Name: Síntesis combinatoria y de alto rendimiento liberación de proteínas de película de polímero y nanopartículas Bibliotecas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Aprende la síntesis combinatoria de bibliotecas de películas y nanopartículas de polianhídrido biodegradables. Este método de alto rendimiento permite detectar la liberación de proteínas para aplicaciones en liberación controlada de fármacos.

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Los autores agradecen el premio ONR-MURI (NN00014-06-1-1176) y el Ejército de los EE.UU. de Investigación Médica y Material Command (Grant No. W81XWH-10-1-0806) por el apoyo financiero. Este material está basado en trabajo apoyado por la National Science Foundation con la subvención No. 0552584 y 0851519 CEE.

1. Combinatoria Síntesis de polímero Library (Variando en Química de Polímeros) - ver figura 1 para la instalación robótica <ol><li> Disolver cada monómero en el disolvente apropiado (concentración = 25 mg / ml) y cargar cada uno en una jeringa estanca al gas de 10 cc. </li><li> Una los tubos resistentes a disolventes bloqueo señuelo capilares hasta el final de cada jeringa. </li><li> Coloque las jeringas en las bombas de jeringa (New Era Bombas de jeringa programables) y bloquear en su posición. </li><li> Establecer los actuadores lineales (Zaber) a la posición inicial. </li><li> Con las abrazaderas de soporte de anillo, colocar el extremo de los dos tubos capilares en el vial de partida / pocillo para la deposición de monómero. </li><li> Iniciar el programa LabVIEW, que bombea volúmenes variables de cada monómero en cada pocillo dependiendo de la composición del copolímero deseado. Esto se consigue en el programa, instruyendo al accionador de eje Z para bajar los tubos capilares en el vial / pocillo y luego cada bomba para dispensar el volumen deseado. Nordestext, el programa indica al Z-actuador para volver a su posición inicial y los X-e Y-actuadores para mover a la posición de la siguiente vial / pocillo. Esto se lleva a cabo hasta que cada pocillo tiene el volumen deseado de monómero depositado en él. </li><li> Después de la deposición de monómero, el monómero de biblioteca de múltiples pocillos o multi-vial se transfiere a un horno de vacío precalentado y se incubaron a vacío durante la duración de la reacción de polimerización por condensación. Para CPH: síntesis de SA, la reacción se lleva a cabo a 180 ° C, 0,3 torr, durante 1,5 horas, pero estas condiciones de reacción pueden variar entre diferentes sistemas de polímeros. </li></ol> 2. Blank Combinatoria y Proteína-cargado de nanopartículas de polímeros y Fabricación Filmoteca - ver figura 1 para la instalación robótica <ol><li> La jeringa en la bomba de jeringa programable primero se llena con un disolvente (biblioteca en blanco) o un disolvente con la proteína dispersa en ella (proteína cargada por biblioteca) mientras que la jeringa en la segunda jeringabomba se deja vacío. Tubos para la fabricación de nanopartículas en el soporte de muestras adyacentes se llenan con el no disolvente (relación de disolvente a no disolvente es de 1 a 100). Para la fabricación de una película de vacío de múltiples pocillos placa se utiliza en lugar de los tubos en el soporte de la muestra adyacente. </li><li> Usando el programa LabVIEW, el disolvente se deposita en todos los viales de polímero / pozos de la biblioteca (concentración = 20 mg / ml) y se incubaron durante 1-5 min. Un paso opcional sonicación (30 s a 40 Hz) se puede introducir para asegurar la disolución completa polímero. </li><li> A continuación, mediante el inicio de un programa separado de LabVIEW, la muestra se retira en la jeringa vacía, y se deposita en su tubo correspondiente de bien no disolvente (nanopartículas) o vacío (películas) en el soporte de muestras adyacentes. </li><li> Este proceso se lleva a cabo para cada composición de la biblioteca discreta de polímero. </li><li> La nanopartícula o biblioteca de película se coloca entonces en una cámara de vacío para la eliminación de disolvente y no disolvente-(libra la nanopartículary también se pueden recuperar mediante filtración al vacío). </li></ol> 3. De alto rendimiento Cinética proteína de liberación <ol><li> Para