Name: Bioluminiscencia de imágenes de la actividad NADPH oxidasa en diferentes modelos animales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Aprende a monitorizar especies reactivas de oxígeno derivadas de NADPH oxidasa en tiempo real mediante bioluminiscencia en modelos murinos de inflamación. Este método mínimamente invasivo permite cuantificar dinámicas de ROS in vivo.

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Este trabajo fue financiado por el NIH RO1 AI079253 y el Departamento de Asuntos de Veteranos.

1. Modelos Animales <ol><li> Ratones: Use p47 phox-/ - ratones y la edad y el sexo combinado-ratones C57BL6/DBA. Obtener la aprobación para los experimentos de Cuidado de Animales institucional y el empleo. </li><li> Anestesia: Utilice un sistema de administración continua para inducir la anestesia con isoflurano. El sistema vaporizador (VetEquip) se llena con isoflurano (2-3%). Confirmar que los ratones son completamente anestesiado mediante la observación de la respiración, el movimiento y reflejo corneal en respuesta a estímulos externos. </li><li> Los procedimientos quirúrgicos: Frote el área quirúrgica (de sobremesa) con 70% de etanol. Use guantes estériles y una bata quirúrgica limpia y la máscara. Preparar los ratones por cortar el pelo y aplicar betadine alternando con 70% de etanol a la zona donde se realizará la incisión. Realizar la cirugía en una superficie estéril y utilizar instrumentos estériles. Monitor de ratones después de la operación hasta que despierto y moverse libremente. </li><li> Administración intratraqueal zymosan <ol><li> Administrar anestesiacomo se describe en 1,2. </li><li> Desinfectar área quirúrgica (cuello) con betadine y 70% de etanol y exponer la tráquea por disección quirúrgica. </li><li> Pierce tráquea con una aguja de calibre 27-e inyectar zymosan (St. Louis, MO) a una dosis de 1 mg / g usando un g 0,5 / l solución (volumen total de 50 l para un ratón de 25 g) disuelto en PBS estéril. </li><li> Cuello ratones Cerrar la herida con suturas de seda 5-0 estériles en condiciones asépticas. </li><li> Imagen después de 4 horas y 24 horas. </li></ol></li><li> Ligadura cecal y punción <ol><li> Administrar anestesia como se describe en 1.2. </li><li> Clip de pelo en el área quirúrgica (abdomen) y desinfectar con betadine y un 70% de etanol. </li><li> Lleve a cabo una laparotomía media e identificar el ciego. </li><li> Se liga el distal 50% de ciego expuesta con sutura de seda 4-0 y el ciego punción distal a la ligadura con una pasada de una aguja de calibre 21-. </li><li> Cierre la incisión con suturas de seda 4-0 estériles. </li><li> Imagen después de 4 horas y24 hr. </li></ol></li><li> Oral en tetracloruro de carbono (CCl 4) Administración <ol><li> Administrar anestesia como se describe en 1.2. </li><li> Administrar CCl 4 (2 mg / g, St. Louis, MO) disuelto en aceite de maíz por alimentación forzada oral. El procedimiento de administración de CCl4 se debe realizar en un área designada de acuerdo con IBC / EHS políticas. </li><li> Imagen después de 4 horas y 24 horas. </li></ol></li></ol> 2. La adquisición de una imagen de Bioluminescent <ol><li> Inicialice el IVIS 200 (Xenogen Corporation, Alameda, CA) Imaging System, en modo luminiscencia, y esperar a que el dispositivo de carga acoplada (CCD) temperatura de bloqueo. </li><li> Seleccione el tiempo de exposición, hurgar en la basura (medio) y F / Stop ajustes (8). </li><li> Ratones coloque en posición supina en la cámara de formación de imágenes en una etapa calentada para mantener la temperatura corporal normal. Administrar anestesia como se describe en 1,2 a través de cono de la nariz mientras que los ratones se encuentran en la cámara de formación de imágenes IVIS. </li><li> Administrar L-012<html> (20 mg / g) disuelto en PBS estéril (10 g / l) por vía intravenosa a través de retro-orbital de inyección en cada punto de tiempo seleccionado para la formación de imágenes. </li><li> Capturar imágenes que comienzan en 2 min después de la inyección L-012. Nos típicamente utilizan una exposición de 40 segundos. </li></ol> 3. Análisis de datos utilizando región de interés <ol><li> Analizar datos usando software Image Living V.4.2 (Xenogen Corporation, Alameda, CA). </li><li> Abra una imagen y seleccionar la medición de la Región de herramientas de Interés. </li><li> Seleccione la Región de Interés forma y tamaño sobre el pecho o / y el abdomen después de la superposición de una imagen digital pseudo-color (que representa la detección de fotones) en una imagen fotográfica del ratón. </li><li> Cuantificar la intensidad de la señal (flujo de fotones) de la región de interés. </li></ol> 4. Estadística <ol><li> Utilice el paquete de software estadístico para llevar a cabo análisis ANOVA de dos vías con Bonferroni post-pruebas en puntos de