Name: Afinidad La precipitación de los activos Rho GEFs El uso de un GST-etiquetados mutante de la proteína Rho (GST-RhoA (G17A)) a partir de lisados de células epiteliales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Aprende a rastrear la activación de GEFs específicos de RhoA en células cultivadas mediante precipitación con proteína GST-RhoA mutante. Este método permite detectar y cuantificar factores de intercambio activados mediante Western blot.

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Este trabajo fue financiado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud (CIHR) (MOP-97774) y de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC, subvención n º: 480619). KS es un receptor de un Premio al Investigador KRESCENT Nueva (un premio conjunto de la fundación del riñón de Canadá, canadiense de Nefrología Sociedad y el Instituto Canadiense de Investigación en Salud) y un premio de los primeros investigadores del Ministerio de Ontario de Investigación e Innovación. FW con el apoyo de una beca de Shing Li Ka.

1. Transformación de E. E. con el pGEX-RhoA (G17A) Construir <ol><li> Preparar LB-agar por disolución de 2,5 g de LB y agar al 1,5 g en 100 ml de dH 2 O. Autoclave y enfriar a un estimado de 50-55 ° C, que como regla general, es cuando el frasco se hace cómodamente. </li><li> Preparar ampicilina (Amp) stock de disolución de 50 mg / ml en dH 2 O. Filtro de jeringa y la congelación alícuotas utilizadas. Añadir 100 l de stock de Amp (concentración final 50 ug / ml) para el LB-agar de 1,1. Agite para mezclar y verter en platos de 10 cm de bacterias (15-20 ml / placa). Permita que se solidifique (15-30 min.) Y almacenar las placas utilizadas invertidos a 4 ° C durante 2-3 semanas. </li><li> Para transformar E. Coli, rápidamente descongelar una alícuota de células competentes DH5a en un baño de hielo. Añadir 1 ml de pGEXRhoA (G17A) ADN diluido a 25-50 ng / l. Flick el tubo para mezclar e incubar en hielo durante 30 minutos. De choque térmico a 42 ° C durante 45 segundos y volver a meterla en hielo durante 2 minutos. Añadir 900 y mu; L medio SOC y crecer durante una hora a 37 ° C con agitación. </li><li> Extender 50-100 l de las bacterias transformadas en una placa de agar LB-Amp-utilizando una pipeta Pasteur estéril doblada. Se incuba la placa lateral derecho en una incubadora a 37 ° C durante 5 minutos y después invertir y crecer durante la noche. </li><li> Una sola colonia se recogió de la placa para la preparación de la proteína GST-etiquetados (paso 2,1). Para uso futuro, las placas de envolver y almacenar invertida a 4 ° C durante aproximadamente 3 semanas. Además, las cepas bacterianas se pueden preparar para el almacenamiento más prolongado por crecientes colonias individuales en 2 ml estéril LB-Amp durante la noche a 37 ° C con agitación. Mezclar una alícuota con glicerol estéril 80% en una proporción de 1:1 y congelar a -80 ° C. </li></ol> 2. Preparación de GST-RhoA (G17A) Cuentas <ol><li> Preparar LB mediante la adición de 25 libras a 1 g L dH 2 0 y esterilización en autoclave. Cuando se enfríe, se añaden 50 amperios l de la acción a 50 ml de LB (50 g / ml concentración final). Inocular con un colega y aisladosony de bacterias transformadas y crecer durante la noche a 37 ° C con agitación. Cuando en la densidad total (OD 600&gt; 1,0) se diluye con 450 ml de LB-Amp y crecer durante 30 minutos a 37 ° C. </li><li> Preparar una solución 100 mM de stock de isopropilo BD-tiogalactopiranósido (IPTG) por disolución de 0,238 g en 10 ml de dH 2 O. Almacenar en alícuotas a -20 ° C. Inducir bacterias para producir proteína Rho mediante la adición de 500 l de 100 mM de IPTG al cultivo de 500 ml (una concentración final de 100 mM). Reduzca la temperatura a 22-24 ° C y crecer durante aproximadamente 16 horas h. </li><li> Haga girar la cultura en 3600 g durante 10 minutos a 4 ° C. Si es necesario, la cultura 500 ml se pueden dividir en tubos de 50 ml para centrifugación. Congelar precipitado (s) para al menos 1 hora (o preferiblemente durante la noche) a -80 ° C. </li><li> Preparar 200 ml de tampón de lisis que contenía HEPES 20 mM (0,95 g) / pH 7,5; 150 mM de NaCl (1,75 g); 5 mM de MgCl 2 (0,203 g); 1% TX-100 (2 ml). Preparar las soluciones madre de 1 M de TDT (1.542 g en 10 ml de H2O) Y 100 mM de PMSF (0,174 g/10 ml de EtOH). Para preparar + tampón de lisis, suplementar 10 ml con 1 mM DTT (10 l de stock) y 1 mM de PMSF (100 l de stock) y una tableta completa proteasa Mini inhibidor. </li><li> De Trabajo sobre el hielo, añadir 10 ml de solución amortiguadora de lisis + para los pellets desde el paso 2.3. Resuspender bien por agitación suave y pipetear. Evite la formación de espuma. Soníquelos en hielo durante 1 minuto a establecer 4 con 50% de impulsos. Haga girar el lisado sonicado a 15.000-20.000 g durante 15 minutos a 4 ° C, y eliminar el sonicado clarificado (sobrenadante) a un tubo estéril tapado de 15 ml. </li><li> Preparar el glutatión Sefarosa suavemente la mezcla del tubo original que contiene una suspensión del 75% y 335 l de transferencia en un tubo de 15 ml. Utilice una punta de taladro de ancho a pipetear los granos. Añadir 10 ml de PBS frío, y girar 500 g durante 5 minutos a 4 ° C. Descartar el sobrenadante, añadir 1 ml + tampón de lisis de las cuentas y girar como para el lavado anterior. Deseche el tampón de lisis + sobrenadante y agregar a hacer una suspensión al 50%. </li><li> Añadir 250 ml de equilibrated suspensión talón al