Afinidad La precipitación de los activos Rho GEFs El uso de un GST-etiquetados mutante de la proteína Rho (GST-RhoA (G17A)) a partir de lisados de células epiteliales
31 de marzo de 2012
El método aquí presentado describe un ensayo para seguir la activación de RhoA específicos PIB / GTP Factores de cambio (GEFS) en células cultivadas, haciendo uso de una proteína de fusión GST RhoA mutante que tiene una alta afinidad por GEFs activados. GEFs se precipitan a partir de lisados celulares, detectados por Western Blot y cuantificados por densitometría.
El objetivo general de este procedimiento es seguir la activación de RO, un factor específico de intercambio de G-D-P por G-T-P o GAF, en células en cultivo, haciendo uso de una proteína de fusión mutante RO-GST que tiene alta afinidad por las proteínas G activadas. Esto se logra primero produciendo la proteína mutante RO marcada con GST en bacterias. A continuación, se purifica la proteína RO-GST inmovilizada en perlas.
Luego, se evalúa la pureza y concentración de la proteína GST RO A mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. Finalmente, se preparan lisados celulares y se realiza un ensayo de precipitación de GEF con la proteína GST RO A. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran un aumento en la precipitación de GS activada en células tratadas mediante análisis por inmunotransferencia de las proteínas precipitadas con un anticuerpo específico anti GF y cuantificación por citometría de densidad.
Este método puede ayudar a responder una serie de preguntas interesantes en el campo de los GTPS brutos, como por ejemplo cómo se regulan de manera específica para la señal las numerosas proteínas de intercambio de G-D-P por G-T-P, y cómo se coordina su actividad. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades inicialmente porque la proteína GST RO G 17 A es relativamente inestable y puede degradarse durante la preparación. También es importante recordar realizar el ensayo de precipitación de GF de forma rápida y consistente. Esta técnica será demostrada por Pfizer Vahid, un estudiante de maestría de mi laboratorio, para transformar e coli.
Coloque rápidamente un cuarto de células competentes DH5α en un baño de hielo y agregue un microlitro de ADN PX row A G 17 A a una concentración de 25 a 50 nanogramos por microlitro. Agite suavemente el tubo para mezclar e incube en hielo durante 30 minutos. Someta las células a un choque térmico a 42 grados Celsius durante 45 segundos y luego regrese el tubo a hielo durante dos minutos.
Añada 900 microlitros de medio de calcetín y cultive durante una hora a 37 grados Celsius con agitación. Utilizando una pipeta estéril para pasta doblada, distribuya de 50 a 100 microlitros de las bacterias transformadas sobre una placa de agar LB y persina preparada previamente. Incube la placa en posición normal en un incubador a 37 grados Celsius durante cinco minutos y luego inviértala y cultive durante la noche.
Seleccione una colonia bien aislada de bacterias transformadas y úsela para inocular 50 mililitros de LB con ampicilina. Incube durante la noche a 37 grados SIU con agitación. Cuando el cultivo haya alcanzado la densidad máxima, dilúyalo con 450 mililitros de LB con ampicilina y continúe el crecimiento durante 30 minutos adicionales. A 37 grados Celsius, induzca la producción de la proteína fila añadiendo 500 microlitros de IPTG 100 milimolar a un cultivo de 500 mililitros.
Reduzca la temperatura a entre 22 y 24 grados Celsius y cultive durante aproximadamente 16 horas. Centrifugue el cultivo a 3.600 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Congele los pellet durante al menos una hora o, preferiblemente, durante la noche a menos 80 grados Celsius.
Después de preparar 200 mililitros de tampón de lisis según se indica en el protocolo escrito, prepare el tampón de lisis plus suplementando 10 mililitros con DTT de un milimolar, PMSF de un milimolar y una tableta de inhibidor de proteasas, trabajando sobre hielo. Añada 10 mililitros de tampón de lisis plus a los pellet de Thor y mezcle bien mediante pipeteo y vortexado. Sone la suspensión sobre hielo durante un minuto en el nivel cuatro con pulso al 50 %.
Centrifugar el lisado sonicado a 15.000-20.000 ×g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius y transferir el sobrenadante clarificado a un tubo estéril de 15 mililitros con tapa. Preparar las perlas de glutatión esféricas mezclando suavemente la suspensión al 75 % y utilizando una punta de gran apertura para transferir 335 microlitros a un tubo de 15 mililitros. Añadir 10 mililitros de PBS frío y centrifugar a 500 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.
Deseche el agente sobrenadante. Añada un mililitro de tampón de lisis más a las perlas y centrifugue nuevamente. Deseche el sobrenadante otra vez y añada tampón de lisis.
