Microfluídica endotelizado para estudiar las interacciones microvasculares en Enfermedades Hematológicas

El objetivo general de este procedimiento es crear un dispositivo microfluídico recubierto con células endoteliales. Esto se logra primero fabricando el molde microfluídico. El segundo paso consiste en crear el canal de PDMS.

A continuación, se siembran las células endoteliales en el dispositivo. El paso final consiste en cultivar las células dentro del dispositivo. En última instancia, se utilizan dispositivos microfluídicos recubiertos con células endoteliales para mostrar interacciones entre células in vitro.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que proporciona al investigador un control estricto sobre las condiciones biológicas y biofísicas y es compatible con la microscopía de fluorescencia. Aunque este método puede ofrecer información sobre las interacciones biofísicas entre células en enfermedades hematológicas, también puede aplicarse a fenómenos como la biología de los leucocitos, la metástasis del cáncer y la biología de las células madre hematopoyéticas. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque las condiciones deben controlarse rigurosamente para lograr un asentamiento celular exitoso.

Como preparación para la fabricación, se crea una máscara fotográfica enviando una imagen de diseño asistido por computadora del dispositivo microfluídico a un proveedor externo de máscaras. Una vez recibida, la máscara está compuesta por una capa de cromo sobre vidrio de silicato sódico. Aquí, el ancho del canal microfluídico es de 30 micrones.

Para comenzar la fabricación del dispositivo microfluídico, limpie una oblea de silicio virgen con piraña durante 15 minutos y luego enjuáguela con agua desionizada durante 10 segundos. A continuación, sumerja la oblea de silicio en ácido fluorhídrico durante 30 segundos y enjuáguela con agua desionizada durante aproximadamente 10 segundos. Luego, utilizando un centrifugador, aplique por centrifugación el fotoresistente SU 8 20 25 micro chem sobre la oblea hasta alcanzar una altura de 30 micrones, usando una velocidad de centrifugado de 3000 rotaciones por minuto.

Coloque la oblea recubierta con SU 8 20 25 sobre una placa calefactora ajustada a 95 grados Celsius durante cinco minutos para eliminar el exceso de disolvente. No se recomienda utilizar un horno en este paso. A continuación, coloque la máscara fotográfica sobre la oblea y expóngala a luz UV en un alineador de máscaras para entrecruzar y reticular la resistencia fotográfica SU 8 20 25.

Después de la reticulación, coloque nuevamente la oblea sobre la placa calefactora a 95 grados Celsius durante cinco minutos adicionales, para acelerar aún más la polimerización del fotoresistente SU 8 20 25. A continuación, sumerja la oblea en el revelador SU eight, compuesto principalmente de P-G-M-E-A, durante cuatro minutos.

Esto eliminará el SU 8 20 25 fotoresistente no entrecruzado. Enjuague la oblea recién desarrollada con alcohol isopropílico al 100 % durante 10 segundos, luego séquela utilizando nitrógeno presurizado o permitiendo que el disolvente evapore de la oblea en una campana extractora limpia durante varios minutos. A continuación, fije la oblea seca en el centro de la placa de Petri, teniendo cuidado de colocar la cinta en los bordes de la oblea.

Finalmente, pipetee 500 microlitros de sigma coat sobre el oblea. Cubra la placa de Petri con la tapa y luego agite suavemente para asegurar un recubrimiento completo del oblea. Retire la tapa y deje secar el oblea durante varios minutos hasta que todo el disolvente haya evaporado.

Después de mezclar el polímero de PDMS y el agente de curado en una proporción de 10 a 1 en peso, elimine las burbujas de aire utilizando un desecador al vacío durante varios minutos hasta una hora, dependiendo de la intensidad del sistema de vacío disponible. Una vez eliminadas todas las burbujas de aire, vierta la mezcla en el recipiente hasta cubrir el oblea y la superficie del recipiente. Para obtener una lámina de PDMS de aproximadamente cinco milímetros de espesor.

También cree un trozo delgado e incoloro de PDMS de un milímetro de espesor. Luego, cure la mezcla en un horno a 60 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, use un cuchillo o un escalpelo para cortar alrededor de la oblea y retirar varios dispositivos microfluídicos de PDMS.

Luego, corte la lámina para aislar los dispositivos individuales. Corte la lámina de PDMS ligeramente más grande que el dispositivo microfluídico. Ahora utilice una broca de mano Harris Unicorn o un dispositivo similar para crear los orificios de entrada y salida en el dispositivo microfluídico.

A continuación, limpie las superficies del dispositivo microfluídico y la lámina utilizando cinta adhesiva. Luego, use un limpiador de plasma para exponer las superficies del dispositivo microfluídico y de la lámina de PDMS al plasma de oxígeno durante 30 segundos. El plasma de oxígeno genera especies reactivas en la superficie expuesta del PDMS, las cuales se unen al ponerse en contacto físico.

