Name: Cariotipo espectral para el Estudio de anomalías cromosómicas en humanos y ratones con la enfermedad renal poliquística (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Aprende el cariotipo espectral para detectar anomalías cromosómicas en humanos y ratones con enfermedad renal poliquística. Esta técnica avanzada permite identificar aberraciones complejas mediante hibridación fluorescente.

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Los autores desean agradecer a Brian Muntean, Lo Shao, Maki Takahashi y Mell Blair por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por concesiones del NIH (DK080640) y la Universidad de Toledo y ProMedica traslacional Premio Estímulo de Investigación con el Dr. Surya Nauli.

1. De la célula pre-tratamiento y preparación de la metafase <ol><li> Las células se cultivan en modif Dulbecco de Medio Eagle (DMEM) que contiene 10-15% de suero fetal bovino (SFB) y 1% penicilina / estreptomicina a 37 ° C con 5% de CO 2 incubadora, hasta que alcanzan 70-80% de confluencia. </li><li> Se tratan las células con solución colcemid a 0,05 ug / ml para 30-60 min. </li><li> Se recoge el medio que contiene las células flotantes en 50 ml tubos de centrífuga estériles de halcón. Lavar las células en el plato con sterile1X-PBS. Después de incubar con tripsina estéril para 1-2 min, se cosecha y recoger las células restantes en el mismo tubo. </li><li> Haga girar los tubos a 1000 rpm durante 5 minutos, aspirar el sobrenadante dejando 0,5 ml y afloje de pellets con un movimiento rápido con el dedo solamente. </li><li> Dependiendo del tamaño de pellets, añadir 5-10 ml de solución hipotónica de 0,56% de KCl en dH 2 O y incubar la suspensión a 37 ° C durante 30-45 min. </li><li> Agregue una gota de metanol / ácido acético(3:1 vol / vol) por ml de suspensión celular hipotónica e invierta el tubo suavemente para mezclar. </li><li> Centrifugar a 1200 rpm durante 5 minutos y recoger el pellet como paso 1.4, a continuación, añadir 5 ml de metanol fresco / ácido acético (3:1 vol / vol) gota a gota la solución de fijación mientras se ojean la pastilla continuamente. Este procedimiento es fundamental para que los spreads metafase no será atrapado en macizos de las células que pondrían en peligro el experimento. </li><li> Centrifugar de nuevo a 1200 rpm durante 5 min y añadir 5-10 ml de helado de metanol / fijador ácido acético a lo largo de la pared del tubo. En esta etapa, si es necesario, las células pueden ser almacenadas en solución fijadora en un tubo apretados y selladas a -20 ° C durante corto plazo o -80 ° C durante largo plazo (años) para su uso futuro. </li><li> Diapositivas Limpieza en etanol absoluto, y luego sumerja la diapositiva en dH 2 O para approximately10X el fin de formar una vaina de agua en la superficie de la diapositiva. Colocar el portaobjetos en una placa de vidrio y la caída del 15-20ul de la suspensión celular (del paso 1.8) De 10 &quot;por encima de la diapositiva. Colocar el portaobjetos en un baño de agua a 65-70 ° C durante 1-2 minutos y dejar secar. </li><li> Compruebe el portaobjetos bajo un microscopio óptico con objetivos secos de 10X y 40X asegurándose de que no hay metafase los cromosomas y los diferenciales de los se espacian uniformemente. Comprobación de la existencia citoplasma que rodea a los cromosomas. Si citoplasma está presente proceder con el pretratamiento de diapositivas (digestión con pepsina), si no hay citoplasma está presente y los cromosomas tienen buena morfología, entonces no hay necesidad de pretratamiento de diapositivas. </li></ol> 2. Deslice el tratamiento previo (pepsina tratamiento) <ol><li> Aplicar 120 l de solución 1:200 RNasa (20 mg / ml) disuelto en 2X-SSC en un 24 mm x 60 mm cubreobjetos microscopio e invierta la cara diapositiva metafase abajo en el cubre objetos a continuación, invierta suavemente la cara diapositiva metafase hasta e incubar a 37 ° C durante 45 min. </li><li> Retire con cuidado el cubreobjetos sin rayar el portaobjetos y lávelo en 2X SSC-tampón en un vaso de Coplin cada 5 minutos durante 15 minutoscon agitación. </li><li> Añadir 5-15 l de solución stock