Microfluídica endotelizado para estudiar las interacciones microvasculares en Enfermedades Hematológicas
June 22nd, 2012
Un método para la cultura de una monocapa de células endoteliales en toda la superficie interior en 3D de un dispositivo de microfluidos con microvascular del tamaño de los canales (<30 micras) se describe. Este In vitro Modelo de microvasculatura permite el estudio de las interacciones biofísicas entre las células sanguíneas, células endoteliales, y factores solubles en enfermedades hematológicas.
El objetivo general de este procedimiento es crear un dispositivo microfluídico recubierto con células endoteliales. Esto se logra fabricando primero el molde microfluídico. El segundo paso es crear el canal PDMS.
A continuación, las células endoteliales se siembran en el dispositivo. El paso final es cultivar las células dentro del dispositivo. En última instancia, los dispositivos microfluídicos recubiertos de células endoteliales se utilizan para mostrar las interacciones de célula a célula in vitro.
La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que proporciona al investigador un control estricto sobre las condiciones biológicas y biofísicas y es compatible con la microscopía de fluorescencia. Aunque este método puede proporcionar información sobre las interacciones biofísicas de las células en las enfermedades hematológicas, también se puede aplicar a fenómenos como la biología de los leucocitos, la metástasis del cáncer y la biología de las células madre hematopoyéticas. Por lo general, los individuos nuevos en este método tendrán dificultades porque las condiciones deben estar estrictamente controladas para que la célula tenga éxito.
En preparación para la fabricación, crea una máscara fotográfica enviando una imagen de diseño asistido por computadora del dispositivo Microfluid a un proveedor de máscaras externo. Una vez recibida, la mascarilla se compone de una capa de cromo sobre vidrio sódico-cálcico. Aquí el ancho del canal microfluídico es de 30 micras.
Para comenzar la fabricación del dispositivo microfluídico, limpie una oblea de silicona desnuda con piraña durante 15 minutos, luego enjuague con agua desionizada durante 10 segundos. Luego sumerja la oblea de silicona en ácido fluorhídrico durante 30 segundos y enjuague con agua desionizada durante aproximadamente 10 segundos. A continuación, utilizando un coter de centrifugado spin micro chem SU 8 20 25 fotorresistencia sobre la oblea a una altura de 30 micras utilizando una velocidad de centrifugado de 3000 rotaciones por minuto.
Coloque la oblea recubierta SU 8 20 25 en una placa caliente colocada a 95 grados centígrados durante cinco minutos para eliminar el exceso de disolvente. No se recomienda un horno para este paso. Ahora, coloque la fotomascarilla sobre la oblea y expóngala a la luz ultravioleta en un revestimiento de mascarilla para entrecruzar la fotorresistencia SU 8 20 25.
Después de la reticulación, vuelva a colocar la oblea en la placa calefactora a 95 grados centígrados durante cinco minutos más. Para acelerar aún más la polimerización de la fotorresistencia SU 8 20 25. A continuación, sumerja la oblea en el revelador SU eight, que se compone principalmente de P-G-M-E-A durante cuatro minutos.
Esto eliminará la foto SU 8 20 25 no reticulada. Resistir. Enjuague la oblea recién desarrollada con alcohol isopropílico al 100% durante 10 segundos, luego séquela con nitrógeno presurizado o deje que el solvente se evapore de la oblea en una campana de gases limpia durante varios minutos. Ahora, pegue la oblea seca en el centro de la placa de Petri, teniendo cuidado de colocar la cinta en los bordes de la oblea.
Por último, pipetea 500 microlitros de capa sigma sobre la oblea. Cubra la placa de Petri con la tapa y luego gire la placa para asegurar una cobertura completa de la oblea. Retire la tapa y deje que la oblea se seque durante varios minutos hasta que todo el solvente se haya evaporado.
Después de mezclar el polímero PDMS y el agente de curado en una proporción de 10 a un peso por peso, elimine las burbujas de aire con un desecador al vacío durante varios minutos a una hora, dependiendo de la fuerza del sistema de vacío disponible. Una vez que se hayan eliminado todas las burbujas de aire, vierta la mezcla en el plato para que la oblea y la superficie del plato queden cubiertas. Para crear una lámina de PDMS de aproximadamente cinco milímetros de grosor.
Cree también una pieza delgada de PDMS sin rasgos distintivos de un milímetro de grosor. Luego cure la mezcla en un horno a 60 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, use un cuchillo o bisturí para cortar alrededor de la oblea y retire varios dispositivos microfluídicos PDMS.
A continuación, corte la hoja para aislar los dispositivos individuales. Corte la hoja de PDMS un poco más grande que el dispositivo microfluídico. Ahora use un tornillo de banco, un unicornio Harris o un dispositivo similar para crear orificios de entrada y salida en el dispositivo microfluídico.
A continuación, limpie las superficies del dispositivo microfluídico y la lámina con cinta adhesiva. A continuación, utilice un limpiador de plasma para exponer las superficies del dispositivo microfluídico y la lámina de PDMS al plasma de oxígeno durante 30 segundos. El plasma de oxígeno crea especies reactivas en la superficie expuesta del PDMS, que se unen cuando entran en contacto físico.
