Name: Aislamiento y Análisis del Genoma de viriones individuales utilizando Genómica solo virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Aprende genómica de virus individuales mediante citometría de flujo y amplificación MDA para secuenciación de alto rendimiento. Este método computacional permite identificar virus sin cultivo previo.

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Nos gustaría dar las gracias a Ken Nealson por su visión y asesoramiento durante todo el proceso de preparación de manuscritos.

1. Preparación de suspensiones virales Antes de aislamiento de viriones individuales a través de citometría de flujo, preparar suspensiones virales no fijadas. <ol><li> Aislar partículas virales mediante protocolos previamente establecidos que hacen suspensión viral definitiva que figura en 0.1 micras con filtro TE (Tris-EDTA, pH 8). Se recomienda el uso de filtración de flujo tangencial (TFF) se aproxima a 6 aunque otros métodos han sido desarrollados para el uso de químicos de floculación 7. </li><li> Enumerar las partículas virales mediante protocolos establecidos, por ejemplo, utilizando 8-10 epifluorescencia o citometría de flujo de 11,12. </li><li> Alícuota de suspensión viral en dos tubos Eppendorf (volumen final se recomienda tener 1.000 l). </li></ol> 2. Citometría de Flujo <ol><li> Para clasificar los virus utilizando el BD FACSAria II citómetro de flujo equipado con un PMT dispersión frontal personalizado (FSC PMT), diluir las partículas virales en 0,1 micras de filtración TE, pH 8.0 a un título apropiado para una tasa de eventos de 200 eventos seg -1. </li><li> Establecer umbrales para maximizar raciones señal-ruido, por ejemplo. para un conjunto mixto que contiene partículas de fago T4 y lambda se recomiendan las siguientes: FSC PMT en 1000 y SSC a 200. </li><li> Ejecutar 100 l de muestras &quot;en blanco&quot; que sólo contienen 1) 0,1 micras TE-filtrada, y 2) 0,1 micras TE-filtrada y SybrGreen1 a 1e-4 dilución del stock (10.000 X). </li><li> Ejecutar una pequeña alícuota (se recomienda 100 l) de la suspensión viral sin teñir para evaluar fondo, seguido de la suspensión viral manchada (SybrGreen1 a 1e-4 dilución de stock), las partículas virales a un total de 5.000 eventos cada uno. Esto es para comprobar y ajustar la concentración de puertas de clasificación, si es necesario, antes de la especie. Recomendamos una puerta estrecha en el centro de las partículas virales. Además, para la generación de puertas usamos el SYBR Green y FSC PMT trama. </li><li> Añadir 5 l de 1% bajo punto de fusión (LMP) de agarosa (en tampón TBE) se enfrió a 37 ° C a cada unobien en un politetrafluoroetileno (PTFE) portaobjetos de microscopio (Electron Microscopy Sciences). </li><li> Coloque el portaobjetos de PTFE en el citómetro de flujo para capturar las partículas virales clasificadas. </li><li> Comience tipo de partículas virales manchadas SYBR verde directamente en PTFE diapositivas con LMP agarosa. Se recomienda clasificación 10 o más eventos (partículas virales) en algunos pozos para ayudar en la detección de la profundidad de los virus durante la microscopía láser confocal de barrido (CSLM). </li><li> Al ordenar, retire diapositiva del citómetro de flujo y añadir 5 l más LMP agarosa enfriada a 37 º C a cada pocillo, incorporar tanto la partícula viral (s). </li></ol> 3. Visualizar viriones individuales mediante microscopía confocal Si se desea un solo virión, a continuación, determinar si cada pocillo contiene un virus individual es imperativo y CLSM es necesario visualizar el virión incorporado (s) en 3D para verificar que sólo una sola partícula está presente y que múltiples virusno se apilan en la parte superior de uno al otro. <ol><li> Ajuste el microscopio láser a la longitud de onda de 488 nm de excitación. </li><li> Imagen de las partículas virales integrados utilizando un objetivo de larga distancia de trabajo 63X. </li></ol> 4. Amplificación del genoma entero <ol><li> Una vez los pocillos con virus individuales se identifican con CLSM, lleve a cabo la amplificación del genoma entero utilizando amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) dentro de la agarosa (in situ). </li><li> Para disminuir la probabilidad de introducir contaminación de ADN, eliminar las &#39;bolas&#39; deseadas de agarosa de la corredera y se coloca en un tubo de PCR estéril. Use un par de pinzas estériles y / o hoja de afeitar para este paso. </li><li> Lyse la partícula viral in situ utilizando el calor (94 ° C) durante 3 min en el bloque de calor de un termociclador. </li><li> Realizar recomendaciones la siguiente reacción MDA del fabricante (kit GenomiPhi HY, GE Healthcare) con las siguientes modificaciones <ol><li> Reducir el volumen de la muestra y la reacción bufcias a 11,25 l y se incuba a 30 ° C durante un máximo de 2 horas para reducir