Name: Proteasa y el ácido catalizado-Flujos de trabajo de rotulación Emplear 18 O-agua enriquecida (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprende flujos de trabajo de marcado con isótopos estables usando agua enriquecida con 18O para estudios proteómicos cuantitativos y cualitativos. Estos métodos permiten analizar dinámicas de proteólisis con espectrometría de masas.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH / NIDCR subvención 1R01DE019796.

Los flujos de trabajo presentados Leo-permitir el etiquetado de isótopos estables de proteínas digiere y péptidos sintéticos. Estos experimentos de tiempo (Figura 1) son aplicables a los estudios de proteómica comparativa y cuantitativa así como la investigación de proteasa. Cada flujo de trabajo consta de dos pasos experimentales (Figura 2): A) El tiempo de muestreo resuelto de la respectiva 18 O-isótopos estables codificada reacción (proteasa de escisión catalizada por péptido; proteasa catalizada carboxilo reacción de intercambio de oxígeno; catalizada por ácido intercambio de oxígeno carboxilo reacción) y análisis B) por espectrometría de masas y la representación gráfica de 18-O incorporación cinética. A. Experimentos timecourse I. paleo-timecourse: Proteasa catalizada etiquetado de escisiones proteolíticas <ol><li> (Opcional) Los enlaces disulfuro de las proteínas (10 mM) y péptidos (250 mM) se redujo con DTT (concentración final 2,5 mM)en 25 mM NH 4 HCO 3 (ambos recién preparada) por incubación durante 30 min a 50 ° C. </li><li> (Opcional) cisteínas libres se alquiló con yodoacetamida (concentración final 10 mM) en 25 mM NH 4 HCO 3 por incubación durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Dependiendo de la proteasa de interés, la proteína / péptido soluciones deben ser limpiada para eliminar el tampón residual y el agente de alquilación. Use PepClean columnas C-18 spin (Thermo) para la limpieza de péptido y Vivaspin concentradores centrífugos (Sartorius) para el intercambio de tampones para muestras de proteínas. </li><li> Volver a disolver / péptidos / proteínas de cambio en 20 l tampón de reacción de la proteasa (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5,5; tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) que contenía 1:1 (v / v) final H 2 18 O (95%, Sigma Isotec). </li><li> Retirar una muestra de tiempo cero antes de la adición de la proteasa: Mezclar 0,5 l de la mezcla de reacción y 0,5 l de alfa ciano-4-hidroxicinámicomatriz de ácido (10 mg / ml en 50% de acetonitrilo, 0,1% de TFA). Extender la muestra en un Opti-TOF 384 placa de MALDI objetivo (AB SCIEX) y dejar que las gotas de disolvente a temperatura ambiente hasta que se seque (aproximadamente 5 minutos). </li><li> Dividir la solución de reacción en dos alícuotas. La primera alícuota se incubaron con la proteasa de interés (ECE-1: 75 nM; tripsina: 0,04 nM) a temperatura ambiente o la temperatura recomendada para la enzima particular. La segunda alícuota se incubó sin proteasa y servirá como muestra de control. La primera alícuota representa una muestra estándar para la proteasa catalizada por O-18 etiquetado y puede ser utilizado para el péptido y la identificación de proteínas, detección de las actividades proteolíticas y seguimiento de las reacciones de escisión proteolítica. La segunda alícuota se usa para mostrar que 18 O-incorporación es inducida por la proteasa, por lo tanto, no etiquetado ni escisión se espera para esta muestra. </li><li> Siga la reacción mediante la eliminación de alícuotas de reacción y manchado como described del paso 5 a intervalos de tiempo como parece conveniente. Las condiciones de reacción descritas anteriormente se utilizan para controlar una reacción proteolítica para hasta cuatro días (aproximadamente 24 puntos). Iniciar el muestreo cada 5 min hasta 30 min, luego detectar cada 30 min hasta 2 h, después cada hora hasta 8 horas y cada 8 h hasta 4 días. Productos de escisión debe aparecer dentro de las primeras 12 horas y el sustrato debe estar completamente hidrolizada después de 24 horas. Tiempos de incubación prolongados de reacción permiten definir los productos de reacción que son estables discreta a partir de intermedios de reacción, que son objeto de transformación. Dependiendo de la pregunta de investigación y dados pares enzima-sustrato, los tiempos y temperaturas de incubación manchado tiene que ser modulada para asegurar el muestreo reacción óptima. </li><li> Después de que el punto de reacción se vio por última vez o en intervalos extendidos entre manchas, la placa de MALDI objetivo