el estudio de alto rendimiento de la cinética de liberación de proteína a partir de una biblioteca de polímero, un 96 profundas llenaron (2 ml / pocillo), placa de polipropileno se modifica de modo que el 1/3 superior de la pared del pocillo de las columnas vecinas (ex: A y B, C y D, E y F, G y H) se elimina para unir los pozos. Las películas cargadas de proteínas deben ser fabricados en o las nanopartículas transferido a esta placa para llevar a cabo de alto rendimiento estudios de cinética de liberación. Las muestras de proteína cargada por nanopartículas o película sólo debe ser colocado en un pocillo de las columnas contiguas (ex: A, C, E, y G). Ver la Figura 4 para los detalles. </li><li> Tras la transferencia de las nanopartículas a la placa de liberación 96 se llenaron profundas, las partículas se dejan sedimentar. Tampón PBS (0,1 mM, pH 7,4) se añade lentamente a cada pocillo de muestra (columnas A, C, E y G) y después a cada vecino bien (columnas B, D, F, y H) hasta que los pozos están llenos y el tampón es de flujo libre entre pozos adyacentes. Para las nanopartículas, este proceso debe llevarse a cabo con sumo cuidado para asegurar que las partículas permanecen en la parte inferior de la muestra así (columnas A, C, E y G) y no se transfieren a la liberación contigua bien (columnas B, D, F , y H). En algunos casos, la centrifugación se requiere para localizar las muestras de nanopartículas en la parte inferior de la muestra así (columnas A, C, E y G). </li><li> A continuación, la placa de liberación está sellado con una tapa y se coloca a la temperatura deseada (es decir, 37 ° C) bajo agitación durante la duración del experimento. </li><li> En los puntos de tiempo incremental (es decir, 0,04, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24, y día 30) la cantidad de conjugado a un fluorocromo liberado proteína se cuantificó usando un escáner de fluorescencia Typhoon 9.400 caja plana ( GE Healthcare). La placa de liberación se coloca en la superficie del escáner, escanea con el láser de excitación apropiada y las emisiones filteRS, y la intensidad de fluorescencia de la proteína liberada en los pocillos de liberación (columnas B, D, F y H) se cuantifica (Image Quant). Se sugiere que los patrones de proteína de concentraciones conocidas se incluyen en la placa de pocillos para el cálculo de la cantidad de proteína y la contabilidad de enfriamiento fluorocromo. </li></ol> 4. Los resultados representativos Tras la fabricación de la biblioteca de polímero, la caracterización se llevó a cabo con 1 H RMN, GPC, y FTIR para validar este método combinatorio 1,7,8,11. Intervalo de pesos moleculares de 10.000-20.000 g / mol, índice de polidispersidad varía desde 1,5 hasta 3,0, y la composición química se ha demostrado que es exacta y de acuerdo con los métodos convencionales de síntesis polianhídrido 12-15. Del mismo modo, las imágenes SEM de las bibliotecas de nanopartículas mostró morfología de la superficie similar, tamaño, y distribución de tamaño que el de las nanopartículas fabricadas convencionalmente 2. Proteína de liberación kinetics a partir de nanopartículas de polianhídrido o películas se lleva a cabo en una placa modificada así como se ha descrito anteriormente 1. Los resultados mostraron una liberación aproximada de orden cero con o sin una explosión depende de la carga de proteínas y la química de polímeros (Figuras 2 y 3) 1,12,14,16. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig1.jpg" /> Figura 1. Combinatoria de película de polímero y aparato de fabricación de nanopartículas. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig2.jpg" /> Figura 2 de alto rendimiento de liberación de Texas Red albúmina de suero bovino (TRBSA) de un CPH:. SA biblioteca de nanopartículas de polímero. SA-ricos polímeros químicos liberar encapsulado TRBSA el más rápido, mientras CPH-ricos polímeros químicos liberar el más lento. Las barras de error representan la desviación estándarción y n = 4. Reproducido con el permiso de Petersen et. al. 1. Copyright 2010 American Chemical Society. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig3.jpg" /> Figura 3 High-throughput liberación de Texas Red albúmina de suero bovino (TRBSA) de un CPTEG:. CPH biblioteca de película de polímero. CPTEG ricos en química de polímeros liberan encapsulado TRBSA el más rápido, mientras CPH-ricos polímeros químicos liberar el más lento. Las barras de error representan la desviación estándar y n = 3. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig4.jpg" /> Figura 4. Imagen que muestra dos pozos vecinos &quot;antes&quot; y &quot;después de&quot; modificación en la placa de polipropileno de 96 profundo brotó. El &quot;después&quot; modificación de la derecha también describe la adición de una película de polímero (parte inferior izquierda de la cavidad) con una molécula fluorescente encapsuladode ser liberado entre las dos pozos en una solución tampón. La molécula fluorescente liberado se detecta luego en la derecha también.

<ol><li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+high-throughput+method+to+study+in+vitro+protein+release+from+polymer+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres.</a> J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+innate+immune+responses+in+a+pathogen-mimicking+manner+by+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticle+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants.</a> Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).</li>
<li>Vogel, B. M., Cabral, J. T., Eidelman, N., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+synthesis+and+high-throughput+dissolution+testing+of+biodegradable+polyanhydride+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">Parallel synthesis and high-throughput dissolution testing of biodegradable polyanhydride copolymers.</a> J. Comb. Chem. 7, 921-928 (2005).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+evaluation+of+in+vivo+biodistribution+of+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">High-throughput evaluation of in vivo biodistribution of polyanhydride nanoparticles.</a> Adv. Healthcare Mater. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Petersen, L. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+design+of+biomaterials+for+drug+delivery%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Combinatorial design of biomaterials for drug delivery: opportunities and challenges.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 5, 837-846 (2008).</li>
<li>Petersen, L. K., Oh, J., Sakaguchi, D. S., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydride+films+promote+neural+stem+cell+adhesion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation.</a> Tissue Eng. 17, 2533-2541 (2011).</li>
<li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+protein+stability+in+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles.</a> Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).</li>
<li>Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simultaneous+effect+of+polymer+chemistry+and+device+geometry+on+the+in+vitro+activation+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells.</a> Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).</li>
<li>Thorstenson, J. B., Petersen, L. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial%2Fhigh-throughput+methods+for+the+determination+of+polyanhydride+phase+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">Combinatorial/high-throughput methods for the determination of polyanhydride phase behavior.</a> J. Comb. Chem. 11, 820-828 (2009).</li>
<li>Xue, L., Petersen, L., Broderick, S., Narasimhan, B., Rajan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+factors+controlling+protein+release+from+combinatorial+biomaterial+libraries+via+hybrid+data+mining+methods%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identifying factors controlling protein release from combinatorial biomaterial libraries via hybrid data mining methods.</a> ACS Comb. Sci. 13, 50-58 (2011).</li>
<li>Adler, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cell-based+screening+of+biodegradable+polyanhydride+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High+Through.+Screen%22%5BJournal%5D)">High-throughput cell-based screening of biodegradable polyanhydride libraries.</a> Comb. Chem. High Through. Screen. 12, 634-645 (2009).</li>