la amplificación no específica. </li></ol></li><li> Se purifica el material genómico amplificado mediante la transferencia de ADN genómico (gDNA) a un tubo Eppendorf de 1,7 ml y añadir 1/10 volúmenes de acetato de sodio 3 M (NaOAc) en tampón TBE (mismo tampón utilizado en la preparación de agarosa LMP). </li><li> Colocar la muestra (s) a 55 ° C durante 10 min para disolver agarosa. </li><li> Mueva tubo (s) a 42 ° C para reducir la temperatura antes de la adición de enzima. </li><li> Añadir 2 unidades de β-agarasa a cada tubo y se incuba durante 2 hr. </li><li> Añadir 1 volumen de una solución de fenol saturado con tampón al tubo, mezclar vigorosamente y se centrifuga a 3500 xg durante 15 min. Transferencia de ADN que contiene sobrenadante a un nuevo tubo Eppendorf de 1,7 ml. </li><li> Añadir un volumen de 100% de isopropanol y 1μl de Glycoblue. Mezclar bien por inversión del tubo. </li><li> Centrifugar a 28.000 xg a 4 ° C durante 60 min. Decantar isopropanol asegurándose de no perturbar el sedimento. Añadir 150 l de 70% ethanol a cada tubo. Girar a 28.000 xg y RT durante 10 min. Decantar el etanol, secar al aire el sedimento de ADN y resuspender el ADN en un volumen apropiado de tampón TE. </li><li> Se recomienda repetir los pasos 4.4 a 4.9 con las siguientes modificaciones. Configurar 3-5 MDA reacciones en paralelo y reducir la incubación a 30 ° C y 1 hora. Piscina muestras después de la purificación y precipitado utilizando etanol 95-100% para obtener la concentración deseada. </li></ol> 5. Los resultados representativos La figura 1 resume el proceso de SVG. Estos métodos utilizan citometría de flujo para clasificar partículas virales en portaobjetos de microscopio de PTFE que contienen agarosa para aislar viriones individuales a partir de un conjunto mezclado seguido por la MDA para obtener cantidades de gDNA que son suficientes para la secuenciación. Como prueba de concepto, bacteriófago lambda y T4 se mezclaron y se sometieron al proceso de SVG 11. Una vez viriones fueron capturados y embebidas en agarosa, CLSM was utiliza para visualizar y confirmar que se obtuvo un único virión;. resultados se muestran en la Figura 2 Una vez que se identificaron los pocillos con viriones individuales, que se seleccionaron para la MDA de ADNg. A continuación, utiliza PCR multiplex específico para T4 y lambda para identificar el virión aislado, Figura 3. Un aislado de fago lambda fue seleccionado para la secuenciación del genoma. La secuenciación del genoma se llevó a cabo utilizando la tecnología de 454-titanio y lecturas de secuenciación fueron sometidos a mapeo de referencia para identificar el nivel de cobertura obtenido usando SVG. Figura 4 muestra que se recuperó casi todo el genoma lambda (con la excepción de los primeros 5 pb). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3899/3899fig1.jpg" /> Figura 1. SVG metodología. Suspensiones virales que contienen un conjunto mixto se reducen a partículas virales individuales a través de citometría de flujo que luego sorted en individuales agarosa &quot;cuentas&quot;. El virus está incrustado dentro de la perla de agarosa mediante la superposición con una capa adicional de clasificación de citometría de flujo después de agarosa. Por último, todo el genoma de amplificación se lleva a cabo in situ. <img alt="La figura 2" src="/files/ftp_upload/3899/3899fig2.jpg" /> Figura 2. Micrografía de una partícula viral ordenados incrustado en una perla de agarosa de escaneo láser confocal. A) Reconstrucción tridimensional de una partícula viral Verde I-manchado Sybr dentro de una perla de agarosa. Recuadro: un aumento mayor de la partícula viral aislado B) Perfil parcela de fluorescencia relativa de la partícula viral única manchada dentro de un cordón de agarosa.. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3899/3899fig3.jpg" /> Figura 3. Bacteriófago identificación mediante PCR. A) &lt;/ Strong&gt; Multiplex PCR utilizando primers T4 y lambda-específico para el genotipo, Lanes: 1. TrackIt 1 kb plus escalera (Invitrogen), 2. lambda integrasa (750 pb), 3. Proteína principal de la cápside de T4 (1.050 pb), 4. . Mezcla de lambda integrasa y la principal proteína de la cápside T4 B) Tras lambda específico PCR con loci adicionales para confirmar aún más fago genoma aislamiento, Lanes: 1. Lambda integrasa (750 pb), 2. Represor lambda (356 pb) 3. Lambda sie (exclusión superinfección) (456 pb) 4. TrackIt 1 kb plus escalera (Invitrogen). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3899/3899fig4.jpg" /> La Figura 4. Lambda atributos del genoma y la cobertura. A) GC trama, B) del mapa del genoma de lambda (adaptado de <a href="http://img.jgi.doe.gov" target="_blank">http://img.jgi.doe.gov</a> ) y C) Asignación de SVG lee en el bacteriófago lambda referencia, eje x es posición del genoma, yaxis es% de cobertura.