es sometido a MALDI-TOF/TOF MS / MS análisis como se describe más adelante (Sección B). </li></ol> II. Paleo-timecourse: Postdigestion etiquetado de termini proteolíticas <ol><li> (Opcional) Los enlaces disulfuro de las proteínas (10 mM) y péptidos (250 mM) se redujo con DTT (concentración final 2,5 mM) en 25 mM NH 4 HCO 3 (ambos recién preparado) por incubación durante 30 min a 50 ° C. </li><li> (Opcional) cisteínas libres se alquiló con yodoacetamida (concentración final 10 mM) en 25 mM NH 4 HCO 3 por incubación durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Dependiendo de la proteasa de interés, la proteína / péptido soluciones deben ser limpiada para eliminar el tampón residual y el agente de alquilación. Utilice columnas PepClean C-18 para la limpieza de spin péptido y Vivaspin concentradores centrífugos para el intercambio de proteína buffer. </li><li> Volver a disolver / cambiar los productos limpiado de péptidos / proteínas en 20 l tampón de reacción de la proteasa (por ejemplo tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) y se digiere con proteasa de interés para la terminación (por ejemplo, tripsina: 0,04 nM; 37 ° C; 12 hr). </li><li> Productos de limpieza de escisión con columnas PepClean C-18 espín. Este paso eliminará las actividades residuales de proteasa. </li><li> Volver a disolver / cambiar los productos limpiado de péptidos en tampón de 20 l reacción de la proteasa (tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) que contenía 1:1 (v / v) final H 2 18 O. </li><li> Retirar una muestra de tiempo cero antes de la adición de enzima: Mezclar 0,5 l de la mezcla de reacción y 0,5 l de alfa ciano-4-hidroxicinámico (10 mg / ml en 50% de acetonitrilo, 0,1% de TFA). Punto de la muestra en una placa diana MALDI y dejar las gotitas de disolvente a temperatura ambiente hasta que se seque (aproximadamente 5 min). </li><li> Dividir la solución de reacción en dos alícuotas. La primera alícuota se incubaron con proteasa de interés (por ejemplo, tripsina: 0,04 nM) a temperatura ambiente o la temperatura recomendada para la enzima particular. La segunda alícuota se incubó sin proteasa y servirá como un control. La primeraalícuota representa una muestra estándar para la proteasa catalizada por 18 O-postdigestion etiquetado y puede ser utilizado para el péptido y cuantificación de proteínas. La segunda alícuota se usa para mostrar que 18 O-incorporación es catalizada por la proteasa, por lo tanto, no etiquetado se esperaba para esta muestra. </li><li> Seguir la reacción por la eliminación de alícuotas de reacción y manchado como se describe en el paso 7.) A intervalos de tiempo como parece conveniente. Por ejemplo, hemos descubierto inicialmente cada 5 minutos durante hasta 30 min y cada 15 min después de que para controlar la reacción de intercambio de oxígeno carboxilo catalizada por tripsina. </li><li> Después de que el punto de reacción se vio por última vez o en intervalos extendidos entre manchas de la placa de MALDI objetivo es sometido a MALDI-TOF/TOF MS / MS análisis como se describe más adelante (Sección B). </li></ol> III. Aleo-timecourse: catalizada por ácido etiquetado de grupos carboxilo <ol><li> Incubar péptidos individuales (50 nM) con 1:1 (v / v) 18 O-agua enriquecida en tél presencia o ausencia (control) de 0,1% (v / v) de ácido trifluoroacético definitiva (volumen total de 30 l). </li><li> Muestra los productos de reacción al día durante 48 días por co-spotting una alícuota de 0,5 l de la mezcla con 0.5μl matriz de ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico (10 mg / ml en 50% de acetonitrilo, 0,1% de TFA) directamente en una diana MALDI plato. </li><li> Entre los intervalos de aplicación, y después de ver el punto de reacción por última vez presentar placa MALDI objetivo para MALDI-TOF/TOF MS / MS análisis como se describe a continuación en la Sección B. </li></ol> B. MALDI-TOF/TOF MS / MS de adquisición de datos y análisis <ol><li> Los espectros de masas se adquieren en un 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer (AB SCIEX). </li><li> Antes del análisis, el instrumento se calibra con una mezcla de péptidos estándares (Kit de estándares de masa para la calibración de AB SCIEX TOF / TOF instrumentos) con una tolerancia de error de masa máxima de medición de ± 50 ppm y un número mínimo de seis picos para que coincida. </li><li> MS espectros (rango de masas400 - 4.000 m / z) son adquiridos por triplicado utilizando el modo de ion positivo con una intensidad de láser ajustable (3.400 - 3.800; tamaño de paso 50) con un