sobrenadante del paso 2,5. Girar a 4 ° C durante 45 minutos. </li><li> Preparar 500 ml de HBS que contiene HEPES 20 mM (2,38 g) / pH 7,5 y 150 mM de NaCl (4,38 g) en dH 2 O. Preparar las soluciones madre de 1 M de MgCl 2 (0.952 g en 10 ml de dH 2 O) y 1 M de TDT (1.542 g en 10 ml de H2O). Para preparar HBS +, completar 100 ml justo antes de usarse con 5 mM de MgCl 2 (50 l de las existencias) y 1 mM de DTT (100 l de caldo). </li><li> Haga girar las bolas de paso 2,7 a 500 g durante 5 minutos a 4 ° C. Deseche las cuentas sobrenadante y lavar con 10 + 2x ml de tampón de lisis, y 2 veces con 10 ml de HBS +. Después del lavado final, hacer una suspensión al 50% en resuspender las perlas en HBS + suplementadas con BD BaculoGold inhibidor de la proteasa (20 l de 50x BD BaculoGold / ml). </li><li> Diluir 10 l de la preparación final de perlas con tampón de muestra Laemmli 2x que contenía β-mercaptoetanol. Haga albúmina sérica bovina (BSA) las normas. Utilice una dosis de 2 mg / ml de caldo (0,02 g de BSA en un0 ml de H2O). Se mezclan 10 l de acción con 10 l de Laemmli (20 mg final), 5 ml de acciones con 5 ml de H 2 O y 10 l de Laemmli (10 mg final), y 2,5 l de valores con 7,5 l DH 2 O y 10 l de Laemmli (5 g final). Hervir todas las muestras (5 min). Derivado de la muestra de perlas y ejecutar sobrenadante con las normas de BSA y marcadores de peso molecular en un 10% de SDS-gel de poliacrilamida. </li><li> Preparar el Comassie mancha azul (0,1 g en 10 ml de ácido acético, 40 ml de metanol y 50 ml de dH O 2) y la solución destain (500 ml DH 2 O, 400 ml de metanol y 100 ml de ácido acético). Guarde a temperatura ambiente. Teñir el gel durante 20-30 minutos, retire el tinte (que puede ser reutilizado varias veces) y enjuague con una solución de destain dos veces. Continuar destain con agitación suave durante varias horas hasta que las bandas son claramente visibles. </li><li> Calcular la concentración de GST-RhoA (G17A) acoplado a las perlas usando los estándares de BSA como una referencia (Fig. 2). Aliquot un volumen igual de perlas que contienen ~ 10-15 ug de proteína en 1,5 ml micro tubos de centrífuga. Tienda de cuentas a 4 ° C para utilizar en un día. Congelar a -80 ° C en HBS + / glicerol en una proporción de 3:1 a utilizar en unos pocos días. </li></ol> 3. FMAM Pulldown ensayo con nucleótidos libres de RhoA (G17A) Cuentas <ol><li> Se cultivan las células en platos de 10 cm a la confluencia. Suero privar durante al menos 3 horas y tratar según sea necesario. </li><li> Preparar buffer de lisis + como en el paso 2.4. Preparar suficiente solución amortiguadora de lisis para 700 l / plato, más una cierta cantidad adicional para permitir errores de pipeteo. Añadir los inhibidores de la proteasa justo antes de su uso. </li><li> De Trabajo sobre el hielo, retire medio de cultivo de los platos y lavar con helado de HBS. Retire toda la HBS y añadir 700 l de tampón de lisis a cada plato. Placas del remolino para cubrir todas las áreas, raspar y obtener lisados ​​en numerados tubos de 1,5 ml. Gira a 15.000 g durante 1 min a 4 ° C. El sobrenadante se utiliza para el ensayo. </li><li> Si su número de celular es equivalente en todos loslos platos que se prueba, se puede omitir hacer un ensayo de la proteína, y vaya al paso 3.5. De lo contrario medir la concentración de proteína de cada sobrenadante utilizando Bio-Rad ensayo de proteínas rápida e igualar el sobrenadante para el volumen y la concentración. La cantidad de proteína total depende de los tipos celulares utilizadas (normalmente 1-1,5 mg de proteína para células LLC-PK1). </li><li> Retire 30 l de cada sobrenadante y se mezcla con un 30 2x l muestra la reducción de tampón de Laemmli, hervir y dejar de lado para el paso 3.7. Añadir el resto de los sobrenadantes de las alícuotas de IVA-RhoA (G17A) bolas de paso 2,12. Girar durante 45 minutos a 4 ° C. </li><li> Haga girar cuentas en 6800 g por 10 segundos a 4 ° C. Se desecha el sobrenadante y lavar las perlas 3x con tampón de lisis, girando en la misma manera entre lavados. Eliminar completamente el último lavado con una jeringa de 1 cc equipado con una aguja de 30 G y se añaden 20 l 2x reducción de tampón de Laemmli muestra. Hervir durante 5 minutos. Girar para cuentas de pellets y, o bien ejecutar el sobrenadante de inmediato (de preferencia) o guardado en unt -80 ° C para su posterior análisis. </li><li> Ejecutar 20 l lisados ​​celulares totales y todas las muestras de proteínas precipitadas sobre el porcentaje adecuado de SDS-gel de poliacrilamida para el tamaño del FMAM que se está estudiando. Detectar el FMAM de elección a través de Western Blot utilizando un anticuerpo específico. </li></ol> 4. Los resultados representativos Parte 1 y 2 del protocolo describe la preparación de GST-RhoA (G17A), junto a GSH-sepharose bolas y su análisis por SDS-PAGE (véase la descripción del protocolo en la figura 1). Un típico gel teñido con Coomassie se muestra en la figura 2. La muestra con la proteína eluida debe contener una sola banda a aproximadamente 50 kDa (Fig. 2, carril 6). La concentración de la proteína se puede estimar usando las muestras de referencia de BSA. En el ejemplo de la figura 2, la concentración de RhoA (G17A) se estima en 15 μg/10 l. Por lo tanto, partes alícuotas de 10 l / tubo se prepararon. El rendimiento típico<html> en nuestra mano es de 15-20 g de proteína de 10 ml de lisis bacteriana. Parte 3 del protocolo describe el ensayo de la precipitación de afinidad (véase el resumen en la figura 1). Un exitoso ensayo del FMAM detectar la activación del factor de cambio del FMAM-H1 se muestra en la Fig. 3. El RhoA (G17A) capturaron a algunos de proteínas del FMAM-H1 desde el control (sin tratamiento) lisados ​​celulares, lo que sugiere que el FMAM-H1 tiene actividad basal. La cantidad precipitada sin embargo, aumenta en las células tratadas con la citoquina de necrosis tumoral α-inflamatoria del factor (TNF-α), en consonancia con la idea de que el TNF-α activa del FMAM-H1 5,7. Es importante destacar que los lisados ​​celulares totales muestran una cantidad similar de FMAM-H1 en el control y la muestra tratada, lo que sugiere que el tratamiento no alteró los niveles del FMAM-H1 y el insumo utilizado en el ensayo es igual. