Name: Nano-FEM: Proteína localización usando la foto activada por microscopía de localización y Microscopía Electrónica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Aprende a localizar proteínas en micrografías electrónicas usando nano-FEM con microscopía de fluorescencia correlacionada en nematodos transgénicos. Este método supera las limitaciones de la inmuno-EM tradicional.

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Damos las gracias a Harald Hess y Eric Betzig para acceder al microscopio PALM para experimentos de prueba de principio, Richard Fetter para compartir protocolos de fijación, reactivos y estímulo. Damos las gracias a Michael Davidson, Seydoux Geraldine, Eimer Stefan, Leube Rudolf, Nehrke Keith, Christian Frøkjr-Jensen, Aude Ada Nguema y Hammarlund Marc construcciones de ADN. También agradecemos a Carl Zeiss Inc para proporcionar acceso a la Zeiss PAL-M, una versión beta del microscopio Zeiss ELYRA P.1 PALM.

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</ol>

La producción y el libre acceso a este artículo es patrocinado por Carl Zeiss, Inc.

Aquí se describe cómo preservar las proteínas fluorescentes en plástico, localizar las proteínas fluorescentes en secciones, y la imagen de la ultraestructura con microscopía electrónica. Las proteínas se localizan por debajo del límite de difracción mediante microscopía PALM la resolución nanométrica. Para adaptar este protocolo a particular, los modelos, los parámetros siguientes deben ser considerados: fluoróforo, la cuantificación, y la alineación. La elección de la proteína fluorescente o fluoróforo orgánico depende de la aplicación y del sistema modelo. Hemos probado una variedad de proteínas fluorescentes, entre ellos EGFP, YFP, Citrino, mEosFP, mEos2, tdEos, Morange, PA mCherry, y Dendra 12. La preservación de la fluorescencia de cada fluoróforo fue similar, lo que sugiere que todas las proteínas fluorescentes se pueden conservar usando el método descrito. Elegimos tdEos porque expresaba bien en C. elegans, las proteínas siguen funcionando cuando se fusionó con tdEos, y debido a suactivación foto-características fueron óptimas para la microscopía de PALM. Sin embargo, la expresión de agregación o no de tdEos se ha observado en ocasiones 12. Dependiendo de la aplicación, un fluoróforo diferente puede ser más adecuado. En muchos casos, no es necesario el uso de una proteína fluorescente foto-activado. Microscopía de fluorescencia simple correlativo de electrones no requiere foto-activated proteína fluorescente. GFP o colorantes orgánicos se pueden utilizar para fluorescencia imagen de proteínas etiquetadas en secciones por encima del límite de difracción. Por ejemplo, uno puede imaginar un axón en un neuropil mediante microscopía de fluorescencia y correlacionar la señal de fluorescencia con un axón particular en una micrografía electrónica de imágenes de la fluorescencia en un microscopio de fluorescencia. Otras técnicas de super-resolución, como la microscopía de emisión estimulada agotamiento (STED) 12, estado fundamental microscopía agotamiento seguido por el retorno molécula individual (GSDIM) 13, ymicroscopía de iluminación estructurada (SIM) 14, no requieren foto proteínas activadas fluorescentes. Además, super-resolución de las técnicas de imagen que utilizan tintes orgánicos 9,15,16 o la propiedad intrínseca de sondas fluorescentes 17 son fácilmente aplicables. En PALM, el número de moléculas puede cuantificarse porque la fluorescencia de cada molécula se separa espacialmente y temporalmente. Sin embargo, la cuantificación puede ser engañosa por cuatro razones: la oxidación, la subestimación, overcounting y sobreexpresión. En primer lugar, una fracción de las proteínas fluorescentes se pueden desnaturalizar o se oxida durante el procesamiento de la muestra 5,12. Aunque ~ 90% de la señal de fluorescencia fue preservada a través de fijación e inclusión en el protocolo, la oxidación de la proteína fluorescente puede ocurrir después de la muestra ha sido seccionado y la superficie expuesta al oxígeno. En segundo lugar, la activación del foto-activables