Además, para preparar una suspensión al 50 %, mezcle dos porciones de 50 microlitros de suspensión de perlas equilibrada con el sobrenadante preparado. Incube en rotación a cuatro grados Celsius durante 45 minutos. Prepare HBS más suplementando 100 mililitros de tampón HBS con cloruro de magnesio 5 milimolar y DTT 1 milimolar. Centrifugue el sobrenadante y las perlas a 500 × g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.
Deseche el sobrenadante y lave las perlas dos veces con 10 mililitros de tampón de lisis más y dos veces con 10 mililitros de HBS más. Después del último lavado, prepare una suspensión al 50 % resuspendiendo las perlas en HBS más suplementado con inhibidor de proteasas. Diluya 10 microlitros de la preparación final de perlas con buffer muestral lam ly dos veces que contenga beamr cap dos etanol.
Luego prepare tres muestras patrón de BSA mezclando 10 microlitros, 5 microlitros y luego 2,5 microlitros de una solución stock de BSA de dos miligramos por mililitro con 10 microlitros de tampón lammy.
Hervir las muestras durante cinco minutos, luego centrifugar brevemente y correr todas junto con un marcador de peso molecular en un gel de poliacrilamida SDS al 10 %. Después de teñir y desentintar el gel, estimar la GST row A G 17 A utilizando los patrones de albúmina sérica bovina (BSA) como referencia. Aliquotar un volumen igual de perlas que contenga alrededor de 10 a 15 microgramos de proteína en tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros. Para preparar el ensayo de precipitación con GF, cultivar las células que se van a usar hasta confluencia en placas de 10 centímetros y privarlas de suero durante al menos tres horas antes del ensayo.
Inmediatamente antes del inicio del ensayo, prepare el tampón de lisis con inhibidores de proteasas sobre hielo. Retire el medio de cultivo de las placas y lave con HBS frío.
Retire todo el HBS y agregue 700 microlitros de tampón de lisis más a cada placa. Incube las placas para que el tampón cubra todas las áreas.
Luego raspe y recolecte los lisados en tubos numerados de 1,5 mililitros. Centrifugue a 15.000 ×g durante un minuto a cuatro grados Celsius. Guarde el sobrenadante para el ensayo; si el número de células fue equivalente en cada placa, retire 30 microlitros de cada sobrenadante y mezcle con 30 microlitros de tampón muestral reductor al doble.
Luego hierva y coloque en hielo. Añada los sobrenadantes restantes a alícuotas de perlas de GST roa G 17 A y rote durante 45 minutos a cuatro grados Celsius. Centrifugue las perlas a 6.800 × g durante 10 segundos a cuatro grados Celsius.
Deseche el sobrenadante y lave las perlas tres veces con tampón de lisis. Utilizando una jeringa de un CC equipada con una aguja de calibre 30, retire completamente el último lavado y agregue 20 microlitros de tampón muestral reductor 2X. Hierva las muestras durante cinco minutos, centrifugue para sedimentar las perlas y corra los lisados celulares totales y las muestras de proteína precipitada en un gel de SDS-PAGE del porcentaje adecuado según el tamaño de la GF que se esté estudiando.
Finalmente, realice un inmunotransferencia western para detectar el GFA relevante en un ensayo de GF exitoso. Aquí se muestra la detección de la activación del factor de intercambio GFH uno. La proteína A G 17 A capta algo de GFH uno de los lisados celulares de control, lo que sugiere que GFH uno tiene una actividad basal.
La cantidad precipitada, sin embargo, aumentó en las células tratadas con la citocina inflamatoria factor de necrosis tumoral alfa, lo que es consistente con la idea de que TNF alfa activa G FH uno. Es importante destacar que el lisado total de células muestra cantidades similares de gfh uno en la muestra control y en la tratada, lo que sugiere que el tratamiento no alteró los niveles de G FH uno y que la cantidad utilizada en el ensayo fue igual. Al adaptar este procedimiento, es fundamental mantener la proteína GSE RO G 17 A y los CELLIS ocho en hielo.
Realice el ensayo GF de forma rápida y constante, y utilice controles positivos adecuados que permitan la invalidación y la resolución de problemas.
Resumen
Este artículo presenta un método para rastrear la activación de factores de intercambio específicos de GDP/GTP de RhoA (GEFs) en células cultivadas, utilizando una proteína de fusión GST con una mutante de RhoA. El ensayo consiste en la precipitación de GEFs a partir de lisados celulares, seguida de la detección mediante inmunotransferencia (Western blot) y cuantificación mediante densitometría.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Celular
- Transducción de Señales
- Bioquímica de Proteínas
Antecedentes
- RhoA es una pequeña GTPasa implicada en diversos procesos celulares.