A continuación, llene una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de punta roma de calibre 20 con 50 microgramos por mililitro. La fibronectina del plasma humano en PBS luego se ajusta a un trozo de tubo sobre la aguja. Inserte un trozo de tubo más delgado en la primera pieza de tubo para crear un ajuste de fricción entre las dos piezas de tubo.
A continuación, conecte el otro extremo de la pieza más delgada del tubo a la entrada del dispositivo microfluídico. Aplique presión a la jeringa para llenar los canales completamente con la solución de fibronectina y para crear una pequeña gota de 100 microlitros en el puerto de observación para asegurarse de que los canales permanezcan húmedos. Ahora, incube el dispositivo microfluídico en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados durante 40 a 60 minutos.
Después de la incubación, conecte una jeringa nueva llena de PBS a la aguja de punta roma. Aplique presión para enjuagar el dispositivo microfluídico con PBS. Prepare de 500, 000 a 2 millones de células por mililitro de células endoteliales de la vena umbilical humana, o téngalas en medios de crecimiento endotelial con 8% de dextrano.
La adición de dextrano aumenta la probabilidad de que las células se adhieran y crezcan con éxito dentro del dispositivo microfluídico. Jeringa limpia de relleno equipada con una aguja de punta roma y un tubo más ancho con la suspensión de celdas y conecta una longitud más larga de tubo de aproximadamente un metro de longitud. Es fundamental asegurarse de que la tubería esté bien ajustada para eliminar las fugas entre cualquier conexión.
Prepare el tubo con solución celular, asegurándose de que no haya burbujas presentes ni en la jeringa ni en ninguno de los tubos para optimizar el rendimiento del sistema. En este punto, es fundamental evitar que entren fugas o burbujas en el sistema. Cualquier fuga de solución o presencia de burbujas en el medio impedirá el asentamiento exitoso de las células endoteliales.
Una vez que se hayan eliminado todas las burbujas y toda la longitud del tubo esté cebada con suspensión celular, coloque la jeringa en la bomba y conecte el otro extremo a la entrada microfluídica. La bomba de jeringa se coloca a la misma altura que el dispositivo microfluídico. La larga longitud del tubo se enrolla cuidadosamente dentro de la incubadora para garantizar que las células y los medios se calienten adecuadamente antes de entrar en contacto con el dispositivo.
Luego, la suspensión celular se infunde en el dispositivo microfluídico a un caudal volumétrico de 1,23 microlitros por minuto durante dos horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en nuestro sistema. La tasa volumétrica de gripe de 1,23 microlitros por minuto corresponde a una velocidad media de un milímetro por segundo en los canales más pequeños. Esto se aproxima a un esfuerzo cortante de la pared de una moneda de diez centavos por centímetro cuadrado en esos canales utilizando sangre entera.
Una vez completada la infusión de la suspensión celular, use la misma bomba de jeringa y el tubo largo con una jeringa más grande para infundir medios de crecimiento frescos durante dos a ocho días a una velocidad de 1,23 microlitros por minuto. Cuando la monocapa celular esté en el nivel deseado de confluencia, inyecte sangre o suspensión celular en el sistema para experimentar. Aquí, se muestra el dispositivo microfluídico antes de la endotelización.
El dispositivo microfluídico se ha infundido con colorante alimentario para ilustrar el tamaño, la escala y el diseño general del dispositivo que imita la fisiología de la vasculatura. La microscopía de campo claro revela la endotelización de un dispositivo microfluídico. Esta imagen fue adquirida menos de 48 horas después de la siembra utilizando el protocolo descrito, la técnica de perfusión optimizada permite que las células endoteliales conf fluentes cultiven toda la superficie interna del sistema microfluídico.
Dentro de las 24 a 48 horas posteriores a la siembra de la célula. Como se muestra en esta imagen confocal, el tumor microvascular en un chip con microcanales se aproxima al tamaño de 30 micras de los veles postcapilares, el sitio de la mayoría de los eventos obstructivos microvasculares de células falciformes. En este experimento, la sangre entera de pacientes sanos se infunde en una micro vasculatura en un dispositivo de chip en condiciones desoxigenadas.
Esta película muestra que el flujo de sangre completa en nuestro sistema microfluídico endotelial es regular, suave y continuo, sin áreas de obstrucción de microcanales. Aquí, la sangre completa de pacientes con enfermedad de células falciformes se infunde en una microvasculatura en un dispositivo de chip. En condiciones desoxigenadas, se observan cambios significativos en el flujo sanguíneo con oclusiones completas presentes en varios canales.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no debe introducir burbujas de aire al cambiar el tubo. El dispositivo terminado es compatible con la microscopía de fluorescencia y se puede adaptar a los ensayos de fluorescencia tradicionales. Esta técnica allana el camino para que los hematólogos experimentales realicen experimentos con células individuales en un entorno biofísico y hemodinámico controlado.
Sin burbujas.