<ol><li>Raghunathan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+DNA+amplification+from+a+single+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genomic DNA amplification from a single bacterium.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).</li>
<li>Lasken, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genomic+sequencing+using+Multiple+Displacement+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 510-516 (2007).</li>
<li>Ishoey, T., Woyke, T., Stepanauskas, R., Novotny, M., Lasken, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+sequencing+of+single+microbial+cells+from+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples.</a> Curr. Opin. Microbiol. 11, 198-204 (2008).</li>
<li>Edwards, R. A., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Viral metagenomics.</a> Nature Reviews Microbiology. 3, 504-510 (2005).</li>
<li>Rohwer, F., Prangishvili, D., Lindell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+viruses+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Roles of viruses in the environment.</a> Environ. Microbiol. 11, 2771-2774 (2009).</li>
<li>Williamson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+Expedition%3A+metagenomic+characterization+of+viruses+within+aquatic+microbial+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples.</a> PLoS ONE. 3, e1456(2008).</li>
<li>John, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+method+for+concentration+of+ocean+viruses+by+chemical+flocculation%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol.+Rep%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation.</a> Environ. Microbiol. Rep. 3, 195-202 (2011).</li>
<li>Noble, R., Fuhrman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+SYBR+Green+I+for+rapid+epifluorescence+counts+of+marine+viruses+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria.</a> Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).</li>
<li>Hara, S., Terauchi, K., Koike, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance+of+viruses+in+marine+waters%3A+assessment+by+epifluorescence+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Abundance of viruses in marine waters: assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy.</a> Appl. Environ. Microbiol. 57, 2731-2734 (1991).</li>
<li>Hennes, K. P., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+counts+of+viruses+in+natural+waters+and+laboratory+cultures+by+epifluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Limnol.+Oceanogr%22%5BJournal%5D)">Direct counts of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy.</a> Limnol. Oceanogr. 40, 1050-1055 (1995).</li>
<li>Marie, D., Brussaard, C. P. D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+marine+viruses+in+culture+and+natural+samples+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999).</li>
<li>Brussaard, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+bacteriophages+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Enumeration of bacteriophages using flow cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 501, 97-111 (2009).</li>
<li>Allen, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Virus+Genomics%3A+A+New+Tool+for+Virus+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Single Virus Genomics: A New Tool for Virus Discovery.</a> Plos One. 6, (2011).</li>
<li>Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+cloning+using+phi+29+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Un número de factores importantes que hay que tener en cuenta a la hora de aplicar enfoques SVG. Genotipificación, como se lleva a cabo durante el experimento de prueba de concepto 13, no es una opción válida para aislamientos ambientales o desconocidos como cebadores conservados no están disponibles en todos los grupos virales. Además, el fondo síntesis de ADN o la amplificación no específica se ha divulgado durante la amplificación mediante la reacción de MDA 14. Amplificación no específica se ha...

