos un protocolo para la detección de la expresión de microRNA en la membrana peritoneal de rata mediante la cuantitativa de reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa en tiempo real. Este método es adecuado para estudiar el perfil de expresión de microARN en la membrana peritoneal de rata en varias condiciones patológicas.

Detección de la expresión de microARN en la membrana peritoneal de ratas mediante PCR cuantitativa en tiempo real

Este informe describe un protocolo para la medición de los niveles absolutos de miRNA plasma, mediante la transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR con o sin la amplificación. Este protocolo permite la mejor comprensión de la cantidad de plasma miRNAs y permite la evaluación cualitativa de los correspondientes datos de diferentes estudios o laboratorios.

Cuantificación absoluta de Plasma niveles de microARN en monos cangrejeros, mediante transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR

La resistencia a la terapia a menudo se desarrolla en pacientes con cáncer de próstata avanzado, y en algunos casos, el cáncer progresa a un subtipo letal llamado cáncer de próstata neuroendocrino. Evaluar los pequeños cambios moleculares no codificantes mediados por ARN que facilitan esta transición permitiría una mejor estratificación de enfermedades e identificación de mecanismos causales que conducen al desarrollo de cáncer de próstata neuroendocrino.

Secuenciación de ARN pequeño no codificante de tejidos fijos de formalina y exosomas derivados del suero de pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración

El protocolo describe un ensayo de hibridación de inmunofluorescencia en tándem con tejido fijado en formol e incluido en parafina para detectar y cuantificar microARN y proteínas multiplexadas simultáneamente.

Amplificación y reconocimiento de microARN a través de la hibridación in situ de ácido nucleico bloqueado como un nuevo método de detección y cuantificación

Aprende a detectar microARN en tumores de próstata mediante qPCR cuantitativo en tiempo real. Este método permite cuantificar biomarcadores moleculares con alta sensibilidad para investigación oncológica.

Detección de microARN en tumores de próstata por el cuantitativo PCR en tiempo real (qPCR)

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