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig1.jpg" /> Figura 1. Visión general del protocolo. ove_content &quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig2.jpg" /> Figura 2. Resultado representativo del protocolo de preparación de talón. Un gel teñido con Coomassie con éxito GST-RhoA (G17A) la preparación de perlas se muestra. Muestra de bolas y las normas BSA proteínas se separaron por SDS-PAGE usando un gel de acrilamida al 10%. Para probar las perlas, 10 l de la suspensión final de talón que contiene GST-RhoA (G17A) se diluyó 1:1 con la reducción de tampón de muestra de Laemmli y se hierve durante 5 minutos. Las perlas se centrifugaron brevemente y el sobrenadante cargado en el gel. Las siguientes muestras fueron cargados: Pista 1: marcador de peso molecular (MW) (FroggaBio Blueye teñidos escalera de proteína), carriles 2-4: 5 mg, 10 y 20 de albúmina de suero bovino (BSA), carril 5 está vacío; Carril 6: 10 l de las recién preparadas RhoA (G17A) cuentas. Después de la separación se ha completado, el gel se tiñe con azul de Coomassie y posteriormente se destiñó para revelar las proteínas. El peso molecular de la GST-RhoA (G17A) de proteínas es de aproximadamente 50<html> kDa y corre alrededor del nivel del marcador 48 kDa. La concentración de la proteína GST-Rho en este ejemplo particular, se estima que es alrededor de 15 μg/10 suspensión l. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig3.jpg" /> Figura 3. Representante del FMAM ensayo de la activación de TNF-α que muestra la activación inducida del FMAM-H1. Confluentes LLC-PK1 células fueron tratadas con 10 ng / ml de TNF-α durante 5 minutos. Después del tratamiento las células se lisaron y GEFs activos fueron capturados utilizando GST-RhoA (G17A) perlas unidas. La presencia del FMAM-H1 en las proteínas precipitadas (mancha superior) y el total de muestras de lisado celular (mancha la parte inferior) se detectó mediante Western Blot con un anticuerpo anti-FMAM-H1 (Señalización Celular). Por favor, tenga en cuenta la mayor cantidad de precipitado del FMAM-H1 en el TNF-α-tratadas en comparación con células no tratadas en relación con las entradas equivalentes, lo que indica un resultado exitoso. 3932/3932fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Un &quot;mal resultado&quot;. Aunque el ensayo de telecine FMAM se muestra aquí como resultado de alguna FMAM-H1 capturados por las perlas, las cantidades precipitó de control y el TNF-α-células tratadas son los mismos. Así, el TNF-α, un activador de conocimientos del FMAM-H1 en este caso, no inducir la activación. En este experimento posterior solución de problemas en particular sugiere que el TNF-α utilizado no era lo bastante fresco y degradado, probablemente.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método que aquí se presenta es el único disponible no radiactivo ensayo de activación para GEFs que pueden seguir a la piscina activa de GEFs en las células. El ensayo es similar a los ensayos de precipitación se utilizan para la activación de las pequeñas GTPasas siguiente, así como contra GEFs Rac y Cdc42. Estos ensayos utilizan diferentes proteínas GST-etiquetados y tienen ligeras diferencias respecto a la que se describe aquí, sin embargo los pasos básicos son los mismos. Así, este protocolo puede ser fácilmente adaptado para otros pequeños GTPasa y ensayos FMAM activación. El ensayo presentado FMAM fue modificada recientemente para la aplicación de las fracciones nucleares 9,10. Con nuevas modificaciones, en las pruebas de la activación del FMAM en otros compartimentos subcelulares También podría ser posible. Usamos el método que se presenta para estudiar la activación de GEFs en líneas de células epiteliales 5,6,7. Con algunos de optimización, este ensayo debe ser adecuada para detectar GEFs desde cualquier línea celular. Cuando adapting a un tipo específico de célula, encontrar el número de células óptima, el volumen de tampón de lisis, y el método de detección para el GEF a ensayar (un anticuerpo bueno para Western Blot es importante). Para la configuración inicial del ensayo, es aconsejable utilizar un estímulo que se conoce para activar el GEF de interés. Cuando se utiliza un estímulo desconocido, use siempre un control positivo para verificar que su ensayo está funcionando. Este ensayo se puede utilizar para detectar la activación de GEFs conocidos por Western Blot. Sin embargo, también es adecuada para identificar GEFs desconocidos. Para ello, GEFs capturados de control y las muestras estimuladas deben ser analizados en un gel de Coomassie manchado. Las bandas que aparecen sólo en las muestras estimuladas puede contener GEFs activados y pueden ser enviados para su identificación