rango de intensidad de base aceptable pico de 2.000 - 45.000. TOMA DE hayan sido adquiridos con sub-espectros, con 400 golpes totales / espectro, deje de condiciones entrarán en vigor después de 800 sub-espectros se adquieren (aprobado o suspenso) o 400 espectros sub-criterios de aceptación de pase. En caso de poco abundantes muestras o en presencia de complejos orígenes biológicos el extremo inferior del rango de detección MS debería elevarse a 800 m / z. Además, puede ser necesario para eliminar la sal y otros compuestos que interfieren con un paso de limpieza de la muestra como se ha descrito anteriormente o mediante la separación LC. </li><li> MS archivos de datos (. DT2 archivos) se exportan desde el 4000 Series software de adquisición de datos y el Explorador de importación en nuestro propio sistema de información de laboratorio, que utiliza software MASCOTA Distiller (Matrix Science) para el procesamiento espectral y detección de picos. Sobres isotópicosson desconvolucionado y 18 O-incorporación coeficientes determinados automáticamente usando un algoritmo similar a la descrita por Mason et al. 12 y adaptada por nuestro grupo 9. Alternativamente, las herramientas de software, tales como ZoomQuant 13 y Viper 14, así como paquetes de software comerciales tales como BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) y cuantificación Mascot Distiller Toolbox (Matrix Science) puede deconvolute 18 O-tipo de datos 15,16. 18 O-incorporación relaciones se expresan como las contribuciones relativas de las distintas especies de isótopos de péptidos (es decir, los péptidos que contienen 16 O, 18 O 18 O 1 o 2) a la envolvente isotópica entero. </li><li> Para cada experimento timecourse, las masas moleculares ([M + H] +) para todas las especies de péptidos detectados son extraídos de los archivos asociados de datos de MS y los valores agrupada en una anchura de 100 ppm en masa. </li><li> Lal menos tres [M + H] + se fijan para ser requerido para llenar un contenedor. En caso de sustratos conocidos, la lista bin filtrada se compara con una lista de los productos de escisión proteolítica predecir a partir de la secuencia del péptido sustrato utilizando la herramienta ExPASy FindPept 17 ( <a href="http://au.expasy.org/tools/findpept.html" target="_blank">http://au.expasy.org/tools/findpept.html</a> ) y un 200 ppm en masa error de tolerancia de aceptación. </li><li> MS / MS espectros se adquieren para todos los valores de masa de los productos de escisión predichos por la herramienta FindPept y para valores en intervalos que tienen 18 O-incorporaciones asociados con ellos. MS / MS datos se adquieren en el 4800 MALDI TOF / TOF Analizador 1kV en modo reflector de iones positivos, con una intensidad del láser fijo de 4200 y CID-gas en el modo de apagado. 50 disparos se adquieren en un patrón aleatorio por sub-espectro, hasta un total de 40 sub-espectros por punto (lo que da un total de 2.000 disparos / in situ). </li><li> MS / MS archivos de datos (. DT2 archivos) se exportan desde la Explo 4000 Seriesrer software de adquisición de datos e importados en nuestro propio sistema de información de laboratorio, se detectan los picos y MS / MS de las listas de pico están asociados con los correspondientes datos de MS agrupadas. </li><li> Para la identificación de péptidos, MS / MS listas de los picos se registraron en contra de la base de datos SwissProt utilizando el motor de búsqueda MASCOT con los siguientes parámetros de búsqueda: ninguna especificidad enzimática, 150 ppm de ion precursor y 0,2 Da tolerancias de iones de fragmentos de masa. </li><li> Péptido identificaciones, además, puede ser validada usando el software Data Explorer (AB SCIEX) confirmando las características 18 O-incorporación patrones a través de los fragmentos de iones y de la serie según lo descrito por Shevchenko et al. 18. </li></ol> C. Preparación del Tiempo espectral y 18 parcelas incorporación O- Diagramas espectrales de tiempo: MS archivos de datos (. DT2 archivos) para cada punto de tiempo de reacción se exportan desde el software del explorador de datos como ASCII-archivos usando unamacro e importados a un análisis de datos y el programa de software gráfico (por ejemplo, por OriginLab origen) y se muestran como gráficos de cascada (figura 3). 18 O-incorporación parcelas: Para cada producto de división del péptido binned, las contribuciones relativas de las distintas especies de péptidos de isótopos (16 O, 18 O 18 O 1 o 2) se extraen a través de todos los puntos de tiempo de reacción y en función del tiempo (Figura 4).