- Los GEF desempeñan un papel crucial en la activación de RhoA al facilitar el intercambio de GDP por GTP.
- Comprender la regulación de los GEF es importante para elucidar las vías de señalización.
- Los métodos anteriores para estudiar la actividad de los GEF presentan limitaciones en especificidad y sensibilidad.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un ensayo confiable para monitorear la activación de GEF en células vivas.
- Investigar los mecanismos reguladores de los GEF de RhoA.
- Proporcionar un marco para estudios futuros sobre las vías de señalización de RhoA.
Métodos Utilizados
- Producción de una proteína RhoA mutante con etiqueta GST en bacterias.
- Purificación y evaluación de la proteína GST-RhoA mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS.
- Preparación de lisados celulares para ensayos de precipitación de GEF.
- Análisis por transferencia de Western para detección y cuantificación de proteínas precipitadas.
Resultados Principales
- Se observó un aumento en la precipitación de GEFs activadas en las células tratadas.
- El inmunoblot tipo Western confirmó la especificidad del ensayo.
- La densitometría proporcionó datos cuantitativos sobre los niveles de activación de GEF.
- El método demostró un potencial para responder preguntas clave en la señalización de RhoA.
Conclusiones
- El ensayo desarrollado es una herramienta valiosa para estudiar la activación de GEF.
- Los conocimientos obtenidos pueden mejorar la comprensión de la regulación de la señalización de RhoA.
- Este método puede facilitar investigaciones adicionales sobre procesos celulares relacionados con GEF.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación de Rho-GEFs activos en lisados de células epiteliales aborda un desafío crítico al desentrañar la regulación específica de señales dentro de redes complejas de GTPasas. Este ensayo de precipitación por afinidad permite la medición directa de los estados de activación de GEFs, lo que respalda la confianza predictiva en la interrogación de vías y la validación de dianas. La capacidad del método para distinguir la activación de GEFs dependiente de estímulos informa las decisiones iniciales de descubrimiento y selección de carteras.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de la activación de Rho-GEF en respuesta a estímulos celulares definidos.
- Apoya la desactivación de riesgos mecanicistas al aclarar la regulación específica de la vía de GEF.
- Facilita la validación funcional del blanco mediante la detección cuantitativa de los grupos activos de GEF.
- Proporciona datos para priorizar blancos según su respuesta al estímulo y la participación en la vía.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Establece un ensayo de precipitación por afinidad validado para cuantificar GEFs activos en lisados celulares.
- Proporciona resultados cuantitativos reproducibles, adecuados para análisis comparativos entre diferentes condiciones.
- Permite la estandarización de las condiciones del ensayo para aplicaciones posteriores en ensayos de cribado.
- Facilita la evaluación confiable de los efectos de compuestos o estímulos sobre la activación de GEFs.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con la señalización relevante para la enfermedad al medir la activación de GEF en respuesta a estímulos fisiopatológicos.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de la modulación de la vía.
- Informa el avance ajustado al riesgo mediante la vinculación de la activación molecular con resultados funcionales.
- Apoya el desarrollo de biomarcadores al permitir la detección de firmas de activación específica de GEF según el estímulo.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Este ensayo de precipitación por afinidad se integra en el continuo de descubrimiento a preclínico al permitir pruebas basadas en hipótesis de la activación de GEF, apoyando tanto la validación de dianas como estudios mecanicistas.
- Biología del Descubrimiento: Cuantifica GEF activas para aclarar la participación de vías y la reducción de riesgos biológicos.
- Selección: Proporciona una plataforma de ensayo reproducible para evaluar moduladores de la actividad de GEF.
- Análisis: Ofrece resultados cuantitativos de inmunotransferencia (Western blot) y densitometría para la comparación de condiciones.
- Investigación Traducional: Relaciona eventos de señalización celular con estímulos relevantes para enfermedades y posibles biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un marco de ensayo reutilizable adaptable a diversos tipos celulares y estímulos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas y la asignación de rutas metabólicas.
- Valor operativo: Estandariza la medición de la activación de GEF para garantizar la reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar un proyecto al proporcionar evidencia mecanicista del compromiso con la diana.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo basada en datos cuantitativos de activación de rutas metabólicas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en purificación de proteínas, lisis celular y técnicas de inmunodetección.
- Exige acceso a infraestructura para electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE), transferencia Western y densitometría.
- Necesita una estandarización rigurosa del tiempo y la temperatura del ensayo para preservar la actividad de los factores de intercambio de guanina (GEF).
- Es adaptable a diversas líneas celulares y estímulos, siempre que se incluyan controles y validaciones adecuados.
- La inestabilidad proteica y la velocidad del ensayo son limitaciones prácticas que requieren una optimización cuidadosa.