por espectrometría de masas (por ejemplo, 5). Por último, una nota de advertencia. El ensayo se basa en la suposición de que las modificaciones post prestan GEFs activos se conservan después de la lisis celular. De hecho, este es claramente el case para un número de GEFs, y desde sus establecimientos, este ensayo ha sido utilizado por diversos grupos para detectar la activación de GEFs diferentes, incluyendo FMAM-H1, p115RhoGEF y XPLN (por ejemplo, 5,11,12,13). La preservación del estado activo sin embargo, no puede ocurrir en el caso de todos los GEFs, y por lo tanto, es concebible que este ensayo no funcionará para todos GEFs. También hay que señalar, que muchos GEFs ejercen actividad hacia más de un GTPasas pequeñas. Así, cuando un determinado FMAM se estudia, se recomienda complementar este análisis con los ensayos de precipitación del FMAM para otras GTPasas pequeñas, así como los estudios funcionales que examinan RhoA, Rac1 y Cdc42. Los pasos críticos en el protocolo: Las colonias de bacterias transformadas deben ser recogidos a partir de placas frescas, preparadas adecuadamente para asegurar la selección adecuada de amperios, fruto bueno y el rendimiento. Las condiciones de transformación de células competentes obtenidas de otras fuentes puede variar y debe ser consultado. </p&gt; Todas las etapas del protocolo de preparación de proteína (del paso 2,3) y el ensayo (del paso 3,2) debe ser realizada a 4 ° C con soluciones enfriadas y centrífugas. Lisis bacteriana (paso 2,5) debe ser exhaustiva y completa a fin de obtener una suspensión homogénea. Cuando la lisis de las bacterias, vórtice y pipetear el lisado alternativamente, mientras se mantiene a 4 ° C y asegurar sonicación se lleva a cabo en hielo para evitar la desnaturalización de la proteína. Si se utiliza un modelo diferente de sonicador, las condiciones pueden ser necesario ajustar. La incubación de sonicado con las perlas siempre debe hacerse a 4 ° C en un rotador para asegurar unión suficiente, y se debe tener cuidado de mantener la sincronización consistente. GST-Rho mutantes son algo inestables cuando se expresa en las bacterias, así que lo mejor es utilizar cuentas de preparados de inmediato o en unos pocos días. El ensayo de precipitación (Parte 3) es el tiempo y la temperatura sensible, uns GEFs activos pueden perderse fácilmente a partir del lisado de células, de modo que los pasos deben realizarse lo más rápidamente posible. La siguiente sección contiene algunos consejos sobre cómo solucionar problemas. No o muy baja cantidad de proteína mutante Rho en la preparación perla final: Esto puede ser causado por inducción ineficaz, insuficiente lisis de las bacterias, o una pérdida de la proteína durante el proceso de preparación o el almacenamiento. Para ayudar a solucionar algunas de estas posibilidades, las muestras de bacterias pueden ser analizados antes y después de la inducción. Si hay inducción pobre de la proteína repetir el proceso usando una colonia de una placa recién rayado o de la re-transformadas células competentes. Las diferentes concentraciones de IPTG y los tiempos de inducción también debe ser probado. Si la lisis es insuficiente (es decir, la proteína permanece en el sedimento en lugar del sobrenadante) variando las concentraciones de sal y detergente en el tampón de lisis puede ser tratado. Tiempos de sonicación y suplentesajustes deben ser considerados, y las muestras antes y después de la sonicación puede ser comprobado por microscopía para determinar la eficiencia de la lisis. N precipitó FMAM, aunque el GST-proteína está presente en los granos: Esto puede ser debido a problemas técnicos durante el ensayo de precipitación, o por una ausencia real de activación de la FMAM estudiado utilizando el estímulo aplicado. Siempre use un estímulo conocido como un control positivo para verificar que su ensayo funciona. Utilizar las cuentas preparadas en pocos días. Si el ensayo de precipitación captura cantidades no detectables de la FMAM estudiados en todas las condiciones, compruebe que su FMAM está presente y es bien detectable en el sobrenadante después de centrifugación que se va a utilizar para el ensayo (paso 3,3). Asegúrese de que todos los tampones y los inhibidores de la proteasa son frescos, y realizar todos los pasos sobre el hielo lo más rápido posible. Aumentar la cantidad de proteína de entrada (por ejemplo, mediante el uso de lisados ​​de 2 placas / muestra). Si el ensayo de precipitación muestra basal precipitaciónción de la FMAM, pero no hubo diferencia se ve entre el testigo y las muestras estimuladas (Fig. 4), inicie la solución de problemas mediante la verificación de que el estímulo aplicado trabajado con otros efectos conocidos (por ejemplo, mediante la detección de la activación de otras vías de señalización). Considere la posibilidad de cambiar las condiciones de tratamiento y / o concentraciones. Confíe en los datos de la presentación de informes la literatura como su estímulo activa Rho o la señalización de otros tiempos para predecir probables y las concentraciones. Al optimizar el tiempo de tratamiento, utilice los dos puntos de tiempo corto y largo plazo, como la activación del FMAM podría ser la mejor detectable en un punto de tiempo antes de la activación de Rho y detectable. Finalmente, el mismo estímulo podría resultar en un grado variable de activación debido a un cambio en la respuesta de las células causada por el número de pases, células confluencia, etc