de pepsina (100 mg / ml en dH 2 O) en un vaso de precipitados limpio y luego agregar 100 ml de precalentado (37 ° C) 0,01 M de HCl. Es importante que la pepsina se añade en una limpia vaso de precipitados de primera y no directamente en la solución de HCl, de lo contrario no sería disolver en solución. Incubar el portaobjetos en un vaso de Coplin que contiene la solución de HCl / pepsina a 37 ° C durante 3-5 min. Este paso es muy crítico como la digestión demasiado causará que los cromosomas que se overdigested y demasiado digestión poco va a dejar el citoplasma sin digerir que podría conducir a la unión no específica de la sonda e interferir con la señal de hibridación. </li><li> Lavar el portaobjetos en un vaso de Coplin que contiene 100 ml de 1X-PBS durante 5 minutos dos veces a temperatura ambiente. </li><li> Lavar el portaobjetos en un vaso de Coplin que contiene 100 ml 1X-PBS/MgCl 2 durante 5 min a temperatura ambiente (50 ml de 1M MgCl 2 en 950 ml de 1X-PBS). </li><li> Colocar el portaobjetos en una jarra de Coplin containing 100 ml de 1% de formaldehído durante 10 min a temperatura ambiente (1,7 ml de 37% de formaldehído en 100 ml de 1X-PBS/MgCl 2). </li><li> Lavar el portaobjetos en un vaso de Coplin que contiene 100 ml de 1X-PBS durante 5 min. </li><li> Observe el portaobjetos bajo un microscopio óptico con lente de 40X en seco para asegurar que las diapositivas se digieren correctamente y sin citoplasma está presente y la morfología de los cromosomas se conserva. Seleccione un área para la hibridación con una pluma de diamantes. </li></ol> 3. Cromosoma y la sonda desnaturalización y la hibridación <ol><li> Prepare una solución fresca de desnaturalización (70% formamide/2X SSC, pH 7,0) y precalentamiento a 70-80 ° C en un vaso de Coplin colocado en un Lugar baño de agua la diapositiva en el vaso de Coplin que contiene la solución desnaturalizante en un baño de agua a 70 ° C durante cromosomas de ratón y 80 ° C durante cromosomas humanos para 30s-1.5 min. </li><li> Coloque inmediatamente la diapositiva en el hielo-frío etanol 70% durante 3 min seguido por 80% y 100% de etanol durante 3 min cada uno y aire seco. Examinar el portaobjetospara la morfología cromosoma. Morfología de los cromosomas Bueno se denota por los cromosomas oscuros y no &quot;de luz de fase&quot; o halo cromosomas. </li><li> Caliente la sonda SkyPaint (kit de SKY pintura; vial de # 1) a 37 ° C con agitación durante 20 min, vórtice y centrifugar brevemente a 1000 rpm durante unos pocos segundos. </li><li> Desnaturalizar la sonda en un termociclador programado para un ciclo de dos-paso a 85 ° C para el ciclo de 5 min seguido de 37 ° C durante 60 min para permitir etiquetados-sonda de ADN para preannealing. </li><li> Aplicar 10ul de la sonda desnaturalizada en el área de la hibridación y la tapa con una de 22 mm x 40 mm cubreobjetos con cuidado de no atrapar burbujas de aire. Selle los bordes del cubreobjetos con cemento de goma y se incuban en una cámara húmeda a 37 ° C durante 48-72 horas. </li></ol> 4. La detección de sondas fluorescentes <ol><li> Retire el cubreobjetos con cuidado y coloque el portaobjetos en un vaso de Coplin que contiene precalentado (45 ° C) la solución de lavado I (formamida 50% recién preparada en 2X SSC). Lavar durante 5 minutosrealizada tres veces a 45 ° C en un baño de agua con agitación a 45 rpm </li><li> Lavar el portaobjetos en solución de lavado II (1X SSC) a 45 ° C durante 5 min dos veces con agitación. </li><li> Lave la diapositiva en el lavado de solución III (4X SSC/0.1% de Tween 20) durante 5 min a 45 ° C con agitación. </li><li> Aplique 80 l de reactivo de bloqueo (kit de pintura SKY; vial n º 2), coloque un cubreobjetos y se incuba a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Retire la corredera y permitir que el líquido drene. Aplique 80 l de reactivo de tinción Cy5 (concentrado de anticuerpos de detección de CAD kit, vial n º 3), aplique un cubreobjetos y se incuba a 37 ° C durante 40 min. </li><li> Lavar el portaobjetos con solución de lavado III en 45 ° C durante 5 min tres veces con agitación. </li><li> Aplique 80 l de reactivo