tiempo individuales. </li></ol>tle &quot;&gt; 5. Resultados Representante Zimosán es un pro-inflamatoria célula de levadura producto de la pared y un potente activador de la NADPH oxidasa 3. Anteriormente puso de manifiesto que zymosan intratraqueal induce una inflamación neutrofílica de pulmón más robusto y pro-inflamatorios en la producción de citoquinas p47 phox-/ - en comparación con ratones de tipo salvaje 1. En este sentido, nuestro objetivo fue comparar la generación de ROS en los pulmones de tipo salvaje y p47 phox-/ - ratones después de la exposición zymosan. A las 4 horas después de la administración intratraqueal zymosan, se observó un aumento significativo de la emisión de fotones sobre el pecho en ratones de tipo salvaje en comparación con el valor basal, así como un aumento en la emisión de fotones en comparación con el tipo salvaje p47 phox-/ - ratones en 4 h y 24 h. En contraste, las señales de bioluminiscencia en p47 phox-/ - ratones se mantuvieron en niveles de línea de base en 4 horas después del tratamiento zymosan (Fig.1 AB). Por lo tanto, la NADPH oxidasa parece be la fuente principal de la generación de ROS en los pulmones después de la administración zymosan. A continuación, se evaluó la producción de ROS en el modelo de sepsis inducida por CLP. La sepsis es un síndrome potencialmente mortal asociada con lesión de órganos diana, incluyendo la lesión pulmonar aguda (LPA) y síndrome de distrés respiratorio agudo (SDRA) 4, 5. ROS mediada por lesión ha sido considerado como un factor importante en la sepsis inducida por disfunción multiorgánica. Se encontró que ROS se incrementaron significativamente en el pecho (4 hr) y sobre el abdomen (24 hr) después de CLP en ratones de tipo salvaje en comparación con el valor basal. Sin embargo, los niveles de ROS en p47 phox-/ - ratones fueron similares a los niveles basales en ambos puntos de tiempo (figura 2 AC). Estos resultados muestran que la generación de ROS en el modelo de sepsis inducida por CLP ratón es NADPH oxidasa dependiente. Finalmente, se utilizaron imágenes de bioluminiscencia para detectar la producción de ROS en un CCl 4-inducida por daño hepático modol. CCl 4 causa la necrosis hepatocelular, y se ha utilizado para modelar tanto daño hepático agudo y fibrosis hepática 6. En contraste con los modelos descritos anteriormente de la inflamación y la lesión, se encontró que la producción de ROS en el abdomen fue modestamente (aproximadamente 35%) se incrementó sobre la línea base en p47 phox-/ - ratones en 4 h después de la administración de CCl 4. Sin embargo, la magnitud de CCl 4-inducida por la generación de ROS fue significativamente mayor en los ratones de tipo salvaje que en p47 phox-/ - ratones (Fig. 3 AB). Estos datos sugieren que tanto la generación de ROS p47 phox que contiene NADPH oxidasa dependiente e independiente-ocurren en aguda CCl 4-inducida por la lesión hepática. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig1.jpg" /> Figura 1. ROS producción en los pulmones después del tratamiento zymosan. A) Representante bioluminescence imágenes de la producción de ROS. Tenga en cuenta que además del pecho, la luminiscencia es detectable sobre el abdomen en tanto de tipo salvaje y p47 phox-/ - ratones y luminiscencia abdominal no se modifica por el tratamiento zymosan. B) fotones conteos del pecho de tipo salvaje y p47 phox-/ - ratones después de una sola inyección intratraqueal (IT) de zymosan. Imágenes de bioluminiscencia se realizó al inicio, 4 h, y 24 h. La emisión de luz desde la región de interés sobre el pecho se identificó utilizando la indicada pseudo-color escala. Los resultados se presentan como media ± SE, n = 6-9 por grupo, * = p &lt;0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para agrandar la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig2.jpg" /> Figura 2. Detección de ROS tras CLP. A) Representante imágenes de bioluminiscencia de producción de ROS, BFotones) cuenta desde el pecho y C) los recuentos de fotones desde el abdomen de tipo salvaje y p47 phox-/ - ratones al inicio del estudio, 4 h, y 24 h después de CLP. Los resultados se presentan como media ± SE, n = 4-5 por grupo, * = p &lt;0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para agrandar la figura</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3925/3925fig3.jpg" /> Figura 3. Producción de ROS en el abdomen después de CCl 4-inducida por la lesión hepática. Una imagen) bioluminiscencia Representante de la producción de ROS y B) cuenta fotones del abdomen de tipo salvaje y p47 phox-/ - ratones al inicio del estudio, 4 horas, y 24 horas después de la CCL 4 tratamiento bucal. Los resultados se presentan como media ± SE;. N = 4-5 por grupo, * = p &lt;0,05 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para agrandar la figura</a> </a&gt;.

