Proteasa y el ácido catalizado-Flujos de trabajo de rotulación Emplear

Esta presentación demuestra los flujos de trabajo para la marcación con isótopos estables de digestos proteicos y péptidos sintéticos, empleando agua enriquecida con oxígeno 18. Primero, en el experimento de curso temporal paleo catalizado por proteasa, se incuban el sustrato y la proteasa en presencia de agua enriquecida al 50 % con oxígeno 18 para incorporar átomos de oxígeno 18. Luego, si la proteasa es capaz de marcación doble, se repite la incubación de los productos posteriores a la escisión de la digestión con la proteasa de interés en presencia de agua enriquecida al 50 % con oxígeno 18.

El flujo de trabajo EO realiza la incorporación catalizada por ácido de átomos de oxígeno 18 en grupos funcionales a intervalos de tiempo determinados. Se aplican alícuotas de las mezclas de reacción con matriz sobre placas objetivo con moho, y la adquisición de datos mediante espectrometría de masas genera gráficos espectrales en función del tiempo de las reacciones de escisión de péptidos, así como gráficos de incorporación de oxígeno 18. Los productos de escisión marcados, correspondientes a especies peptídicas individuales, se seleccionan para la identificación de secuencias basada en MS/MS. En última instancia, estos flujos de trabajo ofrecen herramientas versátiles para estudios proteómicos cualitativos y cuantitativos.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de investigación de proteasas, como la identificación de la velocidad, los pasos limitantes y los intermediarios de reacción en vías proteolíticas complejas. Las firmas proteolíticas identificadas mediante el curso temporal paleo proporcionan datos importantes sobre la especificidad del sustrato. Además, los temporizadores de datos también utilizan información cinética.

Un posdoctorado de mi laboratorio demostrará ahora el procedimiento. El protocolo cronológico paleo monitorea la dinámica de reacciones de escisión proteolítica basándose en la incorporación de oxígeno 18 catalizada por proteasa; para la reacción de 20 microlitros, agregue los péptidos de la muestra al tampón de reacción de proteasa que contiene agua enriquecida con oxígeno 18, mezcle 0,5 microlitros de la mezcla de reacción con 0,5 microlitros de matriz y aplique en un punto de una placa MALDI de 384 puntos y deje secar las gotas de disolvente a temperatura ambiente. Mientras tanto, divida la mezcla de reacción en dos tubos.

Control y muestra para el tubo de muestra. Añada la proteasa de interés e incube a la temperatura recomendada para la reacción enzimática. Añada los puntos de tiempo especificados.

Retire un alícuota de 0,5 microlitros para mezclarla con 0,5 microlitros de matriz y aplique la mezcla en la placa de múltiples objetivos. Proceda a analizar la dinámica de la reacción mediante análisis de MS MALDI-TOF según se describe más adelante en este protocolo de etiquetado posterior a la digestión. SN produce enzimas como la tripsina, que catalizan la reacción de intercambio de oxígeno carboxílico para incorporar oxígeno-18. Después de realizar una digestión proteica sin etiquetado con oxígeno-18, pase los productos de escisión a través de una columna giratoria pep clean C18 para eliminar las actividades proteásicas residuales.

Luego, reuspenda las muestras en 20 microlitros de tampón de reacción de tripsina que contenga agua enriquecida con oxígeno 18. Tome una alícuota de 0,5 microlitros y mézclela con un volumen igual de matriz. A continuación, coloque una gota sobre una placa objetivo MALDI de 384 puntos Opti-Off y deje secar al aire.

A continuación, divida la solución de reacción en tubos de control y tubos de muestra para el tubo de muestra. Añada tripsina e incube a 37 grados Celsius. Para monitorear la reacción, retire una alícuota de 0,5 microlitros.

Mezcle con 0,5 microlitros de matriz y aplique en una placa de maltar. Analice la dinámica de esta reacción de intercambio de oxígeno carboxílico mediante análisis Maldi Toof MSM S. El flujo de trabajo de curso temporal IEO depende de las reacciones de intercambio de oxígeno carboxílico catalizadas por ácido en los grupos laterales y terminales ácidos de los péptidos.

Primero, incube 50 nanomolares de péptidos individuales con agua enriquecida con oxígeno 18 en una proporción uno a uno, en presencia o ausencia de ácido tricloroacético al 0,1 % final. Tome alícuotas de 0,5 microlitros de la reacción diariamente durante 48 días y co-puncione directamente con la matriz sobre una placa objetivo para MALDI. Envíe regularmente la placa objetivo para MALDI para análisis del producto mediante espectrometría de masas TOF-TOF. Esta sección se describe detalladamente en el manuscrito adjunto.

Primero, adquiera espectros de MS en modo de iones positivos por triplicado. Después de calibrar el múltiplo y configurar la adquisición de MS, adquiera disparos individuales para subespectros. A continuación, exporte los archivos de datos de MS desde el software de adquisición de datos Explorer serie 4,000.