de tinción Cy5.5 (concentrado de anticuerpos de detección de CAD kit, vial n º 4), coloque un cubreobjetos y se incuba a 37 ° C durante 40 min. </li><li> Lavar el portaobjetos con solución de lavado III en 45 ° C durante 5 min tres veces con agitación. </li><li> Incline la diapositiva y permitir que el líquido<html> escurrir. Aplique 20 l del reactivo anti-fade DAPI (kit de pintura SKY; vial n º 5) y colocar una de 24 mm x 60 mm cubreobjetos microscopio. Retire con cuidado las burbujas de aire que puedan haberse formado. Diapositivas pueden ser reflejados inmediatamente o almacenadas a 4 ° C en la oscuridad durante no más de 1 semana. </li></ol> 5. Imagen de adquisición y análisis <ol><li> La adquisición de imágenes se logra mediante la visualización diapositivas metafase utilizando un microscopio Olympus equipado con una lente de aceite de inmersión 60X, un cubo espectral (personalizado diseñado triples banda filtro de paso), un filtro de DAPI y un módulo de Sagnac interferómetro con una cámara CCD. </li><li> Espectral de los cariotipos se llevaron a cabo utilizando el software SKY Vista (versión aplicada de imágenes espectrales 1,62) siguiendo el manual del usuario. </li><li> Después de analizar las imágenes, los cromosomas pueden ser vistos como imágenes en color (con determinados colores fluorescentes), imágenes de pseudo color (con los colores para la clasificación) y las imágenes invertidas DAPI (patrón específico de bandas). </li></ol>e_title &quot;&gt; 6. Los resultados representativos Un procedimiento de SKY completa generalmente toma alrededor de una vez por semana (Figura 1). Esto incluye la adquisición de imágenes y el análisis siempre que las células en metafase están en cantidad adecuada. Análisis de cariotipo revela cariotipo normal de ratón (40, XY) de las células de los ratones de tipo salvaje (Figura 2a). En contraste, las células de PKD1 - / - ratón (modelo DCP ratón) muestra un aumento significativo en el número de cromosomas y las anormalidades estructurales, tales como deleciones del cromosoma (el cromosoma # 8) y translocaciones (los cromosomas 11 y 19) (Figura 2b). También se analizaron los tejidos vasculares de los pacientes PQRAD. Un estudio simple contando los números cromosómicos indicó que no PQRAD y algunas muestras vasculares PQRAD tenía normales números cromosómicos de 23 pares (figura 2c). En general, sin embargo, se observó fracaso de la segregación cromosómica, lo que resulta en 46 pares de cromosomas en AMuestras DPKD en lugar de pares 23 (Figura 2d). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3887/3887fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama de flujo de SKY protocolo. Diagrama de flujo del protocolo de SKY ilustra los pasos para completar un experimento a partir de células pre-tratamiento y preparaciones en metafase a la adquisición y análisis de imágenes. Un aproximado de una semana calendario se presenta a la izquierda con los procedimientos paso a paso para cada día. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3887/3887fig2.jpg" /> Figura 2. Cariotipo espectral en inmortalizado líneas celulares de ratón y células primarias recién aisladas de humanos. El color y las imágenes invertidas DAPI de los cromosomas individuales se muestran antes de la clasificación de los cromosomas. Después de la clasificación, los cromosomas se presentan en la &quot;clasificación&quot; de mesa. Una imagen del cielo) de una extensión metafase de ratón de tipo salvaje contiene un cariotipo normal (40, XY). B) </strong&gt; SKY imagen de una propagación de la metafase PKD1 - / -. del ratón muestra el número de cromosomas anormales (68 en lugar de 40) y las anomalías cromosómicas, como deleciones del cromosoma (el cromosoma 8) y translocaciones cromosómicas (cromosomas 11 y 19) c) SKY imagen de una propagación metafase del tejido vascular de un paciente no tiene PQRAD cariotipo normal (46, XX). d) imagen del cielo de una propagación de la metafase el tejido vascular de un paciente con PQRAD contiene cariotipo anormal (92, XXXX). Partes de los datos han sido previamente informado y se reutiliza con permiso 14.