<li>Determan, A. S., Trewyn, B. G., Lin, V. S., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation%2C+stabilization%2C+and+release+of+BSA-FITC+from+polyanhydride+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres.</a> J. Control. Release. 100, 97-109 (2004).</li>
<li>Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+stability+in+the+presence+of+polymer+degradation+products%3A+consequences+for+controlled+release+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Protein stability in the presence of polymer degradation products: consequences for controlled release formulations.</a> Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).</li>
<li>Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydrides+for+protein+stabilization+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release.</a> Biomaterials. 28, 108-116 (2007).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
<li>Carrillo-Conde, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+into+amphiphilic+polyanhydride+microparticles+stabilizes+Yersinia+pestis+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Encapsulation into amphiphilic polyanhydride microparticles stabilizes Yersinia pestis antigens.</a> Acta Biomater. 6, 3110-3119 (2010).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El conocimiento de las condiciones de síntesis necesarias y las temperaturas de transición vítrea (Tg s) de los polímeros que se sintetizaron son esenciales para la fabricación de biblioteca. Si la Tg s están por debajo de la temperatura ambiente, la etapa de fabricación de nanopartículas puede ser necesario llevar a cabo en un ambiente de temperatura controlada por debajo de la Tg de los polímeros. Además, se debe tener cuidado para asegurar que todo el equipo que entra en contacto con ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> El número de catálogo </td></tr><tr><td> Motorizado XYZ Stage: 3x T-LSM050A, 50 mm recorrido por eje </td><td> Zaber Tecnologías </td><td> T-XYZ-LSM050A KT04- </td></tr><tr><td> NE-1000 Bomba de Jeringa individual </td><td> Nuevos Sistemas de siglos de la bomba </td><td> NE-1000 </td></tr><tr><td> Pyrex * Vista * reutilizables tubos de cristal sin montura Cultura </td><td> Corning </td><td> 07-250-125 </td></tr><tr><td> Las cubetas de vidrio </td><td> Estrategias Científicas </td><td> G102 </td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> National Instruments </td><td> 776671-35 </td></tr><tr><td> SGE estanca al gas, jeringas Luer Loc </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 509507 </td></tr><tr><td> U96 DeepWell placas 1,3 ml y 2,0 ml </td><td> Thermo Scientific: Nunc </td><td> 278743 </td></tr><tr><td> Bueno esteras de cabeza </td><td> Thermo Scientific: Nunc </td><td> 276000 </td></tr><tr><td> Typhoon 9400 </td><td> GE Healthcare </td><td> 63-0055-79 </td></tr><tr><td> Whatman Grado 50 Círculos de 90 mm </td><td> Whatman </td><td> 1450-090 </td></tr></tbody></table>

síntesis combinatoria y de alto rendimiento liberación de proteínas de película de polímero y nanopartículas bibliotecas

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polianhídridos son una clase de biomateriales con excelente biocompatibilidad y la capacidad de administración de fármacos. Mientras que se han estudiado ampliamente con convencional de una muestra-en-un-tiempo las técnicas de síntesis, una más reciente de alto rendimiento enfoque ha sido desarrollado que permite la síntesis y ensayo de grandes bibliotecas de polianhídridos 1. Esto facilitará la optimización más eficaz y el proceso de diseño de estos biomateriales para aplicaciones de administración de fármacos y vacunas. El método en este trabajo se describe la síntesis combinatoria de película polianhídrido biodegradable y bibliotecas de nanopartículas y la detección de alto rendimiento de liberación de proteína a partir de estas bibliotecas. En este método robóticamente operado (Figura 1), actuadores lineales y bombas de jeringa son controlados por LabVIEW, que permite un protocolo automatizado de manos libres, la eliminación de un error del usuario. Además, este método permite la fabricación rápida de micro-escala de bibliotecas de polímero, rojoucing el tamaño de lote, mientras que resulta en la creación de sistemas de polímeros multivariantes. Este enfoque combinatorio