proteínas es estocástico, y por lo tanto pueden ser múltiples moléculasactivado en un determinado punto de difracción limitada 8. La fluorescencia de las moléculas de múltiples aparecerá como un punto, y por lo tanto el número total de proteínas se subcontados ser. En tercer lugar, un problema similar puede conducir a overcounting. En PALM, cada proteína fluorescente es localizado y luego &quot;borrados&quot; por blanqueo. Sin embargo, las proteínas fluorescentes pueden volver desde el estado oscuro sin ser permanentemente decolorado 18. Dichas moléculas entonces se cuenta múltiples veces. En cuarto lugar, las proteínas etiquetadas se expresan como transgenes y están a menudo presentes en múltiples copias, que pueden conducir a la sobreexpresión. Por lo tanto, la cuantificación de la palma se pueden utilizar para estimar, pero no determinar con precisión el número de moléculas en un lugar determinado. La alineación de una imagen de la palma con una micrografía electrónica también puede ser un reto, debido a la diferencia de resolución en la microscopía de luz y electrónica y la distorsión causada por el haz de electrones. Las partículas de oro servir como fuertemente loctrializados marcadores de referencia en micrografías electrónicas. Sin embargo, fluoresecence de partículas de oro no es foto-activado, y aparece como una gran mancha de difracción limitada. Por lo tanto, la colocación de una imagen de fluorescencia sobre una micrografía electrónica es una estimación. Distorsiones pueden deberse también a las interacciones de los electrones con la sección de plástico. Resinas acrílicas tales como GMA son menos estables bajo el haz de electrones, y las dimensiones del plástico puede ser alterado. Bajo estas circunstancias, la alineación de la fluorescencia con ultraestructura puede requerir de transformación no lineal de los marcadores de referencia.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo o equipo </td><td> Empresa </td><td> El número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> De alta presión congelador </td><td> ABRA </td><td> HPM 010 </td><td> EMPACT y HPM 100 de Leica o HPF 01-de Wohlwend también se puede utilizar. </td></tr><tr><td> Congelación automatizado unidad sustitución </td><td> Leica </td><td> AFS 2 </td><td> AFS 1 también se puede utilizar. </td></tr><tr><td> Zeiss PALM </td><td> Zeiss </td><td> ELYRA P.1 </td><td> Nikon y Vutara también venden microscopios comerciales de palma. </td></tr><tr><td> Microscopio electrónico de barrido </td><td> FEI </td><td> Nova nano </td><td> Otros de alta resolución de los microscopios SEM se puede utilizar. </td></tr><tr><td> Acetona </td><td> EMS </td><td> RT10016 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 459844-1L </td><td></td></tr><tr><td> Osmio tetroxide </td><td> EMS </td><td> RT19134 </td><td></td></tr><tr><td> El permanganato de potasio </td><td> EMS </td><td> RT20200 </td><td></td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-50G </td><td></td></tr><tr><td> Acetato de uranilo </td><td> Polysciences </td><td> 21447-25 </td><td> pH de acetato de uranilo de esta empresa es ligeramente superior. </td></tr><tr><td> El glicol metacrilato (GMA) </td><td> SPI </td><td> 02630-AA </td><td> Ácido bajo, grado TEM. </td></tr><tr><td> N, N-dimetil-p-toluidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9912 </td><td></td></tr><tr><td> Cryo viales </td><td> Nalgene </td><td> 5000-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Vidrio viales </td><td> EMS </td><td> 72632 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar película </td><td> EMS </td><td> 50425-10 </td><td></td></tr><tr><td> BEEM cápsula </td><td> EBSciences </td><td> TC </td><td> Polipropileno </td></tr><tr><td> 3/8 &quot;DISCO golpes </td><td> Ted Pella </td><td> 54741 </td><td></td></tr><tr><td> Las nanopartículas de oro </td><td> microesferas-nanospheres.com </td><td> 790122-010 </td><td> Solicitar solución concentrada 2x </td></tr></tbody></table>

nano-fem: proteína localización usando la foto activada por microscopía de localización y microscopía electrónica