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> pGEX-RhoA (G17A) </td><td> Addgene </td><td> Estará disponible muy pronto </td><td> Generada en el laboratorio del doctor Keith Burridge (Universidad de Carolina del Norte) (Ref. 3) </td></tr><tr><td> DH5a </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> Tienda de -80 ° C </td></tr><tr><td> Medio SOC </td><td> Bioshop </td><td> SOC001.10 </td><td></td></tr><tr><td> LB </td><td> Bioshop </td><td> LBL407.1 </td><td> Mantener estériles </td></tr><tr><td> Glicerol </td><td> Bioshop </td><td> GLY002.1 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicilina </td><td> Bioshop </td><td> AMP201.25 </td><td> Tienda de valores a -20 ° C </td></tr><tr><td> Agar </td><td> Bioshop </td><td> AGR001.500 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (IsoBD-propilo thiogalacto-piranósido) </td><td> Calbio-química </td><td> 420322 </td><td> Tienda de solución madre a -20 ° C </td></tr><tr><td> Glutatión Sepharose </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0756-01 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> SIGMA </td><td> D1408 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> SIGMA </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Bioshop </td><td> SOD001.10 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> SIGMA </td><td> M-9272 </td><td> Añadir justo antes de usarse </td></tr><tr><td> TX-100 </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> TDT </td><td> OmniPur EMD </td><td> 3860 </td><td> Añadir justo antes de usarse </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> SIGMA </td><td> P-7626 </td><td> Añadir justo antes de usarse </td></tr><tr><td> Inhibidor de la proteasa 50x </td><td> BD-Baculo de Oro </td><td> 51-21426Z </td><td> Añadir justo antes de usarse </td></tr><tr&gt; <td> Completa el Mini, EDTA libre de 10x </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td> Añadir justo antes de usarse </td></tr><tr><td> Laemmli tampón de muestra 2x </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> SIGMA </td><td> M7154 </td><td> Añadir justo antes de usarse </td></tr><tr><td> Azul Brillante de Coomassie </td><td> Bio-Rad </td><td> R-250 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido Acético </td><td> CALEDON </td><td> 1000-1 </td><td></td></tr><tr><td> El metanol </td><td> CALEDON </td><td> 6701-7 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Rad Protein Assay </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0114 </td><td></td></tr><tr><td> Blueye escalera </td><td> FroggaBio </td><td> PM008-0500 </td><td></td></tr></tbody></table> Reactivos Tabla 1. Utilizado. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de equipo </td><td> Empresa </td&gt; <td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> RC-5B centrífuga </td><td> Sorvall </td><td> Rotor SS-34 </td><td> Utilice a 4 ° C </td></tr><tr><td> Centrifugar </td><td> Sorvall-Thermo Scientific </td><td> ST-16R </td><td> Utilice a 4 ° C </td></tr><tr><td> Centrífuga Micro </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> Utilice a 4 ° C </td></tr><tr><td> Bacteriana agitador </td><td> Infors HT Ecotron </td><td> AG CH-1403 Bottmingen </td><td> Utilice a 37 ° C o 22 ° C </td></tr><tr><td> Sonicator </td><td> Branson </td><td> Sonifier-450 </td><td> Utilizar a temperatura ambiente </td></tr><tr><td> Rotator </td><td> Glas-Col </td><td> 099A CR4012 </td><td> Utilice a 4 ° C </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Específicos ocasiones.