<table><tbody><tr><td>Buffer TE 1X</td><td>Invitrogen</td><td>12090-015</td><td></td></tr><tr><td>Fenol saturado con buffer</td><td>Invitrogen</td><td>15513-039</td><td></td></tr><tr><td>Kit GenomiPhi HY</td><td>GE Healthcare</td><td>25-6600-22</td><td></td></tr><tr><td>Glycoblue</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td>15 mg/ml</td></tr><tr><td>Agarosa LMP</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio PTFE</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63430-04</td><td>24 pocillos, diámetro de 4 mm</td></tr><tr><td>SybrGreen</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td>10.000X</td></tr><tr><td>&amp;#946;-agarasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0392S</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y análisis del genoma de viriones individuales utilizando &quot;genómica solo virus &#39;

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Amplificación del genoma entero y secuenciación de las células microbianas individuales permite la caracterización genómica y sin la necesidad de cultivo de 1-3. Los virus, que son muy abundantes y las más numerosas entidades en nuestro planeta 4 e importante en todos los ambientes, 5 aún no se han puesto de manifiesto a través de enfoques similares. A continuación se describe un método para el aislamiento y la caracterización de los genomas de los viriones single llamado &quot;Genómica Virus única» (SVG). SVG utiliza citometría de flujo para aislar los virus individuales y de todo el genoma de amplificación para obtener ADN genómico de alto peso molecular (gDNA) que se puede utilizar en reacciones de secuenciación posteriores.

Genómica de virus individuales (SVG) es un método para aislar y amplificar los genomas de los viriones individuales. Suspensiones virales de un conjunto mixto se ordenan mediante citometría de flujo en un portaobjetos de microscopio con pozos discretas que contienen agarosa, capturando así el virión y la reducción del genoma cizallamiento durante el procesado posterior. Amplificación del genoma completo se logra mediante la amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) resultante en el material genómico que es adecuado para la secuenciación.

Aislamiento y Análisis del Genoma de viriones individuales utilizando &quot;Genómica solo virus &#39;

La amplificación y secuenciación del genoma completo de células microbianas individuales permiten la caracterización genómica sin necesidad de cultivo 1-3. Los virus, que...