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Mapeo de la distribución de las proteínas es esencial para la comprensión de la función de las proteínas en una célula. Microscopía de fluorescencia se utiliza ampliamente para la localización de proteínas, pero contexto subcelular es a menudo ausente en las imágenes de fluorescencia. Immuno-microscopía electrónica, por otro lado, puede localizar proteínas, pero la técnica está limitada por la falta de anticuerpos compatibles, pobre preservación de la morfología y porque la mayoría de los antígenos no están expuestos a la superficie de la muestra. Enfoques correlativos puede adquirir la imagen de fluorescencia de una célula entera primero, ya sea de inmuno-fluorescencia o proteínas genéticamente marcadas. La muestra es luego fijado e incluido para microscopía electrónica, y las imágenes se correlaciona 1-3. Sin embargo, la imagen de fluorescencia de baja resolución y la falta de marcadores de referencia excluye la localización precisa de las proteínas. Alternativamente, imágenes de fluorescencia se puede hacer después de la preservación de la muestra en plástico. Eneste enfoque, el bloque es seccionado, y las imágenes de fluorescencia y las micrografías de electrones de la misma sección se correlacionan 4-7. Sin embargo, el límite de difracción de la luz en la imagen correlacionada oscurece las ubicaciones de las moléculas individuales, y la fluorescencia a menudo se extiende más allá del límite de la célula. Nano-resolución fluorescencia microscopía electrónica (nano-FEM) está diseñado para localizar proteínas en nano-escala por las mismas secciones de imágenes usando Photo activado por microscopía de localización (PALM) y microscopía electrónica. PALM supera el límite de difracción por formación de imágenes fluorescentes de proteínas individuales y, posteriormente, el mapeo de la centroide de cada 8-10 mancha fluorescente. Planteamos la técnica de nano-FEM en cinco pasos. En primer lugar, la muestra se fija y encajada, usando condiciones que preservan la fluorescencia de las proteínas etiquetadas. En segundo lugar, los bloques de resina son seccionaron en segmentos ultrafinas (70-80 nm) que están montadosen una cubierta de vidrio. En tercer lugar, se crea una imagen de fluorescencia en estas secciones usando un microscopio Zeiss PALM. En cuarto lugar, estructuras densas de electrones se visualizan en estas mismas secciones utilizando un microscopio electrónico de barrido. En quinto lugar, las micrografías de fluorescencia y de electrones se alinean usando partículas de oro como marcadores fiduciales. En resumen, la localización subcelular de las proteínas etiquetadas fluorescentemente se puede determinar en resolución nanométrica en aproximadamente una semana.

Se describe un método para localizar proteínas etiquetadas fluorescentemente en micrografías electrónicas. La fluorescencia se localiza primero mediante foto-activado microscopía de localización en secciones ultrafinas. Estas imágenes se alinean entonces a micrografías electrónicas de la misma sección.

Nano-FEM: Proteína localización usando la foto activada por microscopía de localización y Microscopía Electrónica