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Descripción general
Este artículo describe un método para cultivar una monocapa de células endoteliales en un dispositivo microfluídico con canales de tamaño microvascular. Este modelo in vitro facilita el estudio de las interacciones entre células sanguíneas, células endoteliales y factores solubles en enfermedades hematológicas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Microfluidics
- Cultivo celular
- Enfermedades hematológicas
Fundamentos
- Las células endoteliales juegan un papel crucial en la biología vascular.
- Los dispositivos microfluídicos permiten un control preciso del entorno celular.
- El estudio de las interacciones celulares in vitro puede proporcionar información sobre los mecanismos de la enfermedad.
- Este método tiene como objetivo replicar el entorno microvascular.
Propósito del estudio
- Desarrollar un dispositivo microfluídico recubierto con células endoteliales.
- Permitir el estudio de interacciones célula a célula.
- Proporcionar una plataforma para investigar enfermedades hematológicas.
Métodos utilizados
- Fabricación del molde microfluídico.
- Creación de canales de PDMS.
- Sembrado de células endoteliales en el dispositivo.
- Cultivo de las células dentro del dispositivo.
Resultados principales
- Creación exitosa de monocapas de células endoteliales.
- Demostración de interacciones célula a célula in vitro.
- Aplicaciones potenciales en el estudio de afecciones hematológicas.
- Validación del modelo microfluídico para futuras investigaciones.
Conclusiones
- El método proporciona una plataforma confiable para estudios de células endoteliales.
- Mejora la comprensión de las interacciones biofísicas en enfermedades relacionadas con la sangre.
- La investigación futura puede aprovechar este modelo para obtener información terapéutica.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This endothelialized microfluidic platform addresses a critical gap in hematologic disease research by enabling precise control of microvascular hemodynamic and biophysical conditions. It provides a reproducible in vitro system to study pathogenic cell-endothelial interactions under flow, supporting mechanistic de-risking in target validation and assay development. The model enhances predictive confidence for hematologic therapeutic candidates by replicating post-capillary venule-scale pathophysiology relevant to vaso-occlusive crises.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses involving leukocyte adhesion, sickle cell aggregation, and endothelial activation under physiologic shear stress.
- Operational Value: Provides a standardized system to isolate endothelial-specific contributions to microvascular pathology independent of systemic confounders.
- Predictive Value: Supports target de-risking by quantifying inhibitor effects on cell-cell interactions in a disease-relevant hemodynamic context.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, real-time readouts of blood flow obstruction, cell velocity, and adhesion frequency under controlled shear conditions.
- Reproducibility: Uses a single-mask fabrication process and standardized perfusion protocol to ensure inter-device and inter-lab consistency.
- Scalability: Compatible with syringe pump operation and brightfield/fluorescence microscopy, enabling medium-throughput screening of compounds or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models post-capillary venule dimensions (30 μm) where sickle cell vaso-occlusion initiates, enhancing translational fidelity.
- Mechanistic Continuity: Bridges in vitro findings to pathophysiological mechanisms by replicating endothelial shear stress and deoxygenation triggers.
- Preclinical De-risking: Informs go/no-go decisions by predicting compound efficacy in preventing microvascular occlusion before in vivo testing.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis screening to preclinical efficacy testing, particularly for hematologic agents targeting microvascular adhesion or endothelial activation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of endothelial-mediated pathways in sickle cell disease, thrombosis, and inflammatory hematologic conditions.
- Screening: Delivers assay-ready endothelialized channels with quantifiable hemodynamic outputs for compound library evaluation.
- Analytics: Enables measurement of dependent variables such as occlusion frequency, transit time, and fluorescence-based adhesion under defined independent variables like shear stress or agonist concentration.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies by allowing correlation of in vitro adhesion phenotypes with clinical severity in patient-derived samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microfluidic core facility asset adaptable to multiple hematologic indications and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in hematologic target validation by isolating endothelial contributions under flow.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized PDMS fabrication, fibronectin coating, and controlled cell seeding protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early-stage identification of compounds that fail in microvascular-specific assays.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of hematologic candidates based on microvascular efficacy signals.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic fabrication, sterile cell culture, and hemodynamic perfusion techniques.
- Depends on access to plasma cleaners, syringe pumps, and inverted microscopes for real-time imaging.
- Necessitates standardization of cell preparation, dextran supplementation, and tubing priming to prevent bubbles and ensure endothelial monolayer integrity.
- Involves adaptation considerations when extending to non-HUVEC endothelial sources or alternative blood cell types under varying oxygen tensions.
- Limited by the need for meticulous bubble-free fluidic connections, which can impede endothelial cell adhesion if not optimized.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:11
Fabrication of the Endothelial Microdevice
3:46
Polydimethylsiloxane (PDMS) Preparation
6:25
Seeding the Microfluidic Device with Endothelial Cells
8:49
Endothelialized Microfluidics Reveal Abnormal Microvascular Interactions after Infusion with Blood from Patients with Hematologic Disease
10:35
Conclusion
![Desarrollo y caracterización de In Vitro Red de microvasos y mediciones cuantitativas de endotelial [Ca 2+] i Y la producción de óxido nítrico](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F54014.jpg%3Fv%3D2026-07-07T20%253A58%253A27.244Z&w=384&q=75)