<ol><li>Segal, B., Han, W., Bushey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+limits+innate+immune+response+in+the+lungs+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice.</a> PLoS ONE. 5, e9631(2010).</li>
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<li>Pollock, J. D., Williams, D. A., Gifford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+X-linked+chronic+granulomatous+disease%2C+an+inherited+defect+in+phagocyte+superoxide+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mouse model of X-linked chronic granulomatous disease, an inherited defect in phagocyte superoxide production.</a> Nat. Genet. 9, 202-209 (1995).</li>
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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

&quot;Tiempo real&quot; medición de las especies reactivas de oxígeno (ROS) en los animales vivos se puede lograr mediante el uso de sondas fluorescentes y quimioluminiscentes. Mientras que las sondas fluorescentes sufren de tener débiles señal-a-ruido 12, se describe la técnica de imagen es más sensible para la detección de la emisión de luz después de una reacción química de ROS con el sustrato luminol basado en L-012. Como todas las técnicas de formación de imágenes bioluminiscentes, esta metodología está ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> El número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> L-012 </td><td> Wako Chemicals EE.UU., Inc. </td><td> 120-04891 </td><td></td></tr><tr><td> Zymosan </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> Z4250 </td><td></td></tr><tr><td> tetracloruro de carbono </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> 289116 </td><td></td></tr></tbody></table>

bioluminiscencia de imágenes de la actividad nadph oxidasa en diferentes modelos animales

