Preparación de células mieloides supresoras derivadas (MDSC) de ingenuo y de páncreas ratones portadores del tumor mediante citometría de flujo magnético y automatizado de células activadas clasificación (AutoMACS)

El objetivo general del siguiente experimento es generar rápidamente una población enriquecida de leucocitos positivos para GR1 que contengan células supresoras derivadas de la línea mieloide viables, o M DSCs, a partir de bazo de ratón, para su uso en ensayos in vivo e in vitro. Primero, se reúnen bazo de varios ratones y se procesan para obtener una suspensión simple de células. Para cuantificar el porcentaje de M DSCs antes del enriquecimiento, se transfiere una pequeña alícuota de las células agrupadas a una placa de 96 pocillos con fondo en V.

Los antígenos de superficie MAC uno y GR uno se marcan y las células marcadas se transfieren a tubos FACS para el análisis citométrico de flujo. Los leucocitos restantes se tiñen con un anticuerpo conjugado con fluorocromo contra GR uno y se incuban con microperlas magnéticas, que se unen al fluorocromo en el anticuerpo anti GR uno. Las poblaciones GR uno positivas y GR uno negativas se separan luego utilizando un separador AutoMax pro para evaluar el éxito del enriquecimiento de GR uno en la población.

Se toma una pequeña alícuota y se analiza la expresión de GR uno y MAC uno para evaluar los porcentajes de MDSC. La comparación de los datos resultantes de inmunofenotipado demuestra un aumento en los porcentajes de MDSC en la población de leucocitos enriquecida en GR uno en comparación con la población no enriquecida. Además, hay un aumento en MDSC naïve, obteniendo una población comparable a la de MDSC de animales con tumor.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la tinción convencional por flujo y la clasificación mediante citometría de flujo de alta velocidad de M DSCs a partir de tejidos linfoides, es que nuestra técnica de mezcla maestra evita variaciones significativas en nuestros resultados al garantizar una tinción superficial uniforme de los leucocitos en pool, así como la tipificación previa y la clasificación automática de m DSCs y células positivas para GR uno, respectivamente. Las personas que demostrarán los procedimientos serán Nadine Nelson, estudiante de posgrado de nuestro laboratorio, y el Dr. Haw sra, director del servicio central de citometría de flujo de USF. El siguiente procedimiento debe realizarse en un entorno estéril bajo una campana de seguridad biológica, manteniendo las células y los anticuerpos sobre hielo.

Siempre que sea posible, arme el tamiz para disociación celular insertando la malla en la abertura del recipiente hacia la parte inferior. Luego inserte el anillo de retención en el área roscada con el lado ranurado hacia arriba y utilice la llave del anillo para apretar el anillo de retención y asegurar así la malla. Coloque el tamiz armado en una placa de Petri que contenga 10 mililitros de un baño de PBS 1X.

Bazos obtenidos de ratones C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad, portadores de tumor o controles ingenuos, y colóquelos en la malla del tamiz para disociación celular. Luego, utilice un pistilo de vidrio para moler los bazos a través de la malla hacia la placa de Petri. Repita este proceso para cada grupo de tratamiento de ratones.

A continuación, utilizando una pipeta serológica de cinco mililitros, aplique la suspensión celular a un filtro celular de 70 micrones y permita que filtre hacia un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugue a 250-300 ×g durante cinco minutos. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y resuspenda el sedimento añadiendo cinco mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos por bazo y pipeteando vigorosamente hacia arriba y hacia abajo. Incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. Tras la incubación, detenga la reacción añadiendo 20 mililitros de PBS y pipeteando vigorosamente hacia arriba y hacia abajo.

Luego, centrifugue a 250-300 × g durante cinco minutos; después de eliminar el sobrenadante, suspenda el botón en 20 mililitros de PBS estéril y cuente las células. Utilizando azul de tripano y un hemocitómetro, suspenda nuevamente las células a una concentración de 1 × 10⁷ a 2 × 10⁷ células por mililitro en medio de tinción al 3 %. Lograr una tinción óptima es el aspecto más difícil de este procedimiento.

Esto puede realizarse con éxito mediante la titulación previa de anticuerpos. Utilice la preparación de mezclas maestras y la tinción de superficie en pequeños volúmenes, tal como se describe en este protocolo. Para teñir las células para análisis citométrico de flujo, etiquete los pocillos de una placa de 96 pocillos vbo para muestras de control, muestras experimentales y tinciones individuales.

Para los controles de compensación, agregue cinco veces 10 a la quinta hasta un millón de células en 50 microlitros a cada uno de los pocillos etiquetados. Luego, centrifugue la placa a 250-300 ×g durante cinco minutos tras la centrifugación. Observe la placa desde abajo.

Mirando hacia arriba para asegurarse de que los pellets están presentes en los pocillos, prepare una mezcla maestra del bloqueador BDFC de ratón que contenga el anticuerpo monoclonal de rata anti-CD1632 de ratón diluido en medio de tinción al 3 % en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros sobre hielo con vortex. Luego, centrifugue brevemente durante cinco segundos sosteniendo la placa de fondo en V de 96 pocillos sobre un recipiente de desecho o fregadero. Invierta rápidamente la placa y vuelva a colocarla en posición para eliminar el sobrenadante sin alterar los pellets celulares.

Luego, agregue 50 microlitros de la mezcla maestra de bloqueo de FC a todos los precipitados en la placa de fondo en V de 96 pocillos, mezclando suavemente mediante pipeteo repetido hacia arriba y hacia abajo. Coloque la placa sobre hielo e incúbele durante 15 minutos a oscuras. Centrifugue la placa a 250-300 × g durante cinco minutos. Prepare una mezcla maestra de anticuerpos Mac uno fitzy y GR uno A PC diluidos en medio de tinción al 3% en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros sobre hielo.

