Aislamiento y Análisis del Genoma de viriones individuales utilizando "Genómica solo virus '

El objetivo general de este procedimiento es aislar varios individuales de un consorcio mixto y secuenciar el material genómico obtenido para identificar virus de una variedad de entornos sin necesidad de cultivo. Esto se logra aislando primero las varias individuales utilizando la clasificación citométrica de flujo en cuentas de aro. A continuación, la captura de un solo ion se valida mediante microscopía confocal.

A continuación, el material genómico se aísla del ion y se amplifica mediante amplificación de desplazamiento múltiple o MDA para generar la cantidad de ADN necesaria para la secuenciación. Finalmente, el ADN viral se secuencia utilizando tecnologías de alto rendimiento para generar un exceso de cobertura del genoma del virión que ayuda sustancialmente en el ensamblaje y la anotación del genoma. En última instancia, las técnicas bioinformáticas destinadas a utilizar enfoques de submuestreo de secuencias para aumentar el tamaño de los fragmentos permiten el análisis de vons aislados.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ecología viral al proporcionar un contexto genómico al vasto conjunto de genes de plancton OC anotados, así como permitir el descubrimiento de nuevos genomas de diversos ecosistemas. En general, las personas que son nuevas en este método pueden tener dificultades porque la amplificación y el aislamiento de iones individuales está superando los límites de la tecnología actual. Tuvimos la idea de este método por primera vez cuando estábamos evaluando el uso de MDA en comunidades de plancton Vero y nos dimos cuenta de que era posible clasificar una sola partícula viral y secuenciarla y, por lo tanto, ensamblar un genoma viral completo a partir de estas comunidades complejas. Para clasificar virus utilizando un citómetro de flujo equipado con tubos fotomultiplicadores de dispersión directa personalizados o F-S-C-P-M-T, comience diluyendo las partículas virales en tris filtradas de 0,1 micras, El EDTA para un ensamblaje mixto que contiene partículas de fagos T four y lambda, establezca el F-S-C-P-M-T en 1000 y el SSC en 200 para maximizar la relación señal-ruido.

Después de ejecutar muestras de control, ejecute alrededor de 100 microlitros de la suspensión viral sostenida para un total de 5.000 eventos. Luego use el verde cibernético y los gráficos F-S-C-P-M-T para colocar una puerta hermética en el centro de las partículas virales. Ahora agregue cinco microlitros de aros de bajo punto de fusión al 1% en tampón TBE enfriado a 37 grados Celsius a cada pocillo en el portaobjetos del microscopio A-P-T-F-E y luego cargue el portaobjetos en el citómetro de flujo para capturar las partículas virales clasificadas.

Comience a clasificar, capturando 10 o más eventos de partículas virales en algunos de los pocillos para ayudar en la detección de la profundidad de los virus durante la microscopía de escaneo láser confocal. Una vez finalizada la clasificación, retire el portaobjetos del citómetro de flujo y agregue cinco microlitros más de aros de bajo punto de fusión enfriados a 37 grados Celsius a cada pocillo. Incrustación de las partículas virales para una sola varión.

Ajuste el microscopio de escaneo láser confocal a 488 nanómetros. A continuación, la excitación obtiene imágenes de las partículas incrustadas utilizando un objetivo de distancia de trabajo de 63 veces para verificar que solo hay una sola partícula y que no hay varios virus apilados uno encima del otro. Luego, una vez que se hayan identificado los pocillos con virus individuales, use una cuchilla de afeitar para quitar las perlas de agros deseadas del portaobjetos y colóquelas en un tubo de PCR estéril.

Coloque el tubo en el bloque de calor de un termociclador ajustado a 94 grados Celsius durante tres minutos para cortar la partícula viral in situ. Luego, después de realizar un MDA modificado, transfiera el ADN genómico a tubos de einor de 1,7 mililitros y agregue un décimo volumen de acetato de sodio de tres molares en tampón TBE Para purificar el material genómico amplificado, coloque las muestras a 55 grados Celsius durante 10 minutos para disolver los aros y luego mueva los tubos a 42 grados Celsius para reducir la temperatura antes de agregar la enzima. Ahora agregue dos unidades de beta aasa a cada tubo e incube los tubos durante dos horas.

A continuación, añada un volumen de una solución tampón de fenol saturado a cada tubo. Mezclar vigorosamente y centrifugar los tubos durante 15 minutos a 3.500 veces G.At temperatura ambiente, transfiera el ADN que contiene SOBRENADANTES a un nuevo tubo einor de 1,7 mililitros. A continuación, agregue un volumen de isopropanol al 100% y un microlitro de azul de gliconucleosis a los tubos e invierta los tubos para mezclar después de centrifugar los tubos nuevamente.

Esta vez durante 60 minutos a 28.000 veces G y cuatro grados centígrados. Decantar el isopropanol, asegurándose de no alterar el pellet y añadir 150 microlitros de etanol al 70% a cada tubo. Gira los tubos durante 10 minutos a 28.000 veces.

G a temperatura ambiente. Decantar el etanol al aire, la pastilla de ADN y volver a suspender el ADN en un volumen adecuado de tampón tris EDTA. Esta reconstrucción tridimensional de una partícula viral teñida de verde cibernético dentro de una agro velocidad demuestra cómo se puede utilizar la microscopía láser confocal para visualizar y confirmar que se obtiene un solo virión en cada pozo después de ser capturado e incrustado en aros, el recuadro muestra un mayor aumento de la partícula viral aislada.

Aquí se muestra un gráfico de perfil de la fluorescencia relativa de la partícula viral única teñida dentro de una perla de aros. Esta última serie de figuras muestra cómo se recuperó casi todo el genoma Lambda, a excepción de los cinco primeros pares de bases, para este virus representativo. Este es el gráfico de GC para el virus único.

Se muestra el genoma identificado. Esta figura muestra el mapa del genoma de lambda. Finalmente, se muestra el mapeo de un solo genoma viral para el fago lambda representativo de bacterias aisladas y amplificadas.

El eje X muestra la posición del genoma. El eje Y muestra el porcentaje de cobertura. Al intentar este procedimiento, es importante utilizar una técnica estéril y tomarse el tiempo necesario para asegurarse de que se evite la contaminación.

Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos para evaluar la taxonomía de los varios aislados antes de la secuenciación del genoma completo. Después de ver este vídeo, debería tener una buena idea de cómo aislar varios individuales mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia, la microscopía confocal y la amplificación del genoma completo.