para la síntesis de polímeros facilita la síntesis de hasta 15 diferentes polímeros en una cantidad equivalente de tiempo que tomaría para sintetizar un polímero convencional. Además, la biblioteca combinatoria polímero se pueden fabricar en geometrías en blanco o cargado en proteínas que incluyen películas o nanopartículas la disolución de la biblioteca de polímero en un disolvente y la precipitación en un no disolvente (por nanopartículas) o por secado al vacío (para películas). Al cargar una proteína conjugado a un fluorocromo en las bibliotecas de polímero, la cinética de liberación de proteína puede ser evaluado en alto rendimiento utilizando un método de detección basado en la fluorescencia (Figuras 2 y 3) como se ha descrito anteriormente 1. Esta plataforma combinatoria ha sido validado con métodos convencionales 2 y la película de polianhídrido y bibliotecas de nanopartículas se han caracterizado con <sup&gt; 1 H RMN y FTIR. Las bibliotecas han sido examinados para la cinética de liberación de proteína, la estabilidad y la antigenicidad; in vitro toxicidad celular, la producción de citoquinas, la expresión marcador de superficie, la adhesión, la proliferación y la diferenciación, y la biodistribución in vivo y mucoadhesión 1-11. El método combinatorio desarrollado en la presente memoria permite un alto rendimiento de la síntesis del polímero y la fabricación de proteína cargada por nanopartículas y bibliotecas de película, que puede, a su vez, se proyectará in vitro e in vivo para la optimización del rendimiento de biomaterial.

Este método describe la síntesis combinatoria de película polianhídrido biodegradable y bibliotecas de nanopartículas y la detección de alto rendimiento de liberación de proteína a partir de estas bibliotecas.

Síntesis combinatoria y de alto rendimiento liberación de proteínas de película de polímero y nanopartículas Bibliotecas

Las polianhídridos son una clase de biomateriales con una excelente biocompatibilidad y capacidades de administración de fármacos. Si bien han sido estudiados extensamente con...

Este vídeo describe la síntesis combinatoria de bibliotecas de películas y nanopartículas de polianhídrido biodegradable, y la detección de alto rendimiento de la liberación de proteínas a partir de estas bibliotecas. Primero, se utiliza un aparato automatizado de deposición de alto rendimiento para depositar una matriz diversa en composición de monómeros en cubetas de vidrio. Se lleva a cabo una reacción de policondensación a 180 grados Celsius y 0,3 torr durante 1,5 horas.Estas condiciones de reacción son específicas para la síntesis del polímero anhídrido poli C-P-H-S-A. Mediante el uso del aparato de deposición automatizado, se depositan el disolvente y cualquier componente para encapsulación en las cubetas que contienen la biblioteca de polímeros. Puede aplicarse sonicación para asegurar la disolución completa del polímero y la dispersión uniforme de los componentes adicionales.Luego, el polímero disuelto se transfiere a un tubo con un disolvente no solvente para fabricar la biblioteca de nanopartículas mediante nanoprecipitación. Las nanopartículas se recuperan mediante secado al vacío o filtración, y luego se transfieren a una placa modificada de 96 pocillos con liberación controlada. Finalmente, la biblioteca cargada con proteína se incuba en condiciones fisiológicas y se evalúan la cinética de liberación de proteína mediante un método de detección fluorescente por separación espacial.Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran la cinética de liberación de proteínas en función de las propiedades del polímero o de las condiciones del entorno de liberación. La principal ventaja de este enfoque frente a otras técnicas convencionales que analizan una muestra a la vez es que podemos sintetizar múltiples muestras simultáneamente. Estas muestras luego pueden analizarse mediante cribado de alto rendimiento para evaluar las interacciones proteína-polímero, célula-polímero o polímero-huésped.Esto acelera entonces el diseño y desarrollo racional de estos biomateriales para la administración de fármacos e ingeniería de tejidos. La encargada de demostrar el procedimiento será La Tricia Peterson, una becaria