afinidad la precipitación de los activos rho gefs el uso de un gst-etiquetados mutante de la proteína rho (gst-rhoa (g17a)) a partir de lisados ​​de células epiteliales

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

Las proteínas de la familia Rho de GTPasas pequeñas son reguladores centrales del citoesqueleto, y controlar una gran variedad de procesos celulares, incluyendo la migración celular, la expresión génica, la progresión del ciclo celular y el 1 de adhesión celular. Las proteínas Rho son los interruptores moleculares que actúan en GTP e inactivas en el PIB unido a Estado. Su activación está mediada por una familia de guanina-intercambio de nucleótidos de los factores (FMAM) de las proteínas. Rho-GEFs constituyen una gran familia, con la superposición de las especificidades 2. Aunque mucho progreso se ha hecho en la identificación de los GEFs activadas por señales específicas, todavía hay muchas preguntas pendientes acerca de la regulación de la vía específica de estas proteínas. El número de Rho-GEFs supera el 70, y cada célula expresa más de una proteína del FMAM. Además, muchas de estas proteínas no sólo activan Rho, pero otros miembros de la familia, contribuyendo además a la complejidad de las redes de regulación. Es importante destacar que, la exploración decómo GEFs están regulados requiere un método para seguir la piscina activa de GEFs individuales en las células activadas por estímulos diferentes. Aquí le ofrecemos un protocolo de paso a paso un método para evaluar y cuantificar los activos disponibles de Rho-específicas GEFs utilizando un ensayo de la precipitación de afinidad. Este ensayo fue desarrollado hace unos años en el laboratorio Burridge 3,4 y lo hemos utilizado en las líneas de células renales tubulares 5,6,7. El ensayo se aprovecha de un &quot;nucleótido libre&quot; mutante RhoA, con una alta afinidad por GEFs activos. La mutación (G17A) hace que la proteína incapaz de unirse PIB o el GTP y este estado imita el estado intermedio que se enlaza con el FMAM. Una versión GST-etiquetados de esta proteína mutante se expresa y se purificó a partir de E. coli, unidos a perlas de glutatión sefarosa y se utiliza para precipitar GEFs activos a partir de lisados ​​de células no tratadas y estimulados. Como la mayoría de GEFs se activan a través de modificaciones postraduccionales o la liberación de los enlaces de inhibidores, su estado activose conserva en lisados ​​de células, y pueden ser detectados por este ensayo 8. Proteínas capturadas se puede probar de GEFs conocidos por la detección de anticuerpos específicos mediante Western Blot, o analizados por espectrometría de masas para identificar GEFs desconocidos activados por ciertos estímulos.

El método aquí presentado describe un ensayo para seguir la activación de RhoA específicos PIB / GTP Factores de cambio (GEFS) en células cultivadas, haciendo uso de una proteína de fusión GST RhoA mutante que tiene una alta afinidad por GEFs activados. GEFs se precipitan a partir de lisados ​​celulares, detectados por Western Blot y cuantificados por densitometría.

Afinidad La precipitación de los activos Rho GEFs El uso de un GST-etiquetados mutante de la proteína Rho (GST-RhoA (G17A)) a partir de lisados ​​de células epiteliales

Las proteínas de la familia Rho de las GTPasas pequeñas son reguladores centrales del citoesqueleto y controlan una gran variedad de procesos celulares, incluida la célula...