<ol><li>Bender, M., Kemp, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-18+Studies+of+the+Mechanism+of+the+alpha-Chymotrypsin-catalyzed+Hydrolysis+of+Esters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters.</a> Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).</li>
<li>Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pepsin-catalyzed+exchange+of+oxygen+atoms+between+water+and+carboxylic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).</li>
<li>Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanisms+of+action+of+proteolytic+enzymes+using+heavy+oxygen+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange.</a> European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).</li>
<li>Fenselau, C., Yao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18O2-labeling+in+quantitative+proteomic+strategies%3A+a+status+report%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).</li>
<li>Miyagi, M., Rao, K. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+18O-labeling+strategies+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics.</a> Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).</li>
<li>Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18O+stable+isotope+labeling+in+MS-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct.+Genomic+Proteomic%22%5BJournal%5D)">18O stable isotope labeling in MS-based proteomics.</a> Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).</li>
<li>Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometry+in+proteomics%3A+a+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).</li>
<li>Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+proteolytic+18O+labeling%3A+endoprotease-catalyzed+16O-to-18O+exchange+of+truncated+peptide+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates.</a> Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).</li>
<li>Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometry-based+strategy+for+detecting+and+characterizing+endogenous+proteinase+activities+in+complex+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples.</a> Proteomics. 8, 435-445 (2008).</li>
<li>Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+endothelin-converting+enzyme-1%3A+a+regulator+of+beta-arrestin-dependent+ERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).</li>
<li>Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemoglobin+cleavage+site-specificity+of+the+Plasmodium+falciparum+cysteine+proteases+falcipain-2+and+falcipain-3%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3.</a> PLoS ONE. 4, e5156(2009).</li>
<li>Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+automatically+interpreting+mass+spectra+of+18O-labeled+isotopic+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).</li>
<li>Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+and+identification+using+18O+labeling+with+an+ion+trap+mass+spectrometer+and+the+analysis+software+application+%22ZoomQuant%26quot%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant&quot.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).</li>
<li>Qian, W. -J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-catalyzed+oxygen-18+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics.</a> Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).</li>
<li>Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+method+for+computing+%2818%29O%2F%2816%29O+ratios+of+differentially+stable-isotope+labeled+peptides+in+the+context+of+postdigestion+%2818%29O+exchange%2Flabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling.</a> Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).</li>
<li>Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveying+proteolytic+processes+in+human+cancer+microenvironments+by+microdialysis+and+activity-based+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry.</a> Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).</li>
<li>Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FindPept%2C+a+tool+to+identify+unmatched+masses+in+peptide+mass+fingerprinting+protein+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification.</a> Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).</li>
<li>Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+%27de+novo%27+peptide+sequencing+by+a+combination+of+nanoelectrospray%2C+isotopic+labeling+and+a+quadrupole%2Ftime-of-flight+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).</li>
<li>Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-catalyzed+oxygen-18+labeling+of+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides.</a> Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).</li>
<li>Bender, M., Stone, R., Dewey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+Isotopic+Oxygen+Exchange+between+Substituted+Benzoic+Acids+and+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).</li>
<li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Mediante la combinación de etiquetado de isótopos estables y de alta resolución de la espectrometría de masas en una manera resuelta en el tiempo, el método de paleo-timecourse permite un análisis dinámico de la generación de productos peptídicos. El ensayo se puede utilizar para generar péptidos marcados con isótopos estables para estudios de proteómica cuantitativos y cualitativos, y para evaluar la cinética por el que los péptidos proteotípicos se generan. Además, paleo-timecourse está diseñado para evaluar las vías ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> PepClean C-18 spin columnas </td><td> Thermo </td><td> 89870 </td></tr><tr><td> Opti-TOF 384 MALDI tablilla de puntería </td><td> AB SCIEX </td><td> 1016629 </td></tr><tr><td> 4800 MALDI TOF / TOF </td><td> AB SCIEX </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Materiales <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Alfa ciano-4-hidroxicinámico </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 70990-1G-F </td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino (BSA) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A3294-10G </td></tr><tr><td> Ditiotreitol (DTT) </td><td&gt; Acros </td><td> 16568-0050 </td></tr><tr><td> Yodoacetamida (IAM) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1149-5G </td></tr><tr><td> Conversión de la endotelina enzima-1 (ECE-1) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 1784-ZN </td></tr><tr><td> Tripsina Oro </td><td> Promega </td><td> V5280 </td></tr><tr><td> Water-18 O, 97% atómico 18 O </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 329878-1G </td></tr><tr><td> Se añadió ácido trifluoroacético (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> Normas Kit Misa para la calibración de AB Sciex TOF / TOF instrumentos </td><td> AB SCIEX </td><td> 4333604 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Reactivos