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

La NADPH oxidasa es una enzima crítica que media la defensa del huésped antibacteriana y antifúngica. Además de su papel en la defensa del huésped antimicrobiana, la NADPH oxidasa tiene funciones críticas de señalización que modulan la respuesta inflamatoria 1. Por lo tanto, el desarrollo de un método para medir en &quot;tiempo real&quot; la cinética de la NADPH oxidasa derivada de la generación de ROS se espera que sea una valiosa herramienta de investigación para comprender los mecanismos pertinentes para la defensa del huésped, la inflamación y lesiones. La enfermedad granulomatosa crónica (EGC) es un trastorno hereditario de la NADPH oxidasa se caracteriza por infecciones graves y la inflamación excesiva. La activación de la NADPH oxidasa de los fagocitos requiere la translocación de sus subunidades citosólicas (p47 phox, p67 phox y p40 phox) y RAC a un flavocitocromo unida a la membrana (compuesto de una gp91 phox y p22 phox heterodímero). Pérdidade mutaciones de función en cualquiera de estos componentes de la NADPH oxidasa resultado en la EGC. Similar a los pacientes con EGC, gp91 phox los ratones deficientes en p47 y los ratones deficientes tienen phox-defectuoso actividad de la NADPH oxidasa de los fagocitos y deterioro de la defensa de acogida 13, 14. Además de los fagocitos, que contienen los componentes de la NADPH oxidasa descritos anteriormente, una variedad de otros tipos de células expresan diferentes isoformas de la NADPH oxidasa. Aquí se describe un método para cuantificar la producción de ROS en ratones vivos y para delinear la contribución de NADPH oxidasa para la generación de ROS en modelos de inflamación y lesiones. Este método se basa en el ROS reaccionar con L-012 (un análogo de luminol) para emitir luminiscencia que se registra mediante un dispositivo de carga acoplada (CCD). En la descripción original de la sonda L-012, L-012-dependiente quimioluminiscencia fue completamente abolida por la superóxido dismutasa, que indica que el principal ROS detectado en esta reacción fue superóxido de anión 15. Estudios posteriores han demostrado que la L-012 puede detectar otros radicales libres, incluyendo especies reactivas de nitrógeno 16, 17. Kielland et al. 17 mostraron que la aplicación tópica de acetato de forbol miristato, un potente activador de la NADPH oxidasa, llevado a NADPH oxidasa dependiente de la generación de ROS que podría ser detectado en ratones utilizando la sonda luminiscente L-012. En este modelo, se mostró que la luminiscencia L-012-dependiente fue abolida en p47 phox de ratones deficientes. Hemos comparado la generación de ROS en ratones de tipo salvaje y NADPH oxidasa deficiente en p47 phox-/ - ratones 2 en los tres modelos siguientes: 1) la administración intratraqueal de zymosan, una célula fúngica pro-inflamatoria pared producto derivado que puede activar la NADPH oxidasa; 2) ligadura cecal y punción (CLP), un modelo de sepsis intraabdominal con la inflamación pulmonar aguda secundaria y lesiones, y 3) el tetracloruro de carbono orales(CCl 4), un modelo de lesión hepática dependiente de ROS. Estos modelos se seleccionaron específicamente para evaluar la NADPH oxidasa dependiente de la generación de ROS en el contexto de la inflamación no infecciosa, sepsis polimicrobiana y lesión inducida por la toxina del órgano, respectivamente. Comparación de bioluminiscencia en los ratones de tipo salvaje p47 phox a-/ - ratones nos permite delinear la contribución específica de ROS generados por p47 phox de la NADPH oxidasa que contiene a la señal bioluminiscente en estos modelos. Resultados de bioluminiscencia de formación de imágenes que demostraron el aumento de los niveles de ROS en ratones de tipo salvaje en comparación con p47 phox-/ - ratones indicó que la NADPH oxidasa es la fuente principal de la generación de ROS en respuesta a estímulos inflamatorios. Este método proporciona un método mínimamente invasivo para el &quot;tiempo real&quot; monitoreo de la generación de ROS durante la inflamación in vivo.

La NADPH oxidasa es la mayor fuente de especies reactivas de oxígeno (ROS) en los fagocitos. Debido a la naturaleza efímera de ROS, es difícil de medir y controlar los niveles de ROS en los animales vivos. Un procedimiento mínimamente invasivo para la cuantificación de serie de ROS en ratones vivos se describe.

Bioluminiscencia de imágenes de la actividad NADPH oxidasa en diferentes modelos animales