A continuación, llene una jeringa de un mililitro equipada con una aguja roma de calibre 20 con 50 microgramos por mililitro. Fibronectina de plasma humano en PBS, luego coloque un tramo de tubo sobre la aguja. Introduzca un trozo de tubo más delgado dentro del primer tramo de tubo para crear un ajuste por fricción entre las dos piezas de tubo.

Luego, conecte el otro extremo del trozo más delgado de tubo a la entrada del dispositivo microfluídico. Aplique presión a la jeringa para llenar completamente los canales con la solución de fibronectina y para crear una pequeña gota de 100 microlitros en el puerto de salida, asegurando así que los canales permanezcan húmedos. Ahora, incube el dispositivo microfluídico en un incubador humedecido a 37 grados Celsius durante 40 a 60 minutos.

Tras la incubación, conecte una jeringa nueva llena de PBS a la aguja de punta roma. Aplique presión para lavar el dispositivo microfluídico con PBS. Prepare de 500.000 a 2 millones de células por mililitro de células endoteliales de vena umbilical humana, o hve, en medio de crecimiento endotelial con 8% de dextrano.

La adición de dextrano aumenta la probabilidad de que las células se adhieran y se cultiven con éxito dentro del dispositivo microfluídico. Llene una jeringa limpia con una aguja de punta roma y un tubo más ancho con la suspensión celular y conecte un tramo más largo de tubo de aproximadamente un metro de longitud. Es fundamental asegurarse de que el tubo encaje firmemente para eliminar cualquier fuga entre las conexiones.

Precargue el tubo con la solución celular, asegurándose de que no haya burbujas presentes ni en la jeringa ni en ninguna parte del tubo para optimizar el rendimiento del sistema. En este punto, es fundamental evitar que entren fugas ni burbujas al sistema. Cualquier fuga de la solución o presencia de burbujas en el medio impedirá el correcto asentamiento de las células endoteliales.

Una vez eliminadas todas las burbujas y que todo el tramo del tubo esté cebado con la suspensión celular, coloque la jeringa en la bomba y conecte el otro extremo a la entrada microfluídica. La bomba de jeringa se coloca a la misma altura que el dispositivo microfluídico. El tramo largo del tubo se enrolla cuidadosamente dentro del incubador para asegurar que las células y el medio se calienten adecuadamente antes de entrar en contacto con el dispositivo.

A continuación, la suspensión celular se infunde en el dispositivo microfluídico a un caudal volumétrico de 1,23 microlitros por minuto durante dos horas a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono en nuestro sistema. El caudal volumétrico de 1,23 microlitros por minuto corresponde a una velocidad en la corriente media de un milímetro por segundo en los canales más pequeños. Esto aproxima un esfuerzo cortante en la pared de un dina por centímetro cuadrado en esos canales utilizando sangre completa.

Una vez completada la infusión de la suspensión celular, utilice la misma bomba de jeringa y el mismo tubo largo con una jeringa más grande para infundir medio de crecimiento fresco durante dos a ocho días a una velocidad de 1,23 microlitros por minuto. Cuando la monocapa celular alcance el nivel deseado de confluencia, inyecte sangre o suspensión celular en el sistema para realizar el experimento. Aquí se muestra el dispositivo microfluídico antes de la endotelialización.

El dispositivo microfluídico ha sido infundido con colorante alimentario para ilustrar el tamaño, la escala y el diseño general del dispositivo que imita la fisiología del sistema vascular. La microscopía de campo claro revela la endotelialización de un dispositivo microfluídico. Esta imagen se adquirió menos de 48 horas después del siembra utilizando el protocolo descrito; la técnica de perfusión optimizada permite que las células endoteliales cultiven de manera confluente toda la superficie interna del sistema microfluídico.

Entre 24 y 48 horas después de la siembra celular. Como se muestra en esta imagen confocal, el tumor microvascular en un chip con microcanales se asemeja al tamaño de 30 micrones de las vénulas poscapilares, sitio de la mayoría de los eventos obstructivos microvasculares en la anemia de células falciformes. En este experimento, sangre completa de pacientes sanos se infunde en una microvasculatura en un dispositivo de chip bajo condiciones desoxigenadas.

Este vídeo muestra que el flujo de sangre completa en nuestro sistema microfluídico endotelial es regular, suave y continuo, sin áreas de obstrucción en los microcanales. Aquí, sangre completa de pacientes con enfermedad de células falciformes se infunde en una microvasculatura sobre un dispositivo en chip. En condiciones desoxigenadas, se observan cambios significativos en el flujo sanguíneo, con oclusiones completas presentes en varios canales.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar no introducir burbujas de aire al cambiar los tubos. El dispositivo terminado es compatible con microscopía de fluorescencia y puede adaptarse a ensayos de fluorescencia tradicionales. Esta técnica allana el camino para que los hemat&ólogos experimentales realicen experimentos utilizando células individuales en un entorno biof&ísico y hemodinámico controlado.

Sin burbujas.