proteasa y el ácido catalizado-flujos de trabajo de rotulación emplear<sup&gt; 18</sup&gt; o-agua enriquecida

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Los isótopos estables son herramientas esenciales en la espectrometría de masa biológica. Históricamente, 18 O-isótopos estables se han utilizado ampliamente para estudiar los mecanismos catalíticos de enzimas proteolíticas 1-3. Con el advenimiento de la espectrometría de masas basado proteómica, la incorporación catalizada enzimáticamente de 18 átomos de O de agua estable enriquecido isotópicamente se ha convertido en un método popular para comparar cuantitativamente los niveles de expresión de proteína (revisado por Fenselau y Yao 4, Miyagi y Rao 5 y Ye et al. 6). 18 O-etiquetado constituye una alternativa simple y de bajo costo a los productos químicos (por ejemplo, iTRAQ, ICAT) y metabólicos (por ejemplo SILAC) técnicas de marcado 7. Dependiendo de la proteasa utilizada, 18 O-etiquetado puede dar lugar a la incorporación de hasta dos 18 átomos de O en el grupo carboxilo C-terminal del producto de escisión 3 </sup&gt;. La reacción de marcaje se puede subdividir en dos procesos independientes, la escisión del enlace peptídico y la reacción de oxígeno intercambio carboxilo 8. En nuestro Paleo (p rotease-a e l Abeling ssisted mploying 18 O agua enriquecida) la adaptación enzimática de 18 O-etiquetado, se utilizó 50% 18 O enriquecida con agua para producir firmas isotópicas distintivas. En combinación con la alta resolución de láser asistida por matriz de ionización de desorción tiempo de vuelo espectrometría de masas tándem (MALDI-TOF/TOF MS / MS), los sobres de isótopos característicos se puede utilizar para identificar los productos de escisión con un alto nivel de especificidad. Anteriormente ha utilizado el paleo-metodología para detectar y caracterizar proteasas endógenas 9 y controlar las reacciones proteolíticas 10-11. Desde Paleo codifica la esencia misma de la reacción de escisión proteolítica, el montaje experimental es enri sencillo y bioquímicospasos chment de productos de escisión se puede evitar. El paleo-método se puede extender fácilmente a (i) experimentos de tiempo de los cursos que controlan la dinámica de las reacciones de escisión proteolítica y (ii) el análisis de la proteólisis en muestras biológicas complejas que representan las condiciones fisiológicas. Paleo-timecourse experimentos ayudan a identificar limitación de la velocidad de procesamiento y pasos intermedios de reacción en situaciones complejas de reacciones proteolíticas vía. Además, el paleo-reacción nos permite identificar las enzimas proteolíticas tales como la tripsina proteasa de serina que es capaz de volver a enlazar sus productos de escisión y catalizar la incorporación de un segundo átomo de O 18. Tales &quot;doble etiquetado&quot; enzimas se pueden utilizar para postdigestion 18 O-etiquetado, en la que los péptidos están etiquetados exclusivamente por la reacción de intercambio de oxígeno carboxilo. Nuestra tercera estrategia se extiende etiquetado empleando 18 O agua enriquecida más allá de las enzimas y utiliza las condiciones ácidas de pH para introducir 18 O-isótopo estable signoturas en péptidos.