La NADPH oxidasa es una enzima fundamental que media la defensa del huésped contra bacterias y hongos. Además de su función en la defensa antimicrobiana del huésped, la NADPH...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un enfoque mínimamente invasivo para la monitorización en tiempo real de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) derivadas de la N-A-D-P-H oxidasa en tres modelos murinos inflamatorios diferentes. El primer modelo es la administración intratraqueal de Xan, en el cual la molécula proinflamatoria Xan se inyecta en la tráquea de ratones anestesiados. Xan es un producto derivado de la pared celular de hongos que puede activar la N-A-D-P-H oxidasa.El segundo modelo consiste en una ligadura y punción, o CLP. En este caso, se abre el abdomen del ratón y el ciego se liga con una sutura de seda, para luego puncionarlo con una aguja y así inducir sepsis intraabdominal e inflamación e injuria pulmonar aguda secundaria. El tercer modelo es la administración de tetracloruro de carbono mediante sonda orogástrica.El tetracloruro de carbono provoca necrosis hepatocelular y puede utilizarse para modelar tanto la lesión hepática aguda como la fibrosis hepática. Se realiza imágenes bioluminiscentes en ratones del modelo para evaluar la producción de ERO. Los datos resultantes indican que la N-A-D-P-H oxidasa es la principal fuente de generación de ERO en respuesta a estímulos inflamatorios.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, por ejemplo, la sonda de fluorescencia, es que este método proporciona un enfoque mínimamente invasivo para la monitorización en tiempo real de la generación de RS durante la inflamación in vivo. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave sobre la inflamación y lesión posteriores a la defensa, como el papel de las RS en la inflamación y lesión pulmonar. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando comenzamos a estudiar el papel de las especies reactivas de oxígeno en la defensa del huésped para los tres modelos animales de generación de ROS mostrados en este video.Utilice ratones P 47 Fox nulos y ratones C 57 BL seis DBA con edad y sexo emparejados. Obtenga la aprobación para los experimentos del comité institucional de cuidado y uso de animales en preparación para la administración intratraqueal de xin. Esterilice la plataforma quirúrgica con etanol al 70 % y cúbrala con una gasa estéril.El procedimiento quirúrgico debe realizarse utilizando una bata quirúrgica limpia, guantes, mascarilla y instrumentos estériles para la anestesia. Llene el vaporizador de un sistema de administración continua de isoflurano con un 2 a 3 % de isoflurano y enciéndalo. Luego, coloque los ratones en la cámara de anestesia después de dos a tres minutos, y confirme que los ratones están completamente anestesiados realizando una compresión del dedo del pie y observando la respiración y el movimiento.La frecuencia respiratoria debe reducirse aproximadamente en un 50 %. A continuación, con una afeitadora, afeite el sitio de incisión en la parte frontal del cuello del ratón. Coloque el ratón sobre la plataforma quirúrgica en posición supina y coloque un cono nasal para mantener la anestesia. Aplique alternadamente Betadine y etanol al 70 % en el cuello tres veces.A continuación, utilizando tijeras quirúrgicas rectas y afiladas, corte la piel del cuello anterior aproximadamente 0,5 centímetros. Luego, con pinzas curvas, disecar el músculo alrededor de la tráquea para exponerla y administrar Xan por vía intratraqueal. Utilice una jeringa equipada con una aguja de calibre 27 para perforar la tráquea en la parte media entre los anillos cartilaginosos.Luego dirija la aguja hacia delante e inyecte lentamente un microgramo por gramo de peso corporal de Xan. Cierre la incisión con cinco puntos de sutura de nailon estéril después de la intervención. Coloque el ratón en una jaula de recuperación cubierta con papel plano y coloque la mitad de la jaula de recuperación sobre una almohadilla calefactora.Observe los ratones hasta que estén despiertos y se muevan libremente. Para realizar una ligadura y punción seca, afeite el abdomen de un ratón anestesiado con una máquina de afeitar y coloque el ratón sobre una plataforma quirúrgica en posición supina. Luego desinfecte el área quirúrgica con Betadine y etanol al 70 %.Como antes, utilizando un escalpelo, haga una incisión de 1,5 centímetros en la piel de la línea media abdominal con tijeras. Corte el peritoneo y abra la cavidad abdominal con un retractor para localizar y exponer el ciego, que se encuentra en el lado izquierdo de la cavidad abdominal. Exteriorice utilizando fórceps no traumáticos.A continuación, ligar el 50% distal del íleon expuesto con sutura de seda 4-0. Utilizar una aguja de calibre 21 para puncionar el íleon distal a la ligadura. Reemplazar el íleon en el abdomen.Utilice cuatro suturas de nailon estéril en O para cerrar la pared abdominal. Luego cierre la incisión con cinco suturas de nailon estéril. Administre 0,5 mililitros de solución salina con 2,5 microgramos de buprenorfina por vía subcutánea y realice la observación postoperatoria como antes.El tetracloruro de carbono oral es un modelo de lesión hepática dependiente de especies reactivas de oxígeno para administrar