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Cariotipo espectral (SKY) es una técnica de citogenética utilizada en el estudio de las composiciones genómicas y cromosómicas. Esta técnica se aprovecha de las sondas de pintado cromosómico, y la detección de estas sondas son adquiridos a través de un interferómetro de Sagnac. El proceso de SKY completa generalmente toma alrededor de una semana, e implica varios pasos clave (Figura 1). El SKY utiliza un protocolo estándar, el cual fue descrito por primera vez por Padilla-Nash et al 3.</su...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro Mediatech Inc. </td><td> 10 a 013 CV </td><td></td></tr><tr><td> De suero fetal bovino (SFB) </td><td> Hyclone </td><td> SH30088-03 </td><td></td></tr><tr><td> Penecillin / estreptomicina </td><td> Thermo Scientific </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Colcemid </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 295 892 001 </td><td> 10 g / ml </td></tr><tr><td> De HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S77375-1 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato solución salina tamponada </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256-01 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> SKY pintura Sonda (Humana) </td><td> Imágenes Applied Spectral </td><td> SKY000028 </td><td></td></tr><tr><td> SKY pintura Probe Kit (Mouse) </td><td> Imágenes Applied Spectral </td><td> SKY000030 </td><td></td></tr><tr><td> Concentrado kit de detección de anticuerpos </td><td> Imágenes Applied Spectral </td><td> SKY000033 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30236.01 </td><td></td></tr><tr><td> El metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A433P-4 </td><td></td></tr><tr><td> El ácido acético </td><td> Fisher Scientific </td><td> A38-212 </td><td></td></tr><tr><td> RNasa A </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 109 169 001 </td><td></td></tr><tr><td> Pepsina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6887-5G </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Fluka </td><td> 63069-500ML </td><td></td></tr><tr><td> 37% El formaldehído </td><td> Mallinckrodt Baker </td><td> 2106-02 </td><td></td></tr><tr><td> SSC 20X </td><td> Promega </td><td> V4261 </td><td></td></tr><tr><td> Formamida </td><td> Fluka </td><td> 47671 </td><td> preparar justo antes de usarse </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-500 </td><td></td></tr><tr><td> Portaobjetos de vidrio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-549 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio cubierta de vidrio 24x60mm </td><td> VWR Vista Vision </td><td> 16004-312 </td><td></td></tr><tr><td> Adhesivo de goma </td><td> Elmer (tienda local) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hibridación / humidifiedchamber / bandeja </td><td> Simport </td><td> M920-2 </td><td> poner las toallas de papel mojadas en la parte inferior </td></tr><tr><td> Thermociclista </td><td> Eppendorf </td><td> Epgradient S </td><td></td></tr><tr><td> Plataforma de agitación / Agitador orbital </td><td> Bellco Biotecnología </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Baño de agitación / agua </td><td> Precisión Científico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DAPI filtro de cubo </td><td> Chroma Technology </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SKY filtro de cubo </td><td> Chroma Technology </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SpectraCube </td><td> Imágenes Applied Spectral </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Celular microscopio invertido la cultura </td><td> Nikon </td><td> Nikon Eclipse TS100 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de fluorescencia </td><td> Olimpo </td><td> IX70 </td><td> Aceite de 60X </td></tr></tbody></table>