Se utilizó el flujo de trabajo de paleo-timecourse para controlar dinámicamente la incorporación de 18 O-isótopos estables en productos de división de péptidos generados por las enzimas proteolíticas. El enfoque que se presenta es una herramienta versátil para estudiar comparativamente las vías proteolíticas procesamiento de sustrato diferente y combinaciones de la proteasa. Mediante el muestreo de reacciones proteolíticas repetidamente en el transcurso de la reacción, el experimento paleo-timecourse ofrece i...

Estables flujos de trabajo que emplean isótopos de etiquetado<sup&gt; 18</sup&gt; O-agua enriquecida (Leo-flujos de trabajo) son herramientas versátiles para estudios de proteómica cuantitativa y cualitativa. En los flujos de trabajo asistidas proteasa-(paleo),<sup&gt; 18</sup&gt; Átomos de O son introducidos por la escisión proteolítica y carboxilo reacciones de intercambio de oxígeno mediada por proteasas. En el catalizada por ácido (Aleo) flujo de trabajo,<sup&gt; 18</sup&gt; Átomos de O son introducidos por intercambio de oxígeno carboxilo a pH bajo.

Proteasa y el ácido catalizado-Flujos de trabajo de rotulación Emplear<sup&gt; 18</sup&gt; O-agua enriquecida

Los isótopos estables son herramientas esenciales en la espectrometría de masas biológica. Históricamente, los isótopos estables de 18O se han utilizado ampliamente para estudiar la catálisis...

Esta presentación demuestra los flujos de trabajo para la marcación con isótopos estables de digestos proteicos y péptidos sintéticos, empleando agua enriquecida con oxígeno 18. Primero, en el experimento de curso temporal paleo catalizado por proteasa, se incuban el sustrato y la proteasa en presencia de agua enriquecida al 50 % con oxígeno 18 para incorporar átomos de oxígeno 18. Luego, si la proteasa es capaz de marcación doble, se repite la incubación de los productos posteriores a la escisión de la digestión con la proteasa de interés en presencia de agua enriquecida al 50 % con oxígeno 18.El flujo de trabajo EO realiza la incorporación catalizada por ácido de átomos de oxígeno 18 en grupos funcionales a intervalos de tiempo determinados. Se aplican alícuotas de las mezclas de reacción con matriz sobre placas objetivo con moho, y la adquisición de datos mediante espectrometría de masas genera gráficos espectrales en función del tiempo de las reacciones de escisión de péptidos, así como gráficos de incorporación de oxígeno 18. Los productos de escisión marcados, correspondientes a especies peptídicas individuales, se seleccionan para la identificación de secuencias basada en MS

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Leucina ricos repetir las quinasas 1 y 2 (LRRK1 y LRRK2) son proteínas multidominio que codifican tanto GTPasa y dominios quinasa y que son fosforilados en las células. Aquí, se presenta un protocolo para etiquetar LRRK1 y LRRK2 en las células con 32 P ortofosfato, proporcionando así un medio para medir sus niveles generales de fosforilación celular.