posdoctoral de mi laboratorio. En esta sección del video, se utiliza un aparato de deposición de alto rendimiento Hyatt para depositar una biblioteca de monómeros con variación composicional tras la síntesis del polímero.Este aparato se utiliza para fabricar una biblioteca combinatoria de películas poliméricas o nanopartículas, vacías o cargadas con proteínas. La plataforma automatizada consta de dos bombas de jeringa programables y tres actuadores lineales conectados en serie a una computadora. Se utiliza software LabVIEW para enviar comandos a las bombas de jeringa y a los actuadores.Se cargan jeringas gast tight de 10 cc en las bombas de jeringa con tubos capilares de metal conectados mediante accesorios de bloqueo tipo lure lock, que dispensan las soluciones poliméricas en cubetas de vidrio. En esta demostración, se utilizará ácido seícico o SA junto con uno seis Biss para oxi heano o CPH para crear una biblioteca de nanopartículas que encapsulan albúmina sérica de bovino marcada con Texas Red. Las instrucciones de este video y los documentos adjuntos pueden adaptarse para fabricar y probar una amplia variedad de bibliotecas de películas poliméricas y nanopartículas.Para sintetizar las bibliotecas, comience por disolver cada monómero y cloroformo a una concentración final de 25 miligramos por mililitro en un vial de vidrio. A continuación, cargue cada solución en una jeringa hermética de 10 cc aspirando la solución a través del extremo de bloqueo de acople de la jeringa. Elimine cualquier burbuja de aire.A continuación, sujete el tubo capilar de acero inoxidable con cierre resistente al disolvente al extremo de la jeringa. Sujete los tubos capilares con pinzas y fíjelos a un soporte con anillo. Luego, coloque el extremo de ambos tubos capilares dentro del vete inicial.Para la deposición del monómero. Coloque las jeringas en las bombas de jeringa programables y fíjelas en posición en el software de vista de laboratorio. Establezca los actuadores lineales en la posición inicial en el software.Inicie la deposición automatizada de los monómeros de SA y CPH en las cubetas de vidrio a lo largo de los ejes x, y y Z. Los actuadores posicionarán correctamente los tubos capilares en cada Q, y bombearán volúmenes programados de cada monómero en ellos, creando una biblioteca de monómeros con variación composicional. Tras la deposición de los monómeros.Transfiera la biblioteca de monómeros a un horno de vacío precalentado e incube a 180 grados Celsius y 0,3 torr durante 1,5 horas para permitir la polimerización por condensación. Tras la incubación, se completa la fabricación de la biblioteca de polímeros. A continuación, se generan nanopartículas poliméricas cargadas con proteína.Consulte el protocolo adjunto para la fabricación de una biblioteca de películas poliméricas cargadas con proteína con el fin de fabricar una biblioteca de nanopartículas cargadas con proteína. Añada la proteína, en este caso albúmina sérica bovina marcada con rojo Texas, al disolvente adecuado, que debe ser capaz de disolver la biblioteca de polímeros. Aquí se utiliza cloruro de metileno en una concentración de dos miligramos por mililitro.Llene la jeringa de 10 cc con BSA marcado con Texas Red que contiene disolvente y colóquela en la primera bomba de jeringa. Luego, coloque una jeringa limpia y vacía de dos cc en la segunda bomba de jeringa; coloque tubos que contengan 15 mililitros de un no disolvente, en este caso pentano, en el soporte de tubos adyacente a la plataforma de viales. A continuación, en el laboratorio, en el software, inicie el proceso automatizado de deposición de disolvente seleccionando el programa.Tras la iniciación del programa, el disolvente se deposita en las cubetas que contienen la biblioteca de polímeros, obteniendo una concentración de polímero de 20 miligramos por mililitro. Cuando todo el disolvente haya sido depositado, déjelo disolver el polímero durante uno a cinco minutos. A continuación, realice una homogenización opcional para asegurar una completa disolución del polímero y una dispersión uniforme de la proteína.A continuación, inicie el programa de transferencia de muestras en lab view. Cada muestra de polímero disuelto en la biblioteca se aspira