cariotipo espectral para el estudio de anomalías cromosómicas en humanos y ratones con la enfermedad renal poliquística

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

El método convencional para identificar y clasificar los cromosomas individuales depende del patrón único de bandas de cada cromosoma en una especie en particular se analizaron 1, 2. Esta técnica clásica anillamiento, sin embargo, no es fiable en la identificación de complejos aberraciones cromosómicas tales como aquellas asociadas con el cáncer. Para superar las limitaciones de la técnica de bandeo, cariotipo espectral (SKY) se introdujo para proporcionar mayor cantidad de información fiable sobre las anomalías cromosómicas. SKY es una fluorescencia multicolor de hibridación in situ (FISH) para detectar los cromosomas en metafase con el microscopio espectral de 3, 4. SKY ha sido demostrado ser una herramienta valiosa para el análisis citogenético de una amplia gama de anomalías cromosómicas asociadas con un gran número de enfermedades genéticas y enfermedades malignas 5, 6. CIELO implica el uso de sondas de ADN multicolores fluorescentemente-etiquetados preparados a partir de la oligonucleótidos degeneradoscebadores otide por PCR. Así, cada cromosoma tiene un color único espectral después de hibridación in situ con sondas, que están diferencialmente etiquetados con una mezcla de tintes fluorescentes (Rodamina, Texas Red, Cy5, FITC y Cy5.5). Las sondas utilizadas para SKY constar de hasta 55 sondas cromosómicas específicas 7-10. El procedimiento para SKY implica varios pasos (Figura 1). CIELO requiere la disponibilidad de células con alto índice mitótico a partir de tejido normal o enferma o sangre. Los cromosomas de una sola célula a partir de ya sea un celular recién aisladas primaria o una línea celular se extienden sobre un portaobjetos de vidrio. Esta propagación cromosoma está etiquetado con una combinación diferente de tintes fluorescentes específicas para cada cromosoma. Para la detección de la sonda y la adquisición de imágenes, el sistema de imagen espectral consta de interferómetro de Sagnac y una cámara CCD. Esto permite la medición del espectro de luz visible emitida desde la muestra y para adquirir una imagen espectral vaivénm individuales cromosomas. HiSKY, el software utilizado para analizar los resultados de las imágenes capturadas, proporciona una fácil identificación de anomalías cromosómicas. El resultado final es una metafase y una imagen de clasificación cariotipo, en el que cada par de cromosomas tiene un color distinto (Figura 2). Esto permite una fácil identificación de las identidades cromosoma y translocaciones. Para más información, visite el sitio web Aplicada Spectral Imaging ( <a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a> ). SKY se utilizó recientemente para la identificación de los defectos de la segregación cromosómica y las anomalías cromosómicas en humanos y ratones con autosómica dominante renal poliquística (PQRAD), una enfermedad genética que se caracteriza por una disfunción en los cilios primarios 11-13. Usando esta técnica, hemos demostrado la presencia de la segregación cromosómica anormal y anomalías cromosómicas en pacientes PQRAD y modelos de ratón 14. Los análisis adicionales utilizando SKY no sólo nos permitió identificar el número cromosómico y la identidad, sino también para detectar con precisión las aberraciones cromosómicas muy complejas, tales como deleciones y translocaciones cromosómicas (Figura 2).

Cariotipo espectral (SKY) es una técnica de citogenética avanzada para identificar aberraciones genómicas y cromosómicas. Esta técnica se aprovecha de las sondas de pintado cromosómico, lo que permite la clasificación de todos los cromosomas. Sky también puede identificar aberraciones cromosómicas y defectos complejos de segregación en ratones y seres humanos con diversas enfermedades, incluyendo enfermedad renal poliquística.