El objetivo general de este procedimiento es seguir la activación de RO, un factor específico de intercambio de G-D-P por G-T-P o GAF, en células en cultivo, haciendo uso de una proteína de fusión mutante RO-GST que tiene alta afinidad por las proteínas G activadas. Esto se logra primero produciendo la proteína mutante RO marcada con GST en bacterias. A continuación, se purifica la proteína RO-GST inmovilizada en perlas.Luego, se evalúa la pureza y concentración de la proteína GST RO A mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. Finalmente, se preparan lisados celulares y se realiza un ensayo de precipitación de GEF con la proteína GST RO A. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran un aumento en la precipitación de GS activada en células tratadas mediante análisis por inmunotransferencia de las proteínas precipitadas con un anticuerpo específico anti GF y cuantificación por citometría de densidad.Este método puede ayudar a responder una serie de preguntas interesantes en el campo de los GTPS brutos, como por ejemplo cómo se regulan de manera específica para la señal las numerosas proteínas de intercambio de G-D-P por G-T-P, y cómo se coordina su actividad. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades inicialmente porque la proteína GST RO G 17 A es relativamente inestable y puede degradarse durante la preparación. También es importante recordar realizar el ensayo de precipitación de GF de forma rápida y consistente. Esta técnica será demostrada por Pfizer Vahid, un estudiante de maestría de mi laboratorio, para transformar e coli.Coloque rápidamente un cuarto de células competentes DH5α en un baño de hielo y agregue un microlitro de ADN PX row A G 17 A a una concentración de 25 a 50 nanogramos por microlitro. Agite suavemente el tubo para mezclar e incube en hielo durante 30 minutos. Someta las células a un choque térmico a 42 grados Celsius durante 45 segundos y luego regrese el tubo a hielo durante dos minutos.Añada 900 microlitros de medio de calcetín y cultive durante una hora a 37 grados Celsius con agitación. Utilizando una pipeta estéril para pasta doblada, distribuya de 50 a 100 microlitros de las bacterias transformadas sobre una placa de agar LB y persina preparada previamente. Incube la placa en posición normal en un incubador a 37 grados Celsius durante cinco minutos y luego inviértala y cultive durante la noche.Seleccione una colonia bien aislada de bacterias transformadas y úsela para inocular 50 mililitros de LB con ampicilina. Incube durante la noche a 37 grados SIU con agitación. Cuando el cultivo haya alcanzado la densidad máxima, dilúyalo con 450 mililitros de LB con ampicilina y continúe el crecimiento durante 30 minutos adicionales. A 37 grados Celsius, induzca la producción de la proteína fila añadiendo 500 microlitros de IPTG 100 milimolar a un cultivo de 500 mililitros.Reduzca la temperatura a entre 22 y 24 grados Celsius y cultive durante aproximadamente 16 horas. Centrifugue el cultivo a 3.600 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Congele los pellet durante al menos una hora o, preferiblemente, durante la noche a menos 80 grados Celsius.Después de preparar 200 mililitros de tampón de lisis según se indica en el protocolo escrito, prepare el tampón de lisis plus suplementando 10 mililitros con DTT de un milimolar, PMSF de un milimolar y una tableta de inhibidor de proteasas, trabajando sobre hielo. Añada 10 mililitros de tampón de lisis plus a los pellet de Thor y mezcle bien mediante pipeteo y vortexado. Sone la suspensión sobre hielo durante un minuto en el nivel cuatro con pulso al 50 %.Centrifugar el lisado sonicado a 15.000-20.000 ×g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius y transferir el sobrenadante clarificado a un tubo estéril de 15 mililitros con tapa. Preparar las perlas de glutatión esféricas mezclando suavemente la suspensión al 75 % y utilizando una punta de gran apertura para transferir 335 microlitros a un tubo de 15 mililitros. Añadir 10 mililitros de PBS frío y centrifugar a 500 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.Deseche el agente sobrenadante. Añada un mililitro de tampón de lisis más a las perlas y centrifugue nuevamente. Deseche el sobrenadante otra vez y añada tampón de lisis.Además, para preparar una suspensión al 50 %, mezcle dos porciones de 50 microlitros de suspensión de perlas equilibrada con el sobrenadante preparado. Incube en rotación a cuatro grados Celsius durante 45 minutos. Prepare HBS más suplementando 100 mililitros de tampón HBS con cloruro de magnesio 5 milimolar y DTT 1 milimolar. Centrifugue el sobrenadante y las perlas a 500 × g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.Deseche el sobrenadante y lave las perlas dos veces con 10 mililitros de tampón de lisis más y dos veces con 10 mililitros de HBS más. Después del último lavado, prepare una suspensión al 50 % resuspendiendo las perlas en HBS más suplementado con inhibidor de proteasas. Diluya 10 microlitros de la preparación final de perlas con buffer muestral lam ly dos veces que contenga beamr cap dos etanol.Luego prepare tres muestras patrón de BSA mezclando 10 microlitros, 5 microlitros y luego 2,5 microlitros de una solución stock de BSA de dos miligramos por mililitro con 10 microlitros de tampón lammy.Hervir las muestras durante cinco minutos, luego centrifugar brevemente y correr todas junto con un marcador de peso molecular en un gel de poliacrilamida SDS al 10 %. Después de teñir y desentintar el gel, estimar la GST row A G 17 A utilizando los patrones de albúmina sérica bovina (BSA) como referencia. Aliquotar un volumen igual de perlas que contenga alrededor de 10 a 15 microgramos de proteína en tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros. Para preparar el ensayo de precipitación con GF, cultivar las células que se van a usar hasta confluencia en placas de 10 centímetros y privarlas de suero durante al menos tres horas antes del ensayo.Inmediatamente antes del inicio del ensayo, prepare el tampón de lisis con inhibidores de proteasas sobre hielo. Retire el medio de cultivo de las placas y lave con HBS frío.Retire todo el HBS y agregue 700 microlitros de tampón de lisis más a cada placa. Incube las placas para que el tampón cubra todas las áreas.Luego raspe y recolecte los lisados en tubos numerados de 1,5 mililitros. Centrifugue a 15.000 ×g durante un minuto a cuatro grados Celsius. Guarde el sobrenadante para el ensayo; si el número de células fue equivalente en cada placa, retire 30 microlitros de cada sobrenadante y mezcle con 30 microlitros de tampón muestral reductor al doble.Luego hierva y coloque en hielo. Añada los sobrenadantes restantes a alícuotas de perlas de GST roa G 17 A y rote durante 45 minutos a cuatro grados Celsius. Centrifugue las perlas a 6.800 × g durante 10 segundos a cuatro grados Celsius.Deseche el sobrenadante y lave las perlas tres veces con tampón de lisis. Utilizando una jeringa de un CC equipada con una aguja de calibre 30, retire completamente el último lavado y agregue 20 microlitros de tampón muestral reductor 2X. Hierva las muestras durante cinco minutos, centrifugue para sedimentar las perlas y corra los lisados celulares totales y las muestras de proteína precipitada en un gel de SDS-PAGE del porcentaje adecuado según el tamaño de la GF que se esté estudiando.Finalmente, realice un inmunotransferencia western para detectar el GFA relevante en un ensayo de GF exitoso. Aquí se muestra la detección de la activación del factor de intercambio GFH uno. La proteína A G 17 A capta algo de GFH uno de los lisados celulares de control, lo que sugiere que GFH uno tiene una actividad basal.La cantidad precipitada, sin embargo, aumentó en las células tratadas con la citocina inflamatoria factor de necrosis tumoral alfa, lo que es consistente con la idea de que TNF alfa activa G FH uno. Es importante destacar que el lisado total de células muestra cantidades similares de gfh uno en la muestra control y en la tratada, lo que sugiere que el tratamiento no alteró los niveles de G FH uno y que la cantidad utilizada en el ensayo fue igual. Al adaptar este procedimiento, es fundamental mantener la proteína GSE RO G 17 A y los CELLIS ocho en hielo.Realice el ensayo GF de forma rápida y constante, y utilice controles positivos adecuados que permitan la invalidación y la resolución de problemas.