luego en la jeringa vacía y se dispensa en el tubo correspondiente de disolvente no solvente en el portamuestras. Una vez que se ha transferido cada muestra, recupere las nanopartículas cargadas con proteína colocando la biblioteca de nanopartículas en una cámara de vacío a 10 milímetros de mercurio de vacío, o mediante filtración al vacío hasta que se elimine el disolvente.Para investigar la liberación de BSA encapsulada, comience con una placa de polipropileno profunda de 96 pocillos que haya sido modificada mediante la eliminación de la mitad superior de cada pared de los pocillos en cada par de columnas adyacentes en la placa. La eliminación de la parte superior de cada pocillo entre las columnas A y B, C y D, E y F, y G y H permite el flujo de líquido entre cada par de pocillos adyacentes cuando se llenan hasta el volumen total de transferencia. Agregue estándares de BSA marcada con Texas Red en concentraciones que van desde 1000 hasta 10 microgramos por mililitro en la placa de 96 pocillos profunda.Estos se utilizarán para calcular la cantidad de proteína y también tendrán en cuenta el apagado del fluorocromo. Reconstruya la masa deseada de nanopartículas en tampón PBS y luego sométalas a sonicación para dispersar uniformemente las partículas. A continuación, transfiera la biblioteca de nanopartículas a la placa de 96 pocillos profundos y espere hasta que las muestras se asienten en el fondo de la placa. Luego, utilizando una pipeta, llene lentamente todos los pocillos adyacentes con tampón PBS hasta un cuarto de pulgada desde la parte superior del pocillo.Debe haber suficiente tampón en los pocillos adyacentes para que fluya libremente entre ellos. A continuación, selle la placa de liberación con la tapa y colóquela a 37 grados Celsius bajo agitación. Durante toda la duración del experimento, en puntos de tiempo incrementales, utilice un escáner fluorescente plano Typhoon 9 400 para escanear la placa utilizando los filtros adecuados de excitación, láser y emisión.Tras la escaneado, utilice un software de cuantificación de imágenes para cuantificar la cantidad de proteína conjugada con fluorocromo liberada en cada muestra. En este caso, el BSA marcado con Texas Red se encapsuló en una biblioteca de nanopartículas poliméricas sintetizadas a partir de los monómeros SA y CPH, tal como se describe en este video, con el fin de determinar la cinética de liberación de proteínas en función de la química del polímero. Las nanopartículas cargadas con proteína se incubaron a 37 grados Celsius durante un mes, período durante el cual se obtuvieron escaneos fluorescentes en puntos temporales sucesivos para la cuantificación de la liberación de proteína.Como se muestra aquí, este método de alto rendimiento se utilizó para determinar la cinética de liberación de BSA marcada con Texas Red a partir de una biblioteca de nanopartículas de polianhídrido A-C-P-H-S-A. Se observaron tendencias dependientes de la composición química, con tasas de liberación crecientes en las formulaciones de película de Sarich. Se obtuvieron resultados similares al utilizar ensayos estándar de cuantificación de proteínas.En un experimento independiente, se evaluó la liberación de BSA marcada con Texas Red a partir de bibliotecas de películas de polianhídrido CPT CPH, tal como se muestra aquí; se observaron cinéticas de liberación cercanas al orden cero, con las películas ricas en cpeg liberando la proteína más rápidamente, lo que sugiere aplicaciones potenciales en el campo médico como dispositivos biodegradables de administración de fármacos. Estos resultados indican que el perfil de liberación deseado de un fármaco terapéutico o un antígeno vacunal puede controlarse modificando la química del polímero. Tras este procedimiento, se han desarrollado otros métodos combinatorios para investigar áreas como la estabilidad de proteínas, la toxicidad celular, la activación celular y la biodistribución InVivo.Estos aspectos son importantes para el diseño racional de biomateriales para la administración de fármacos e ingeniería de tejidos. No olvide usar el EPP adecuado y practicar procedimientos de laboratorio seguros durante todo este protocolo.

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