Detección de microARN en tumores de próstata por el cuantitativo PCR en tiempo real (qPCR)

El objetivo general del siguiente experimento es cuantificar los niveles de expresión de moléculas de microARN en tejido prostático normal y en cáncer de próstata mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Esto se logra primero extrayendo ARN total de tejidos prostáticos. Eso incluye microARN y otros ARN pequeños.

A continuación, el ARN se transcribe inversamente para generar ADNc. Luego, se realiza una PCR en tiempo real con colorante cyber green utilizando el ADNc como molde para amplificar y cuantificar la expresión de microARNs en tiempo real. Se obtienen resultados que muestran la expresión relativa de microARNs en diversas muestras de próstata basados en PCR cuantitativa en tiempo real.

La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos es que ofrece una gran sensibilidad, precisión, reproducibilidad, y además es rápida y rentable. Este método puede utilizarse para responder preguntas clave en el campo de la biología del cáncer, ya que la expresión de microARNs a menudo se correlaciona con genes que participan intensamente en el proceso del cáncer. Por lo tanto, podemos usar la PCR cuantitativa para evaluar la expresión de microARNs y observar cómo se correlaciona con variables clínicas.

Estos biomarcadores podrían utilizarse potencialmente como herramientas tanto diagnósticas como pronósticas. Podrían ayudarnos a diagnosticar el cáncer de próstata, así como a determinar qué cánceres de próstata son agresivos. Además, existe la posibilidad de que estos biomarcadores actúen como agentes terapéuticos.

Este método no solo puede aportar información sobre la génesis del tumor de próstata, sino que también podría aplicarse a otros tipos de cáncer y enfermedades. Recolecte muestras de próstata en el momento de la ectomía y oriente el espécimen utilizando referencias anatómicas. Pinte la próstata y las vesículas seminales de la siguiente manera: lado derecho de color verde, lado izquierdo de color azul.

Tome una sección transversal media aleatoria del tejido perpendicular a la superficie rectal, congele la muestra y almacénela a menos 80 grados Celsius. Tome una fotocopia y oriente las secciones de los especímenes, dividiéndolas en cuatro partes iguales. Consulte con un patólogo para determinar las áreas tumorales frente a las normales en la imagen correspondiente.

Utilice las áreas marcadas como guía para identificar el tejido tumoral con el fin de extraer ARN para aislar ARN. Comience colocando muestras de próstata congeladas sobre hielo seco y consulte la fotocopia delimitada. Corte una pequeña porción del tumor de próstata.

Homogenice el tejido tumoral de próstata en un mililitro de reactivo triol. Incube las muestras homogenizadas durante cinco minutos. A temperatura ambiente, añada 0,2 mililitros de cloroformo a las muestras y agite vigorosamente durante 15 segundos.

Incube las muestras durante tres minutos a temperatura ambiente, luego centrifugue a 12.000 ×g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Transfiera la fase acuosa superior incolora a tubos nuevos y agregue 0,5 mililitros de alcohol isopropílico. Incube las muestras durante 10 minutos a temperatura ambiente, luego centrifugue a 12.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.

Aspire cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el precipitado que contiene el ARN. Añada un mililitro de etanol al 75 % al precipitado de ARN, vortexee la muestra y sedimente mediante centrifugación durante cinco minutos a 7 500 × g a cuatro grados Celsius. Nuevamente, aspire el SNAT y seque el precipitado de ARN durante cinco a diez minutos, asegurándose de que no quede completamente seco.

Rojo, disuelva el precipitado en agua libre de nucleasas y utilice un espectrofotómetro para medir la concentración del ARN. Utilice un bioanalizador para verificar la calidad e integridad de las muestras de ARN. Transcriba inversamente el ARN a ADNc utilizando un kit de transcripción inversa según las instrucciones del fabricante.

Para generar una curva estándar, prepare una serie de diluciones del ADN original a partir de una muestra que se sabe que tiene una expresión considerable del gen de interés. Realice PCR en tiempo real preparando una mezcla maestra basada en un volumen de reacción de 20 microlitros de quant dos x. Detecte la mezcla maestra de PCR con verde cyber, cebador universal microscript 10 x, ensayo de cebador microscript 10 x y agua libre de ARN.

Incluya dos conjuntos de cebadores, uno para el gen diana y otro para el gen de referencia, en este caso RNU6B. Pipete dos microlitros de cada dilución de ADNc en tubos capilares individuales para el termociclador ligero y agregue 18 microlitros de la mezcla maestra. Utilice un adaptador capilar para centrifugar. Coloque los capilares en un termociclador en tiempo real basado en capilares y ejecute el programa de PCR de la siguiente manera: 95 grados Celsius durante 15 minutos, seguido de 50 ciclos de 94 grados Celsius durante 15 segundos.

55 grados Celsius durante 30 segundos y 70 grados Celsius durante 30 segundos. Seleccione una muestra como calibrador y establezca su cantidad normalizada del objetivo en uno. Compare la expresión relativa del microARN en todas las demás muestras con respecto al calibrador para generar curvas de amplificación.

Para las reacciones de PCR, utilice el software Molecular Biochemicals Light Cycler versión 3.5 en la pestaña de cuantificación. Cuantifique las reacciones y exporte los datos a un archivo de texto. Importe los datos al software de análisis REL Quant para generar los resultados de cuantificación.

Importe archivos separados para el gen diana, el gen de referencia y los datos de la curva estándar. Especifique la posición del calibrador tanto para el gen diana como para el gen de referencia, así como las posiciones de las muestras. Los datos se expresan como la relación del diana respecto al de referencia de diferentes muestras dividida por la relación del diana respecto al de referencia del calibrador.

Utilice la curva estándar generada previamente para un microARN y un gen de referencia particulares como patrón de referencia para extrapolar datos cuantitativos de microARN. Objetivos de concentraciones desconocidas. Analice tres muestras como un grupo y calcule las concentraciones medias y las desviaciones estándar de las réplicas triplicadas.

Si uno de los tres replicados es inconsistente con el resto del conjunto, el programa lo excluirá. Aquí se muestra un ejemplo del análisis A-Q-P-C-R de muestras de próstata. Las gráficas muestran que los niveles de expresión del gen de referencia U seis comienzan la amplificación exponencial alrededor del ciclo 20, mientras que la expresión del gen diana, MIR 98, mostró una amplificación retardada alrededor del ciclo 25.

Los datos de este experimento se exportaron como un archivo de texto y se analizaron mediante el software de análisis requ, especificando las posiciones de los capilares que contienen el calibrador y las muestras. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un día si se lleva a cabo correctamente. La fiabilidad de esta técnica depende de la calidad del ARN.

Por lo tanto, es importante tener un cuidado adicional al manipular el ARN porque puede degradarse muy fácilmente.