Cariotipo espectral para el Estudio de anomalías cromosómicas en humanos y ratones con la enfermedad renal poliquística

El método convencional para identificar y clasificar los cromosomas individuales depende de que el patrón de bandas único de cada cromosoma en una especie específica sea...

El objetivo de este procedimiento es marcar los cromosomas con sondas de pintado para identificar aberraciones cromosómicas y defectos de segregación en ratones y humanos con enfermedad renal poliquística. Esto se logra primero obteniendo células de humanos o ratones y tratándolas con smid, seguido de la fijación y preparación de extensiones en metafase sobre portaobjetos de vidrio. A continuación, el portaobjeto se pretrata para eliminar el ARN y el citoplasma excesivos que podrían interferir con la hibridación.Esto se realiza mediante digestión con RNAsas y pepsina, respectivamente. Luego se lleva a cabo la desnaturalización de los cromosomas y de la sonda, seguida de la hibridación para marcar los cromosomas. El paso final es la detección de la sonda con colorantes fluorescentes.Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran anormalidades numéricas y estructurales de los cromosomas mediante fluorescencia, microscopía y captura de imágenes, así como análisis con el software Skyview. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como las técnicas clásicas de doblado de GIMs, es que proporciona información adicional sobre aberraciones cromosómicas complejas, como translocaciones cromosómicas y reordenamientos cromosómicos complejos, que no pueden caracterizarse mediante técnicas clásicas de doblado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la enfermedad renal poliquística, como el mecanismo de formación del riñón quístico.El procedimiento será demostrado por la Dra. Wiam Abu, permitiendo que un talentoso posdoctorado senior de nuestro laboratorio comience con células endoteliales en DMEM que contiene 10 a 15% de suero bovino fetal y 1% de penicilina-estreptomicina a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono hasta que las células alcancen una confluencia del 70 al 80%. Luego, trate las células con solución de colagenasa a una concentración final de 0,05 miligramos por mililitro durante 30 a 60 minutos a 37 grados Celsius antes de cosecharlas. Para cosechar las células, primero recoja el medio que contiene cualquier célula flotante en tubos cónicos estériles de 50 mililitros.Lave las células en la placa con PBS estéril una vez durante uno o dos minutos, después de incubar con trips estériles, retire y recopile las células restantes en el mismo tubo. Después de formar el pellet celular por centrifugación a 1000 rpm durante cinco minutos, aspire la mayor parte del sobrenadante del tubo dejando aproximadamente 0,5 mililitros encima del pellet. Afloje el pellet celular golpeando suavemente el tubo.A continuación, dependiendo del tamaño del precipitado, agregue de cinco a diez mililitros de una solución hipertónica de cloruro de potasio al 0,56 % en agua destilada e incube la suspensión a 37 grados Celsius durante 30 a 45 minutos. Tras la incubación, use una pequeña pipeta de un mililitro para agregar una gota de una solución fijadora fría con hielo por cada mililitro de suspensión celular hipertónica. Luego invierta suavemente el tubo para mezclar y, a continuación, centrifugue las células durante cinco minutos a una velocidad de 1.200 rotaciones por minuto.Aspire el sobrenadante como antes. A continuación, agregue lentamente un mililitro de solución fijadora fresca mientras agita suavemente el precipitado. Luego, añada suavemente otros cuatro mililitros de fijador a la pared del tubo.Este procedimiento es fundamental para asegurar que las extensiones metafásicas no queden atrapadas en los agregados celulares. Después de repetir el paso de centrifugación y aspirar el sobrenadante, reemplace de cinco a 10 mililitros del fijador pipeteando lentamente el fijador por las paredes del tubo. En esta etapa, las células pueden