El objetivo general de este procedimiento es aislar viriones individuales a partir de una consorcio mixto y secuenciar el material genómico obtenido para identificar virus de una variedad de ambientes sin necesidad de cultivo. Esto se logra primero aislado los viriones individuales mediante clasificación citométrica de flujo sobre perlas de agarosa. La captura de un solo virión luego se valida mediante microscopía confocal.A continuación, se aísla el material genómico de los viriones y se amplifica mediante amplificación por desplazamiento múltiple o MDA para generar la cantidad de ADN necesaria para la secuenciación. Finalmente, el ADN viral se secuencia utilizando tecnologías de alto rendimiento para generar una cobertura excesiva del genoma del virión, lo que ayuda considerablemente en el ensamblaje y la anotación del genoma. En última instancia, se emplean técnicas bioinformáticas basadas en enfoques de submuestreo de secuencias para aumentar el tamaño de los contigs, lo que permite el análisis de viriones aislados.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ecología viral al proporcionar un contexto genómico al vasto conjunto de genes de virus planctónicos sin anotar, así como permitir el descubrimiento de nuevos genomas procedentes de diversos ecosistemas. En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque la amplificación y el aislamiento de viriones individuales están llevando al límite la tecnología actual. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando evaluábamos el uso de la MDA en comunidades de virus planctónicos y nos dimos cuenta de que era posible separar una partícula viral individual, secuenciarla y, por tanto, ensamblar un genoma viral completo a partir de estas comunidades complejas. Para separar virus mediante un citómetro de flujo equipado con tubos fotomultiplicadores personalizados de dispersión hacia adelante o FSCPMT, comience por diluir las partículas virales en tris-EDTA filtrado de 0,1 micrones. Para un conjunto mixto que contenga partículas de fagos T4 y lambda, ajuste el FSCPMT a 1000 y el SSC a 200 para maximizar la relación señal-ruido.Después de ejecutar las muestras de control, analice aproximadamente 100 microlitros de la suspensión viral teñida hasta un total de 5.000 eventos. Luego, utilice las gráficas de SYBR Green One y FSCPMT para colocar una compuerta estrecha en el centro de las partículas virales. A continuación, añada cinco microlitros de agarosa de punto de fusión baja al 1 % en tampón TBE enfriado a 37 grados Celsius en cada pocillo de la placa microscópica de P-T-F-E y, después, cargue la placa en el citómetro de flujo para capturar las partículas virales ordenadas.Comience la clasificación, capturando 10 o más eventos de partículas virales en algunos de los pocillos para facilitar la detección de la profundidad de los virus durante la microscopía confocal de barrido con láser. Cuando finalice la clasificación, retire la lámina del citómetro de flujo y agregue cinco microlitros adicionales de agarosa de punto de fusión baja enfriada a 37 grados Celsius a cada pocillo para embeber las partículas virales. Para viriones individuales, configure el microscopio confocal de barrido con láser a una excitación de 488 nanómetros. Luego, obtenga imágenes de las partículas embebidas utilizando un objetivo de distancia de trabajo larga de 63 x para verificar que esté presente una sola partícula y que múltiples virus no estén apilados unos encima de otros. Una vez identificados los pocillos con virus individuales, utilice una cuchilla de afeitar para retirar las perlas de agarosa deseadas de la lámina y colóquelas en un tubo de PCR estéril.Coloque el tubo en el bloque térmico de un termociclador ajustado a 94 grados Celsius durante tres minutos para lisar la partícula viral in situ. Luego, tras realizar una MDA modificada, transfiera el ADN genómico a tubos Eppendorf de 1,7 mililitros y agregue un décimo del volumen de acetato de sodio tres molar en tampón TBE para purificar el material genómico amplificado. Incube las muestras a 55 grados Celsius durante 10 minutos para disolver el agarosa y luego transfiera los tubos a 42 grados Celsius para reducir la temperatura antes de añadir la enzima. A continuación, agregue dos unidades de beta-agarasa a cada tubo e incube los tubos durante dos horas.Luego, agregue un volumen de una solución tamponada de fenol saturado a cada tubo. Mezcle vigorosamente y centrifugue los tubos durante 15 minutos a 3.500 ×g a temperatura ambiente. Transfiera los sobrenadantes que contienen ADN a un nuevo tubo Eppendorf de 1,7 mililitros. A continuación, agregue un volumen de isopropanol al 100 % y un microlitro de glyco-blue a los tubos e invierta los tubos para mezclar. Después de centrifugar nuevamente los tubos, esta vez durante 60 minutos a 28.000 ×g y 4 grados Celsius, deseche el isopropanol, asegurándose de no perturbar el precipitado, y agregue 150 microlitros de etanol al 70 % a cada tubo. Centrifugue los tubos durante 10 minutos a 28.000 ×g a temperatura ambiente. Deseche el etanol, seque al aire el precipitado de ADN y reconstituya el ADN en un volumen apropiado de tampón tris-EDTA. Esta reconstrucción tridimensional de una partícula viral teñida con SYBR Green I dentro de una perla de agarosa demuestra cómo la microscopía confocal con láser puede utilizarse para visualizar y confirmar que se obtiene un solo virión en cada pocillo tras ser capturado e inmovilizado en agarosa; la inserción muestra una mayor magnificación de la partícula viral aislada.Aquí se muestra un gráfico de perfil de la fluorescencia relativa de la partícula viral individual teñida dentro de una perla de agarosa. Esta serie final de figuras muestra cómo casi todo el genoma de Lambda, con la excepción de los primeros cinco pares de bases, fue recuperado para este virus representativo. A continuación se muestra el gráfico de contenido de GC para el genoma viral individual identificado. Esta figura muestra el mapa del genoma de lambda. Finalmente, se muestra la alineación de un genoma viral individual para el bacteriófago lambda aislado y amplificado representativo. El eje X muestra la posición en el genoma. El eje Y muestra el porcentaje de cobertura.Al intentar este procedimiento, es importante utilizar una técnica estéril y tomarse el tiempo necesario para asegurar que se evite la contaminación. Después de seguir este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos para evaluar la taxonomía de los viriones aislados antes del secuenciamiento completo del genoma. Tras ver este video, debería tener una buena idea de cómo aislar viriones individuales utilizando citometría de flujo activada por fluorescencia, microscopía confocal y amplificación del genoma completo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Se describe el proceso de aislamiento de ADN de alta pureza herpesvirus nucleocápside de las células infectadas. El final de ADN capturado de la solución es de alta concentración y pureza, por lo que es ideal para la secuenciación de alto rendimiento, alta fidelidad de las reacciones de PCR, y transfecciones para producir nuevas recombinaciones virales.