tetracloruro de carbono mediante gavaje oral, sujetando al ratón por la piel del pescuezo y anestesiándolo para mantener la cabeza alineada verticalmente con el esófago. A continuación, inserte la punta de una aguja de alimentación y dosificación de calibre 22 que contiene tetracloruro de carbono detrás de los incisivos, dirigiéndola hacia la parte posterior de la garganta y hacia abajo por el esófago, y presione el émbolo para administrar el tetracloruro de carbono. Observe la recuperación del ratón como antes, y las imágenes de bioluminiscencia deben obtenerse previo a la inducción de la producción de ERO, y a las cuatro y 20 horas posteriores a dicha inducción.Para hacer esto, abra el software de imagen en vivo 4.2. A continuación, inicialice el sistema de imagen ivus 200. Haga clic en inicializar y configure el sistema en modo de luminiscencia.Espere a que la temperatura del dispositivo acoplado por carga se estabilice, lo cual se indicará en la pantalla del software. Establezca el tiempo de exposición en 40 segundos. Luego, configure el Benning en posición media y la apertura del diafragma en un octavo.Coloque un ratón anestesiado en la cámara de imagen con la platina de control de temperatura y colóquelo en posición supina. Coloque un cono nasal para administrar anestesia como antes, dos minutos antes de cada captura de imagen. Utilice una jeringa de un mililitro con una aguja de calibre 27 para administrar 50 microlitros del derivado luminal L 0 1 2 por vía intravenosa.Realice una inyección retroorbital. Finalmente, adquiera imágenes y analícelas como se describe. En la siguiente sección del video, analice los datos recopilados utilizando el software Living Image versión 4.2 en el programa.Abra una imagen y haga clic en las herramientas de ROI en la paleta de herramientas. A continuación, en el menú de herramientas de ROI, seleccione la forma de ROI y haga clic en el círculo de la lista desplegable. Seleccione el número de ROI que se agregarán a la imagen.Ajuste la posición de la ROI sobre el tórax y/o abdomen para cuantificar la intensidad de la señal o el flujo de fotones a partir de la región de interés en el menú de herramientas ROI. Haga clic en el botón de medir para abrir la tabla de mediciones ROI, que muestra los datos de todas las ROI creadas en las imágenes. Utilice un paquete de software de análisis estadístico para realizar un ANOVA de dos vías de novo con prueba post hoc de Bonferroni en puntos de tiempo individuales para comparar la generación de ERO en los pulmones de tipo silvestre y deficiente en oxidasa de N-A-D-P-H.Ratones P 47 Fox nulos tras el desafío con Xan. Se administró Xan como se describe en este video en los puntos básicos de cuatro y 24 horas. Los ratones fueron imagenados como se muestra aquí.Hubo un aumento significativo en la emisión de luz en el tórax en los ratones de tipo salvaje, pero no en los ratones P 47. Fox sno, a las cuatro horas y 24 horas en comparación con la línea base. Esto sugiere que la NADPH oxidasa es la principal fuente de generación de ERO en los pulmones tras la administración de XUS Sand.A continuación, se evaluó la producción de ERO en el modelo de sepsis inducida por CLP. La sepsis es un síndrome potencialmente mortal asociado con lesión de órganos terminales, incluyendo lesión pulmonar aguda y síndrome de distrés respiratorio agudo. Se ha considerado que la lesión mediada por ERO es un factor importante que contribuye a la disfunción multiorgánica inducida por la sepsis.Como se muestra en este gráfico, las ERO fueron significativamente aumentadas sobre el tórax cuatro horas después de la CLP y sobre el abdomen 24 horas después de la CLP en ratones de tipo silvestre. Sin embargo, los niveles de ERO en ratones nulos para P 47 Fox fueron similares a los niveles basales en ambos puntos temporales. Estos resultados muestran que la generación de ERO en el modelo de ratón de sepsis inducida por CLP depende de la oxidasa de N-A-D-P-H.Finalmente, se utilizó imágenes bioluminiscentes para detectar la producción de ERO en un modelo de lesión hepática inducida por tetracloruro de carbono. En contraste con los modelos previamente descritos de inflamación y lesión, la producción de ERO en el abdomen aumentó modestamente, aproximadamente un 35 % respecto al valor basal, en ratones P 47, Fox nulos cuatro horas después de la administración de tetracloruro de carbono. Sin embargo, la magnitud de la generación de ERO inducida por tetracloruro de carbono fue significativamente mayor en ratones silvestres que en ratones P 47, Fox nulos.Estos datos sugieren que tanto la generación de ERO dependiente como independiente de la NADPH oxidasa que contiene P 47 Fox ocurren en la lesión hepática aguda inducida por cloruro de carte. El resultado de la imagen de bioluminiscencia demostró un aumento en los niveles de ERO en ratones Wildtype en comparación con P 47 Knock Mized, lo que indica que la DPH oxidasa es una fuente importante de generación de ERO en respuesta a un estímulo inflamatorio.Este método proporciona un enfoque mínimamente invasivo para la monitorización en tiempo real de la generación de RS durante la inflamación in vivo.

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Investigación

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