Síntesis combinatoria y de alto rendimiento liberación de proteínas de película de polímero y nanopartículas Bibliotecas

Este video describe la síntesis combinatoria de bibliotecas de películas de polianhídrido biodegradable y nanopartículas, y la detección de alto rendimiento de la liberación de proteínas de estas bibliotecas. En primer lugar, se utilizaron aparatos de deposición automatizados de alto rendimiento para depositar una gama de monómeros de composición diversa en cubetas de vidrio. Se lleva a cabo una reacción de policondensación a 180 grados centígrados y 0,3 tor durante 1,5 horas.

Estas condiciones de reacción son específicas para la síntesis de polímeros de polianhídrido C-P-H-S-A. Utilizando el aparato de deposición automatizado, el disolvente y cualquier componente para la encapsulación se depositan en las cubetas que contienen la biblioteca de polímeros. La sonicación se puede administrar para asegurar la disolución completa del polímero y la dispersión uniforme de los componentes adicionales.

A continuación, el polímero disuelto se transfiere a un tubo de no disolvente para fabricar la biblioteca de nanopartículas mediante nanoprecipitación. Las nanopartículas se recuperan mediante secado al vacío o filtración, y luego se transfieren a una placa modificada de 96 pocillos. Finalmente, la biblioteca cargada de proteínas se incuba en condiciones fisiológicas y la cinética de liberación de proteínas se evalúa utilizando un método de detección de espacio fluorescente.

En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la cinética de liberación de proteínas en función de las propiedades del polímero o de las condiciones ambientales de liberación. La principal ventaja de este enfoque sobre otras técnicas convencionales de una muestra a la vez es que podemos sintetizar varias muestras simultáneamente. A continuación, estas muestras se pueden cribar en un alto rendimiento para detectar interacciones entre proteínas, polímeros, células o polímeros huésped.

Esto acelera el diseño racional y el desarrollo de estos biomateriales para la administración de fármacos y la ingeniería de tejidos. La demostración del procedimiento estará a cargo de La Tricia Peterson, un postoperatorio de mi laboratorio. En esta sección del vídeo, se utiliza un aparato de deposición de rendimiento de Hyatt para depositar una biblioteca de monómeros con variantes en la composición después de la síntesis de polímeros.

Este aparato se utiliza para fabricar una biblioteca combinatoria de películas de polímeros en blanco o cargadas de proteínas o nanopartículas. La plataforma automatizada consta de dos bombas de jeringa programables y tres actuadores lineales conectados en serie a un ordenador en el ordenador. El software LabVIEW se utiliza para dirigir comandos a las bombas de jeringa y actuadores.

Las jeringas herméticas de 10 cc se cargan en las bombas de jeringa con tubos capilares metálicos conectados a través de accesorios de bloqueo de señuelo, que dispensan las soluciones de polímero en cubetas de vidrio. En esta demostración, se utilizará ácido séico o SA con un seis Biss para oxy heane o CPH para hacer una biblioteca de nanopartículas que encapsulan la albúmina sérica de Texas Red Boan. Las instrucciones de este vídeo y los documentos que lo acompañan pueden adaptarse para fabricar y probar una amplia gama de bibliotecas de películas poliméricas y nanopartículas.

Para sintetizar las bibliotecas, comience por disolver cada monómero y cloroformo a una concentración final de 25 miligramos por mililitro en un frasco de vidrio. A continuación, cargue cada solución en una jeringa apretada de 10 cc aspirando la solución a través del extremo de bloqueo del señuelo de la jeringa. Retira las burbujas de aire.

A continuación, conecte el tubo capilar de acero inoxidable con cierre de señuelo resistente a los solventes al extremo de la jeringa. Asegure los tubos capilares en abrazaderas, fíjelos a un soporte de anillo. A continuación, coloque el extremo de ambos tubos capilares en la veta de arranque.

Para la deposición de monómeros. Coloque las jeringas en las bombas de jeringa programables y asegúrelas en su posición en el software de vista de laboratorio. Ajuste los actuadores lineales a la posición inicial en el software.

Inicie la deposición automatizada de los monómeros SA y CPH en las cubetas de vidrio de los ejes x, y y Z. Los actuadores colocarán correctamente los tubos capilares en cada Q, vet y bombearán volúmenes programados de cada monómero en ellos, creando una biblioteca de monómeros con variantes de composición. Después de la deposición de monómeros.

Transfiera la biblioteca de monómeros a un horno de vacío precalentado e incube a 180 grados Celsius y 0,3 vueltas durante 1,5 horas para permitir la polimerización por condensación. Después de la incubación, se completa la fabricación de la biblioteca de polímeros. A continuación, se generan nanopartículas poliméricas cargadas de proteínas.

Consulte el protocolo adjunto para la fabricación de bibliotecas de películas de polímeros cargadas de proteínas para fabricar una biblioteca de nanopartículas cargadas de proteínas. Agregue la proteína en este caso, la albúmina sérica de bovino rojo de Texas al solvente apropiado, que debería ser capaz de disolver la biblioteca de polímeros. Aquí, el cloruro de metileno se utiliza en una concentración de dos miligramos por mililitro.