almacenarse en un tubo bien cerrado a menos 20 grados Celsius para almacenamiento a corto plazo o a menos 80 grados Celsius para almacenamiento a largo plazo, hasta que estén listas para continuar.Cuando esté listo para continuar, revise el número de cromosomas en metafase en la preparación celular. Limpie el portaobjetos con etanol absoluto. Luego sumerja el portaobjetos en agua destilada aproximadamente 10 veces para formar una capa de agua sobre la superficie del portaobjetos, coloque el portaobjetos sobre una placa de vidrio y deje caer de 15 a 20 microlitros de la suspensión celular desde 10 pulgadas por encima del portaobjetos.Coloque el portaobjetos en un baño de agua ajustado a 65-70 grados Celsius durante uno o dos minutos y deje secar. Revise el portaobjetos bajo un microscopio óptico utilizando los objetivos secos de 10 y 40 aumentos. Asegúrese de que haya cromosomas metafásicos y de que las extensiones estén uniformemente espaciadas. Examine el citoplasma que rodea los cromosomas.Si está presente citoplasma, como se observa aquí, continúe con el pretratamiento del portaobjetos. Si no hay citoplasma y los cromosomas tienen buena morfología, entonces no es necesario realizar el pretratamiento del portaobjetos a 120 microlitros de una solución recién preparada de uno a 200 de 20 miligramos por mililitro. Solución de ARN disuelta en dos veces SSC en un cubreobjetos de 24 milímetros por 60 milímetros.Coloque la lámina de metafase boca abajo sobre el cubreobjetos. A continuación, invierta suavemente la lámina de metafase para colocarla boca arriba. Coloque la lámina dentro de una cámara humidificada e incúbela a 37 grados Celsius durante 45 minutos.Una vez transcurrido el tiempo de incubación, retire cuidadosamente el cubreobjetos sin rayar el portaobjetos y lave dos veces con tampón SSC en un frasco de acoplamiento, tres veces durante cinco minutos cada una, agitando. Mientras tanto, agregue de cinco a 15 microlitros de pepin al 100 miligramos por mililitro en agua destilada a un vaso de precipitados limpio y luego añada 100 mililitros de ácido clorhídrico 0,01 molar precalentado a 37 grados Celsius. Es importante agregar los PEPs primero al vaso de precipitados limpio, de lo contrario no se disolverán.Transfiera esta solución a un frasco Coplin. Incube el portaobjetos de lavado en el frasco de acoplamiento a 37 grados Celsius durante no más de tres a cinco minutos después de la digestión. Lave el portaobjetos dos veces en un frasco Coplin que contenga un XPBS durante cinco minutos cada vez con agitación.A continuación, realice un lavado de cinco minutos en un frasco Coplin que contenga PBS suplementado con cloruro de magnesio. Luego, incube durante 10 minutos en un frasco Coplin que contenga formaldehído al 1%, seguido de un lavado final en un frasco Coplin que contenga PBS 1X durante cinco minutos. A continuación, deshidrate los frascos Coplin que contienen una serie de etanol al 70%, 80% y 100% durante dos minutos cada uno, y luego seque al aire.Observe el portaobjetos bajo un microscopio óptico utilizando un objetivo seco de 40 aumentos para asegurarse de que los portaobjetos se hayan digerido adecuadamente, de que no esté presente citoplasma y de que se haya conservado la morfología cromosómica. Finalmente, seleccione un área para hibridación utilizando un lápiz de diamante. Después de preparar recientemente la solución desnaturalizante, colóquela en un frasco tipo Coplin y precálquela a 70 grados Celsius en un baño de agua.Luego coloque el portaobjetos en el frasco Coplin que contiene la solución desnaturalizante precalentada, dentro de un baño de agua a 70 grados Celsius durante 30 segundos a un minuto. Tras la incubación, coloque inmediatamente el portaobjetos en etanol frío al 70 % durante tres minutos, seguido de etanol al 80 % y al 100 % durante tres minutos cada uno, y luego seque al aire. Examine el portaobjetos para evaluar la morfología de los cromosomas, buscando la presencia de cromosomas oscuros que no presenten aspecto