Preparación de ADN viral de nucleocápside

Una manera sencilla, eficiente y robusta para sincronizar la entrega de múltiples componentes virales a las células vegetales...

Simple y robusto En vivo Y In vitro Enfoque para el estudio de ensamblaje del virus

Source: Philip, A. A., et al., Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the isolation of rotavirus double-stranded RNA from clarified cell lysates. It further illustrates the separation and visualization of genome segments through polyacrylamide gel electrophoresis.

Isolation and Visualization of Rotavirus Genome via Gel Electrophoresis

La unión de viriones a una superficie es un requisito para la obtención de imágenes de viriones individuales mediante imágenes de fluorescencia de súper resolución o microscopía de fuerza atómica (AFM). Aquí se demuestra un método de preparación de la muestra para la adhesión controlada de viriones a las superficies de vidrio adecuado para su uso en AFM y super-resolución de imágenes de fluorescencia.

Preparación de muestras para microscopía de fuerza atómica de virión único e imágenes de fluorescencia de súper resolución

Trabaja con virus Ébola infecciosas está restringido a nivel de bioseguridad 4 laboratorios. Tetracistronic replicación y transcripción del virus competente como partículas que contienen minigenoma-(trVLPs) representan un sistema de modelado del ciclo de vida que permite modelar de forma segura múltiples ciclos infecciosos bajo nivel de bioseguridad 2 condiciones, depender exclusivamente de componentes del virus Ebola.

Modelado El ciclo de vida de Ebola Virus Bajo Nivel de Bioseguridad 2 Condiciones Con-Virus como partículas que contienen Tetracistronic minigenomas

El objetivo de este protocolo es específicamente la etiqueta y aislar selectivamente la DNA viral de células infectadas para la caracterización de proteínas del genoma viral asociado.

Purificación de ADN Viral para la identificación de las proteínas virales y celulares asociadas

Aquí presentamos un nuevo enfoque para identificar virus con genomas de ADN de doble cadena. Usamos métodos estándar para extraer el ADN y el ARN de hojas infectadas y llevar a cabo la secuenciación de próxima generación. Herramientas bioinformáticas montan secuencias en contigs, identifican contigs representación de genomas del virus y asignan genomas a grupos taxonómicos.

La combinación de análisis de la DNA en una extracción de crudo del virión con el análisis de ARN de hojas infectadas para descubrir nuevos genomas de Virus

Aquí, describimos un método de microaspiración de una sola célula para la separación de las amebas infectadas. Con el fin de separar subpoblaciones virales en Vermamoeba vermiformis infectados por Faustovirus y virus gigantes desconocidos, desarrollamos el protocolo detallado a continuación y demostramos su capacidad para separar dos nuevos virus gigantes de baja abundancia.

Microaspiración de células únicas como estrategia alternativa a la clasificación celular activada por fluorescencia para la separación de mezclas de virus gigantes

Aquí, describimos un inmunoensayo fluorescente multiplex recientemente desarrollado que utiliza un sistema citométrico de flujo de doble reportero para detectar simultáneamente dos epítopos únicos de proteína de pico en partículas virales intactas del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) que habían sido capturadas por microesferas magnéticas acopladas a la enzima convertidora de angiotensina-2.

Perfil de epítopos de proteínas de superficie en partículas virales mediante la estrategia Multiplex Dual-Reporter

Aquí, describimos métodos de muestreo de las zonas eufóticas de los ecosistemas marinos y de agua dulce para aislar cianofagos (y sus huéspedes) y procesos posteriores al muestreo que enriquecen genotipos individuales y caracterizan la dinámica de interacción virus-huésped.

Muestreo ambiental de microbios fotosintéticos y sus virus: del campo al laboratorio

Presentamos un protocolo flexible para generar metagenomas de fracciones de tamaño viral (viromes) de alta calidad a partir de muestras de heces humanas. Desarrollado originalmente para la virómica del suelo, aquí este protocolo se aplicó con éxito a muestras de heces, permitiendo una caracterización robusta de la virosfera intestinal humana.

Metagenómica de fracciones de tamaño viral del ADN para muestras de heces humanas

Aprende genómica de virus individuales mediante citometría de flujo y amplificación MDA para secuenciación de alto rendimiento. Este método computacional permite identificar virus sin cultivo previo.

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