Aislamiento y Análisis del Genoma de viriones individuales utilizando "Genómica solo virus '

El objetivo general de este procedimiento es aislar viriones individuales a partir de una consorcio mixto y secuenciar el material genómico obtenido para identificar virus de una variedad de ambientes sin necesidad de cultivo. Esto se logra primero aislado los viriones individuales mediante clasificación citométrica de flujo sobre perlas de agarosa. La captura de un solo virión luego se valida mediante microscopía confocal.

A continuación, se aísla el material genómico de los viriones y se amplifica mediante amplificación por desplazamiento múltiple o MDA para generar la cantidad de ADN necesaria para la secuenciación. Finalmente, el ADN viral se secuencia utilizando tecnologías de alto rendimiento para generar una cobertura excesiva del genoma del virión, lo que ayuda considerablemente en el ensamblaje y la anotación del genoma. En última instancia, se emplean técnicas bioinformáticas basadas en enfoques de submuestreo de secuencias para aumentar el tamaño de los contigs, lo que permite el análisis de viriones aislados.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ecología viral al proporcionar un contexto genómico al vasto conjunto de genes de virus planctónicos sin anotar, así como permitir el descubrimiento de nuevos genomas procedentes de diversos ecosistemas. En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque la amplificación y el aislamiento de viriones individuales están llevando al límite la tecnología actual. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando evaluábamos el uso de la MDA en comunidades de virus planctónicos y nos dimos cuenta de que era posible separar una partícula viral individual, secuenciarla y, por tanto, ensamblar un genoma viral completo a partir de estas comunidades complejas. Para separar virus mediante un citómetro de flujo equipado con tubos fotomultiplicadores personalizados de dispersión hacia adelante o FSCPMT, comience por diluir las partículas virales en tris-EDTA filtrado de 0,1 micrones. Para un conjunto mixto que contenga partículas de fagos T4 y lambda, ajuste el FSCPMT a 1000 y el SSC a 200 para maximizar la relación señal-ruido.

Después de ejecutar las muestras de control, analice aproximadamente 100 microlitros de la suspensión viral teñida hasta un total de 5.000 eventos. Luego, utilice las gráficas de SYBR Green One y FSCPMT para colocar una compuerta estrecha en el centro de las partículas virales. A continuación, añada cinco microlitros de agarosa de punto de fusión baja al 1 % en tampón TBE enfriado a 37 grados Celsius en cada pocillo de la placa microscópica de P-T-F-E y, después, cargue la placa en el citómetro de flujo para capturar las partículas virales ordenadas.

Comience la clasificación, capturando 10 o más eventos de partículas virales en algunos de los pocillos para facilitar la detección de la profundidad de los virus durante la microscopía confocal de barrido con láser. Cuando finalice la clasificación, retire la lámina del citómetro de flujo y agregue cinco microlitros adicionales de agarosa de punto de fusión baja enfriada a 37 grados Celsius a cada pocillo para embeber las partículas virales. Para viriones individuales, configure el microscopio confocal de barrido con láser a una excitación de 488 nanómetros. Luego, obtenga imágenes de las partículas embebidas utilizando un objetivo de distancia de trabajo larga de 63 x para verificar que esté presente una sola partícula y que múltiples virus no estén apilados unos encima de otros. Una vez identificados los pocillos con virus individuales, utilice una cuchilla de afeitar para retirar las perlas de agarosa deseadas de la lámina y colóquelas en un tubo de PCR estéril.

Coloque el tubo en el bloque térmico de un termociclador ajustado a 94 grados Celsius durante tres minutos para lisar la partícula viral in situ. Luego, tras realizar una MDA modificada, transfiera el ADN genómico a tubos Eppendorf de 1,7 mililitros y agregue un décimo del volumen de acetato de sodio tres molar en tampón TBE para purificar el material genómico amplificado. Incube las muestras a 55 grados Celsius durante 10 minutos para disolver el agarosa y luego transfiera los tubos a 42 grados Celsius para reducir la temperatura antes de añadir la enzima. A continuación, agregue dos unidades de beta-agarasa a cada tubo e incube los tubos durante dos horas.

Luego, agregue un volumen de una solución tamponada de fenol saturado a cada tubo. Mezcle vigorosamente y centrifugue los tubos durante 15 minutos a 3.500 ×g a temperatura ambiente. Transfiera los sobrenadantes que contienen ADN a un nuevo tubo Eppendorf de 1,7 mililitros. A continuación, agregue un volumen de isopropanol al 100 % y un microlitro de glyco-blue a los tubos e invierta los tubos para mezclar. Después de centrifugar nuevamente los tubos, esta vez durante 60 minutos a 28.000 ×g y 4 grados Celsius, deseche el isopropanol, asegurándose de no perturbar el precipitado, y agregue 150 microlitros de etanol al 70 % a cada tubo. Centrifugue los tubos durante 10 minutos a 28.000 ×g a temperatura ambiente. Deseche el etanol, seque al aire el precipitado de ADN y reconstituya el ADN en un volumen apropiado de tampón tris-EDTA. Esta reconstrucción tridimensional de una partícula viral teñida con SYBR Green I dentro de una perla de agarosa demuestra cómo la microscopía confocal con láser puede utilizarse para visualizar y confirmar que se obtiene un solo virión en cada pocillo tras ser capturado e inmovilizado en agarosa; la inserción muestra una mayor magnificación de la partícula viral aislada.

Aquí se muestra un gráfico de perfil de la fluorescencia relativa de la partícula viral individual teñida dentro de una perla de agarosa. Esta serie final de figuras muestra cómo casi todo el genoma de Lambda, con la excepción de los primeros cinco pares de bases, fue recuperado para este virus representativo. A continuación se muestra el gráfico de contenido de GC para el genoma viral individual identificado. Esta figura muestra el mapa del genoma de lambda. Finalmente, se muestra la alineación de un genoma viral individual para el bacteriófago lambda aislado y amplificado representativo. El eje X muestra la posición en el genoma. El eje Y muestra el porcentaje de cobertura.

Al intentar este procedimiento, es importante utilizar una técnica estéril y tomarse el tiempo necesario para asegurar que se evite la contaminación. Después de seguir este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos para evaluar la taxonomía de los viriones aislados antes del secuenciamiento completo del genoma. Tras ver este video, debería tener una buena idea de cómo aislar viriones individuales utilizando citometría de flujo activada por fluorescencia, microscopía confocal y amplificación del genoma completo.