Luego, importe a un sistema de información interno que utilice el software Mascot Distiller para el procesamiento espectral y la detección de picos. Desconvolucione los envoltorios isotópicos y determine automáticamente las proporciones de incorporación de oxígeno 18; anote las proporciones de incorporación de oxígeno 18 como las contribuciones relativas de las especies isotópicas individuales del péptido al envoltorio isotópico completo. Filtre la lista de intervalos y agrupe al menos tres valores con un ancho de masa de 100 PP m para cada experimento de curso temporal.

Extraiga las masas moleculares de todas las especies de péptidos detectadas a partir de los archivos de datos de MS asociados. Ahora, utilizando X pacey, busque el conjunto de péptidos con una tolerancia de error de masa de 200 PPM. Compare la lista de picos con los datos de los productos de escisión proteolítica predichos a partir de la secuencia del péptido sustrato.

Proceda a adquirir espectros de msms para todos los valores de masa de los productos de escisión predichos por la herramienta find pep y para los valores de bin que tengan incorporaciones de oxígeno 18 asociadas. Recopile datos de MSM S de 50 disparos en un patrón aleatorizado por subespectro, con hasta 40 subespectros por punto, y exporte los archivos de msms. Luego, exporte los archivos de datos de MSM S al sistema de análisis para la detección de picos y las listas de picos de MSM S asociados con los datos de MS de curvatura correspondientes para la identificación de péptidos.

Establezca estos parámetros de búsqueda en el motor de búsqueda Mascot: sin especificidad enzimática, tolerancias de masa de 150 PPM para el ion precursor y de 0,2 Dalton para los iones fragmento. Busque las listas M-S-M-S-P en la base de datos Swiss-Prot. Las identificaciones de péptidos también pueden validarse adicionalmente mediante software de exploración de datos, confirmando los patrones característicos de incorporación de oxígeno 18 en todos los iones fragmento para los gráficos temporales espectrales.

Exporte los archivos de datos de MS para cada punto de tiempo de reacción desde el software explorador de datos a archivos ASCI utilizando un macro. Luego importe los archivos a un programa de análisis de datos y gráficos y muéstrelos como gráficos de cascada para crear gráficos de incorporación de oxígeno 18 para cada curva. A partir del producto de escisión del péptido, extraiga las contribuciones relativas de las especies isotópicas individuales del péptido en todos los puntos de tiempo de reacción, y luego grafíquelas en función del tiempo.

Los gráficos espectrales en función del tiempo como este muestran la dinámica de las reacciones de escisión proteolítica. Este experimento analiza la escisión del péptido bioactivo endo y C por la enzima convertidora del endotelio uno. Una disposición en cascada representa los espectros de MS de los experimentos de curso temporal paleo para monitorear simultáneamente la degradación del sustrato y la aparición de productos intermedios y finales.

Los productos de escisión se identifican mediante MSMS y las firmas características de incorporación de oxígeno 18 en sus envolturas isotópicas. Este mecanismo de reacción de la tripsina indica que las proteasas de corte median la incorporación de hasta dos átomos de oxígeno 18 en los productos de escisión peptídica. En el flujo de trabajo de etiquetado basado en proteasas, la reacción de escisión del enlace peptídico da como resultado una proporción de incorporación del 50 % de oxígeno 18 simple para productos de escisión peptídica recién generados; proteasas como la tripsina que vuelven a unirse a los productos de la reacción catalizan además la incorporación de un segundo átomo de oxígeno 18 mediante la reacción de intercambio de oxígeno carboxílico.

En el equilibrio, el marcador oxígeno 18 se distribuye en una proporción de uno a dos a uno en los productos no marcados, marcados una vez y doblemente marcados. En el protocolo de marcado previo a la digestión de los extremos proteolíticos, no ocurren escisiones del enlace peptídico. En cambio, la incorporación de hasta dos átomos de oxígeno 18 se basa exclusivamente en la reacción de intercambio del oxígeno carboxílico.

Por lo tanto, la incorporación de oxígeno 18 solo ocurre con las proteasas que vuelven a unirse a sus productos de escisión peptídica. La marcación con oxígeno 18 catalizada por ácido conduce a la incorporación de dos átomos de oxígeno 18 por cada grupo carboxilo. A lo largo de este experimento, los múltiples desplazamientos de masa de dos Dalton en el perfil isotópico de la angiotensina I pueden rastrearse mediante la absorción de átomos de oxígeno 18.

Al combinar la etiquetación con OPE y la espectrometría de masas de alta resolución de manera cronometrada, el método de curso temporal paleo permite un análisis dinámico de la generación de productos peptídicos. Este ensayo puede utilizarse para generar péptidos etiquetados tópicamente estabilizados para estudios proteómicos cuantitativos y cualitativos, así como para evaluar la cinética con la que se generan los péptidos Protopic.

El curso temporal Paleo está diseñado para evaluar vías proteolíticas bajo condiciones fisiológicamente relevantes. Esta técnica allanó el camino para nuestro reciente estudio de procesos líticos en microentornos del cáncer humano.