Vortexe brevemente y centrifugue durante cinco segundos. Después de la centrifugación, invierta la placa para eliminar el sobrenadante de cada pocillo y luego agregue 50 microlitros de la mezcla de anticuerpos a los pellet de control o experimentales. Mezcle bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Para las compensaciones de tinción simple, agregue 50 microlitros de MAC uno F GR uno A PC o DPI diluido en medio de tinción al 3% a los pocillos correspondientes. Para el control sin tinción, agregue 50 microlitros de medio de tinción al 3% al pocillo correspondiente y mezcle.

Luego, incubar la placa durante 30 minutos a oscuras sobre hielo. Durante la incubación, etiquetar tubos FACS para que correspondan a cada pocillo de la placa y agregar 200 µL de medio de tinción al 3% a cada tubo FACS. Una vez transcurrido el tiempo de incubación de 30 minutos, centrifugar la placa a 250-300 ×g durante cinco minutos.

Después de la centrifugación, elimine los sobrenadantes como antes. Luego, lave los sedimentos agregando 100 microlitros de medio de tinción al 3% a cada sedimento. Mezcle bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.

Centrifugar la placa nuevamente durante cinco minutos. Repetir, lavar, dar un paso más tras la centrifugación, eliminar el sobrenadante como antes y resuspender cada pellet en 100 microlitros de medio de tinción al 3 % y mezclar bien. A continuación, transferir 100 microlitros de las células resuspendidas de cada pocillo de la placa a los tubos FACS respectivamente etiquetados.

Luego, agregue 75 nanogramos por mililitro de DPI a las muestras de control y experimentales y al control de compensación de tinción simple de DPI. Adquiera los datos de citometría para determinar los porcentajes de MDSC según se describe en el documento adjunto. A continuación, enriquezca el alícuota de leucocitos positivos para GR1; transfiera una vez 10 a la séptima de los leucocitos restantes sin teñir a tubos de centrífuga adecuadamente etiquetados y centrifugue a 250-300 veces G durante cinco minutos. Agregue 50 microlitros de una dilución 1:10 del anticuerpo GR1 conjugado con PE en tampón Max e incube durante 15 minutos a cuatro grados Celsius en la oscuridad.

Tras la incubación, agregue dos mililitros de tampón máx a cada tubo fax y centrifugue a 250-300 ×g durante cinco minutos. Tras la centrifugación, deseche el sobrenadante. Luego, agregue 200 microlitros de una dilución uno a cuatro de microesferas anti-PE en tampón máx a cada tubo e incube durante 15 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad.

Agregue dos mililitros de tampón max a los tubos fax y centrifugue a 250-300 ×g durante cinco minutos. Luego, resuspenda el precipitado en tres mililitros de tampón de tinción y filtre a través de un tamiz de 70 micrones en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros etiquetado. En este protocolo, estamos utilizando separación magnética automática.

La separación magnética es una excelente opción de métodos. Si necesita separar un gran número de células de forma rápida y rentable, y basándose en un marcador de superficie, asegúrese de verificar sus resultados al final mediante citometría de flujo. Para preparar y cebear el separador AutoMax pro, asegúrese de que todas las botellas estén llenas con las soluciones adecuadas.

Encienda el instrumento. Luego, tras la inicialización, examine el estado de los contenedores de fluidos y las columnas. Todos los símbolos deben ser verdes.

A continuación, en el menú, seleccione separación en la barra de menú superior seguido de lavado. Ahora, desde la barra de menú inferior, seleccione enjuagar en la opción emergente seguido de ejecutar para iniciar el proceso de cebado. Una vez que el proceso de cebado se haya completado con éxito, el instrumento mostrará que está listo para la separación.

Bajo el menú de estado, coloque el tubo cónico de 50 mililitros con células marcadas magnéticamente en la fila A de una gradilla para tubos enfriada de tamaño adecuado. Luego, coloque un tubo cónico de 50 mililitros para la recolección de la fracción negativa en la fila B y un tubo cónico de 15 mililitros para la recolección de la fracción positiva en la fila C. Seleccione el programa de separación de células POS S para la selección positiva de las células diana marcadas en modo sensible a partir de las muestras. Cuando comience el programa, las células diana marcadas magnéticamente se retendrán en la columna AutoMax, mientras que las células no marcadas se liberarán al tubo de recolección de la fracción negativa en la fila B. A continuación, se retirará el imán y las células diana marcadas se liberarán al tubo de recolección positiva en la fila C de la gradilla.

Después del enriquecimiento, utilice azul de trian y un hemocitómetro para volver a contar las fracciones GR uno positivas y GR uno negativas. Luego, resuspenda las células a una concentración de uno por 10 elevado a siete células por mililitro a dos por 10 elevado a siete células por mililitro en medio de tinción al 3% y transfiera 50 microlitros a tubos de ensayo etiquetados correspondientemente. Tiña las células con MAC uno y con el marcador de viabilidad DPI para citometría de flujo y compensaciones de tinción individual.

Realice la adquisición de datos mediante citometría de flujo para determinar los porcentajes de GR1 positivo y GR1 negativo y también para comparar los porcentajes de MDSC antes y después del AutoMax y del enriquecimiento. Se obtuvieron bazo de ratones con tumores pancreáticos y ratones no expuestos, y se procesaron en suspensiones de células individuales como se describe en este artículo de video. Se realizó citometría de flu游戏副本

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, incluyendo MDSC acelerada, clasificación mediante citometría de flujo, experimentos de transferencia adoptiva in vivo, PCR cuantitativa en tiempo real y western blot, para responder preguntas adicionales sobre los mecanismos moleculares responsables de la expansión, migración y diferenciación de MDSC, así como de su supresión de las respuestas inmunitarias.