Metabólicas etiquetado de repeticiones ricas en leucina quinasas 1 y 2 con Radioactive Fosfato

Etiquetado de isótopos estables de péptidos por dimethylation reductora (etiquetado REDI) es una estrategia rápida, de bajo costo para la proteómica precisas de masa basados ​​en espectrometría cuantitativos. Aquí se demuestra un método robusto para la preparación y el análisis de mezclas de proteínas utilizando el enfoque Redi que se puede aplicar a casi cualquier tipo de muestra.

Proteómica cuantitativos utilizando reductiva dimethylation de isótopos estables de etiquetado

ADN y las proteínas se marcan secuencia específicamente con afinidad o grupos indicadores fluorescentes usando ADN o de proteínas metiltransferasas y análogos sintéticos de cofactor. Dependiendo de la especificidad de cofactor de las enzimas, aziridina o dobles análogos de cofactores activados se emplean para el etiquetado de uno o dos pasos.

Etiquetado específico de secuencia de ácidos nucleicos y proteínas con metiltransferasas y el cofactor Análogos

Aquí, presentamos un protocolo para introducir sondas químicas específicas en un fragmento de anticuerpo mediante la incorporación genética de un aminoácido que contiene azida, y posteriormente acoplar la azida con una sonda química mediante cicloadición de azida-alquino promovida por cepa (SPAAC).

Eficiente y específica del sitio del anticuerpo etiquetado por cicloadición de azida-alquino Strain-promovido

Combinado precursor de marcaje isotópico y etiquetado isobárico (cPILOT) es una estrategia proteómica cuantitativa que mejora las capacidades de multiplexación de muestra de las etiquetas isobáricas. Este protocolo describe la aplicación de cPILOT a los tejidos de los controles de modelo de ratón de la enfermedad y de tipo salvaje de un Alzheimer.

Muestra mejorada Multiplexing de tejidos usando combinada Precursor isotópico etiquetado y isobárico Tagging (cPILOT)

Este protocolo describe un procedimiento experimental cuantitativa y comprensivo investigar el metabolismo de múltiples fuentes de nutrientes. Este flujo de trabajo, basado en una combinación de experimentos de trazador isotópico y de un procedimiento analítico permite el destino de los nutrientes consumidos y el origen metabólico de moléculas sintetizado por microorganismos a determinar.

Flujo de trabajo basado en la combinación de trazador isotópico experimentos para investigar el metabolismo microbiano de múltiples fuentes de nutrientes

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la homogeneidad de etiquetado para cada especie de proteína en una muestra de proteína compleja en el nivel de molécula única.

Cuantificación de todo el proteoma de etiquetado homogeneidad en el nivel de molécula única

El uso de uracilo tiolado para purificar sensible y específicamente el ARN recién transcrito de la levadura Saccharomyces cerevisiae.

Etiquetado metabólico extremadamente rápido y específico de ARN In Vivo con 4-Thiouracil (Ers4tU)

La oxidación de la proteína tiol tiene implicaciones significativas en condiciones fisiológicas y fisiopatológicas normales. Describimos los detalles de un método cuantitativo de proteómica redox, que utiliza captura asistida por resina, etiquetado isobárico y espectrometría de masas, lo que permite la identificación y cuantificación de proteínas de cisteína oxidadas reversibles.

Captura asistida por resina junto con etiquetado de etiqueta de masa isobárica en tándem para la cuantificación multiplexada de la oxidación de la proteína tiol

La capacidad de medir la cinética de liberación de vesículas puede ayudar a dar una idea de algunos de los fundamentos de la neurotransmisión. Aquí hemos utilizado imágenes en tiempo real de las vesículas marcadas con el tinte rojo fluorescente FM 4-64 para medir la velocidad de liberación de la vesícula presináptica en cultivos neuronales del hipocampo.

La medición de la exocitosis en las neuronas de un etiquetado FM

Aprende flujos de trabajo de marcado con isótopos estables usando agua enriquecida con 18O para estudios proteómicos cuantitativos y cualitativos. Estos métodos permiten analizar dinámicas de proteólisis con espectrometría de masas.

Proteasa y el ácido catalizado-Flujos de trabajo de rotulación Emplear

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