claro o brillante.Denota buen cromosoma o morfología. Caliente la pintura celeste. Incube a 37 grados Celsius con agitación durante 20 minutos.Luego, agite mediante vortex y centrifugue brevemente a 1000 rotaciones por minuto. Desnaturalice la sonda durante unos segundos en un termociclador a 85 grados Celsius durante cinco minutos, seguido de incubación a 37 grados Celsius. Aplique 10 microlitros de la sonda desnaturalizada sobre el área de hibridación durante una hora y cúbrala con un cubreobjetos de 22 milímetros por 40 milímetros.Asegurándose de no atrapar burbujas de aire, selle los bordes del cubreobjetos con cemento de goma, luego incube en una cámara humidificada a 37 grados Celsius durante 48 a 72 horas. Retire cuidadosamente el cubreobjetos y coloque el portaobjetos en un frasco de acoplamiento que contenga solución de lavado recién preparada, previamente calentada a 45 grados Celsius. Lave durante cinco minutos, tres veces a 45 grados Celsius en un baño de agua agitado a 45 rotaciones por minuto.Luego, lave las laminillas dos veces en la solución de lavado dos a 45 grados Celsius durante cinco minutos cada una con agitación, seguido de cinco minutos en la solución de lavado tres a 45 grados Celsius con agitación. A continuación, aplique 80 microlitros de reactivo de bloqueo. Luego, coloque un cubreobjetos e incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos.Retire el cubreobjetos y deje escurrir el líquido. Aplique 80 microlitros del reactivo de tinción sci-fi. Coloque un cubreobjetos e incube a 37 grados Celsius durante 40 minutos. Después de la incubación, lave el portaobjetos con solución de lavado tres veces a 45 grados Celsius durante cinco minutos cada vez, agitando, en tres ocasiones.A continuación, aplique 80 microlitros del reactivo de tinción PS 5.5. Coloque un cubreobjetos e incube a 37 grados Celsius durante 40 minutos; tras la incubación, lave tres veces con la solución de lavado tres, como antes. Finalmente, incline el portaobjetos y permita que el líquido drene.Aplique 20 microlitros del reactivo Antifa dappy y coloque un microscopio de 24 milímetros por 60 milímetros. Cubra el portaobjetos con cuidado para eliminar las burbujas de aire que pudieran haberse formado. Las preparaciones pueden observarse inmediatamente o almacenarse a cuatro grados Celsius en la oscuridad durante no más de una semana. Esta imagen del cielo de una extensión metafásica normal de un ratón de tipo salvaje fue capturada utilizando un microscopio Olympus equipado con un objetivo de inmersión en aceite de 60 aumentos.Un filtro personalizado de triple paso de banda conocido como cubo espectral, un filtro dappy y un módulo de interferómetro sac con una cámara CCD. Los cariotipos espectrales se realizaron utilizando el software skyview. El panel superior izquierdo muestra la extensión metafásica marcada, y el panel superior derecho muestra una imagen de campo brillante de la extensión.El panel inferior muestra el cromosoma ordenado de forma ascendente utilizando el software skyview. Esta imagen del cielo de una preparación en metafase de un ratón knockout homocigoto para pkd uno muestra un número anormal de cromosomas, donde están presentes 68 cromosomas en lugar de 40. También son visibles anormalidades cromosómicas, como la deleción del cromosoma ocho y translocaciones cromosómicas, tales como las entre los cromosomas cinco y 16, y también entre los cromosomas 11 y 19.Esta imagen de un cariotipo en metafase de cromosomas humanos procedente del tejido vascular de un paciente sin A-D-P-K-D presenta el cariotipo femenino normal de 44 cromosomas autosómicos y dos cromosomas sexuales XXX. Esta última imagen muestra un cariotipo en metafase procedente del tejido vascular de un paciente con A-D-P-K-D que presenta un cariotipo anormal de 88 cromosomas autosómicos y cuatro cromosomas sexuales XXXX. Un solo maestro.Esta técnica puede realizarse en cinco días si se lleva a cabo correctamente.

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