Llene la jeringa de 10 cc con disolvente que contenga Texas Red BSA y colóquela en la primera bomba de jeringa. A continuación, coloque una jeringa limpia y vacía de dos cc en la segunda bomba de jeringa, coloque los tubos que contengan 15 mililitros de un disolvente no s, en este caso, pentano, en el soporte del tubo adyacente a la plataforma del vial. A continuación, en el laboratorio, vea el software para iniciar el proceso automatizado de deposición de disolventes seleccionando el programa.

Tras el inicio del programa, el disolvente se deposita en las cubetas que contienen la biblioteca de polímeros, lo que da como resultado una concentración de polímero de 20 miligramos por mililitro. Cuando se haya depositado todo el solvente, deje que disuelva el polímero durante uno a cinco minutos. A continuación, incluya una sindicación opcional para garantizar una disolución completa del polímero y una dispersión uniforme de las proteínas.

A continuación, inicie el programa de transferencia de muestras en la vista de laboratorio. A continuación, cada muestra de polímero disuelto en la biblioteca se extrae en la jeringa vacía y se dispensa en su tubo correspondiente de no disolvente en el portamuestras. Una vez que se ha transferido cada muestra, se recuperan las nanopartículas cargadas de proteínas colocando la biblioteca de nanopartículas en una cámara de vacío a 10 milímetros de mercurio al vacío, o mediante filtración al vacío hasta que se elimine el solvente.

Para investigar la liberación de BSA encapsulado, comience con una placa de polipropileno de soldadura 96 profunda que se ha modificado eliminando la media pulgada superior de la pared de cada pozo de todas las demás columnas adyacentes en la placa. La eliminación de la parte superior de cada pozo entre las columnas A y B, C y DENF y GNH permite el flujo de líquido entre cada par de pozos adyacentes cuando se llenan hasta la transferencia de volumen completo. Estándares rojos de Texas BSA que van desde 1000 a 10 microgramos por mililitro en la placa de 96 pocillos profundos.

Estos se utilizarán para calcular la cantidad de proteínas y también tendrán en cuenta el enfriamiento del fluorocromo, reconstituirán la masa deseada de nanopartículas en el tampón PBS y luego se sonicarán para dispersar uniformemente las partículas. A continuación, transfiera la biblioteca de nanopartículas a la placa profunda de 96 pocillos y espere hasta que las muestras se hayan asentado en el fondo de la placa de pocillos. A continuación, con una pipeta, llene lentamente todos los pozos adyacentes con tampón PBS hasta un cuarto de pulgada de la parte superior del pozo.

Debe haber suficiente amortiguador en los pozos adyacentes para que fluya libremente entre los pozos. A continuación, selle la placa de liberación con la tapa y colóquela a 37 grados centígrados bajo agitación. Durante la duración del experimento en puntos de tiempo incrementales, utilice un escáner fluorescente de superficie plana Typhoon 9.400 para escanear la placa utilizando los filtros de excitación, láser y emisión adecuados.

Después de la exploración, utilice el software Image Quant para cuantificar la cantidad de proteína conjugada con fluorocromo liberada en cada liberación. Bueno, Texas Red BSA se encapsuló en una biblioteca de nanopartículas poliméricas sintetizadas a partir de monómeros SA y CPH como se describe en este video para determinar la cinética de liberación de proteínas en función de la química de los polímeros. Las nanopartículas cargadas de proteínas se incubaron a 37 grados centígrados durante un mes, durante el cual se obtuvieron escaneos fluorescentes en puntos de tiempo incrementales para la cuantificación de la liberación de proteínas.

Como se muestra aquí, este método de rendimiento hidráulico se utilizó para determinar la cinética de liberación de Texas Red BSA a partir de la biblioteca de nanopartículas de polianhídrido A-C-P-H-S-A. Se observaron tendencias dependientes de la química con tasas crecientes de liberación de los productos químicos de la película de Sarich. Se obtuvieron resultados similares cuando se utilizaron ensayos estándar de cuantificación de proteínas.

En un experimento separado, se evaluó la liberación de Texas Red BSA de las bibliotecas de películas de polianhídrido CPT CPH, como se muestra aquí, se observó una cinética de liberación de orden casi nula con películas ricas en cpeg que liberan la proteína más rápidamente, con aplicaciones potenciales en el campo médico como dispositivos de administración de medicamentos biodegradables. Estos resultados indican que el perfil de liberación deseado de un fármaco terapéutico o antígeno de vacuna puede controlarse cambiando la química del polímero. Siguiendo este procedimiento, se han desarrollado otros métodos combinatorios para investigar áreas como la estabilidad de las proteínas, la toxicidad celular, la activación celular y la biodistribución InVivo.

Estos aspectos son importantes para el diseño racional de biomateriales para la administración de fármacos y la ingeniería de tejidos. No olvide usar el EPP adecuado y practicar procedimientos de laboratorio seguros durante todo este protocolo.