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Investigación

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Biología

Este protocolo utiliza un desplegable de ensayo para determinar los niveles de GTPasa RHOC activa dentro de las células.

RHOC GTPasa ensayo de activación

Clathrin endocitosis mediada depende de las proteínas adaptador que coordinar la selección de carga y montaje capa clatrina. A continuación se describen los procedimientos para el estudio del adaptador de clatrina interacción física y imágenes de células vivas enfoques, utilizando como modelo la levadura endocítica Sla1p adaptador de proteínas.

In vivo e in vitro de adaptador de clatrina-Interacción

Este video muestra un ensayo de competencia para estudiar las proteínas asociadas a la GTPasa. Utilizando la proteína GTPasa unida a nucleótidos inmovilizada en perlas magnéticas, se puede estudiar la unión competitiva entre dos proteínas asociadas que interactúan para el mismo sitio de unión en la GTPasa para evaluar las afinidades de unión de las proteínas asociadas.

Ensayo de unión de competición para estudiar socios de proteínas de unión a GTPasa que compiten entre sí

Nos genéticamente-codificar el aminoácido no natural, p-azido-L-fenilalanina en varias posiciones específicas en los GPCR y mostrar la versatilidad del grupo azido en diferentes aplicaciones. Estos incluyen una tecnología fotorreticulación dirigido a identificar los residuos en el bolsillo de unión a ligando de un GPCR, y la modificación bioorthogonal específica de sitio de los GPCR con una etiqueta de epítopo de péptido o de la sonda fluorescente.

Codificados genéticamente-sondas moleculares para Estudiar G receptores acoplados a proteínas

Este protocolo compara las afinidades relativas de los socios de unión para las GTPasas de la familia Rho, incluyendo Rac1. In vivo, las proteínas de unión a Rac1 compiten por una única interfaz de unión, cuya conformación está dictada por un nucleótido unido. El nucleótido es importante y difícil de controlar experimentalmente, debido a la alta tasa de hidrólisis.

La comparación de la afinidad de unión a proteínas GTPasa-utilizando ensayos de competición

G4 Resolvase1 se une a estructuras de G-quadruplex (G4) con la afinidad reportado más apretado para una proteína de unión-G4 y representa la mayoría de la G4-ADN anulación actividad en las células HeLa. Se describe un nuevo protocolo que aprovecha la afinidad y anulación actividad dependiente de ATP de G4-Resolvase1 para purificar específicamente G4R1 recombinante catalíticamente activo.

Un enfoque ADN afinidad G-cuádruplex para la purificación de enzimáticamente activa G4 Resolvase1

En el manuscrito, describimos el uso de un análisis de reportero de fluorescencia basada en levadura a identificar componentes celulares implicados en la trata de personas y matar procesos de los citotóxicos a una subunidad de la ricina toxina de planta (RTA).

Un análisis Simple reportero basado en fluorescencia para identificar los componentes celulares necesarios para la toxina de ricina una cadena (RTA) trata de levadura

El presente estudio describe un método sencillo de detectar niveles endógenos de la fosforilación Rab10 quinasa repetición rica en leucina 2.

Rab10 detección de fosforilación por la actividad de LRRK2 mediante SDS-PAGE con una etiqueta de enlace de fosfato

Aquí se describe un protocolo para investigar la Prenilación y guanosina-5'-trifosfato (GTP)-carga de la GTPasa Rho. Este protocolo consta de dos métodos detallados, es decir, ensayo de fraccionamiento de la membrana y un GTPasa-ligado del inmunosorbente. El protocolo puede ser usado para medir la Prenilación y GTP carga de diferentes otras GTPasas pequeñas.

Detección de la pequeña GTPasa Prenilación y GTP obligatorio usar membrana fraccionamiento y GTPasa-linked Immunosorbent Assay

Este estudio describe métodos experimentales para caracterizar bioquímicamente el GFAP y sus mutaciones causantes de enfermedades, centrándose en el ensamblaje, agregación y modificación postraduccional de filamentos. Se analizaron proteínas GFAP de alta pureza, lo que reveló conocimientos sobre los mecanismos de la enfermedad de Alexander que podrían proporcionar un marco para estudiar posibles objetivos terapéuticos y comprender las mutaciones y trastornos relacionados con GFAP.

Enfoques experimentales para el análisis bioquímico de la proteína ácida fibrilar glial y sus variantes asociadas a enfermedades

Aprende a rastrear la activación de GEFs específicos de RhoA en células cultivadas mediante precipitación con proteína GST-RhoA mutante. Este método permite detectar y cuantificar factores de intercambio activados mediante Western blot.

Afinidad La precipitación de los activos Rho GEFs El uso de un GST-etiquetados mutante de la proteína Rho (GST-RhoA (G17A)) a partir de lisados ​​de células epiteliales (Video) | JoVE Journal

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