El mapeo de la distribución de las proteínas es esencial para comprender la función de estas en una célula. La microscopía de fluorescencia se utiliza ampliamente para...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en localizar proteínas en micrografías electrónicas mediante microscopía de fluorescencia y microscopía electrónica correlacionadas. Este método, conocido como nano FEM, se utiliza para localizar proteínas en C. elegans. Primero, un gusano transgénico que expresa la histona TD eos se incluye en plástico y se secciona.Cada sección se imagina mediante microscopía de localización por activación fotónica o PALM y microscopía electrónica de barrido. Las dos micrografías de cada sección se alinean utilizando marcadores fiduciales con Photoshop. La imagen correlativa muestra la localización de las moléculas de histonas en el núcleo.Entonces, la principal ventaja de la técnica que vamos a describir hoy es que, en lugar de utilizar inmunomicroscopía electrónica, estamos utilizando marcadores fluorescentes codificados genéticamente, de modo que cada proteína esté asociada con una proteína fluorescente. Al trabajar con inmunomicroscopía electrónica, muchos de los anticuerpos no pueden actuar sobre los plásticos. Simplemente no son compatibles, y si lo son, los anticuerpos no logran penetrar profundamente en la sección donde se encuentran los antígenos.Al utilizar proteínas fluorescentes, cada proteína se marca con un fluoróforo. Así que hoy Shige WBI demostrará esta técnica. El siguiente procedimiento se demostrará utilizando nematodos transgénicos que expresan histonas marcadas con la proteína fluorescente TDE os.Para esta demostración, utilizaremos bacterias como agente crioprotector, pero también puede usar BSA al 20 % para congelar *sea elegance*. Una hora antes de la sustitución por congelación, llene el aparato automático de sustitución por congelación o un dispositivo FS con nitrógeno líquido. También con antelación, prepare los fijadores necesarios según las instrucciones del documento adjunto, almacene los fijadores en alícuotas de un mililitro en viales criogénicos y colóquelos en nitrógeno líquido hasta su uso.Utilice un pincel para recoger los animales de un césped bacteriano y transfiéralos para llenar un portamuestras de 100 micrones. Llene ligeramente por encima del borde para asegurar que no queden burbujas de aire. Una vez listo, coloque el portamuestras en la armadura de un congelador de alta presión para congelarlo. Luego, transfiera inmediatamente la muestra a un baño de nitrógeno líquido junto a la cámara de congelación.A continuación, utilizando un embudo y un par de pinzas, transfiera el espécimen a un vial criogénico que contenga fijadores. Asegúrese de que el espécimen permanezca siempre sumergido en nitrógeno líquido. Repita este procedimiento para cada espécimen y luego transfiera todos los viales criogénicos a una unidad FS.Una vez colocados todos los viales criogénicos en la unidad de FS, inicie el programa. En este diagrama se muestra el protocolo de congelación y procesamiento. Durante la incubación inicial a menos 90 grados Celsius, el hielo vítreo se sustituye por el fijador en acetona.Luego, a medida que aumenta la temperatura de la muestra, el fijador en la acetona líquida realiza enlaces cruzados con la muestra para preservar su estructura. Cuando la temperatura en una unidad FS alcance menos 60 grados Celsius, coloque viales de centelleo que contengan 20 mililitros de acetona al 95 % en la unidad FS para enfriarlos. Luego, cuando la temperatura alcance menos 50 grados Celsius, utilice una pipeta Pasteur con una punta P 200 para retirar el fijador y añada aproximadamente un mililitro de acetona al 95 % previamente enfriada a cada muestra. Bilis.Repita este proceso cada 20 minutos durante dos horas. Además, durante la incubación a menos 50 grados Celsius, coloque un vial de centelleo que contenga 20 mililitros de acetato de uranilo al 0,1 % en acetona al 95 % dentro de una cámara FS para preenfriarlo a menos 50 grados Celsius. Luego, tras el último lavado con acetona, agregue aproximadamente un mililitro de solución de acetato de uranilo a cada vial para teñir la muestra y realzar el contraste de la membrana.Si el programa se ha detenido, reinícielo. Cuando la temperatura alcance menos 40 grados Celsius, coloque viales de centelleo que contengan etanol al 95 % en una cámara FS. Cuando la temperatura alcance menos 30 grados Celsius, utilice una pipeta Pasteur para reemplazar el acetato de uranilo con etanol al 95 % cada 20 minutos durante dos horas.Es importante usar etanol en este paso, ya que la resina no se polimerizará en presencia de acetona. En la siguiente parte del protocolo, los especímenes se incluyen en plástico mientras se encuentran a menos 30 grados Celsius. En el FS, sustituya el etanol al 95% por resina de glicol metacrilato o GMA al 30% preenfriada en etanol al 95%; tras tres a cinco horas, sustituya la GMA al 30% por GMA al 70%; tras cuatro a seis horas, retire la GMA al 70% e incube los especímenes en GMA al 97% durante la noche.El aumento escalonado de la concentración de GMA permite la penetración del medio en los tejidos. Tenga en cuenta que, dado que se añade 3% de agua a la resina de GMA, el GMA al 97% no se diluye. Al día siguiente con etanol, transfiera las muestras a un molde de inclusión en el A FS utilizando una pipeta Pasteur; coloque las muestras en el molde de inclusión y luego sustituya el GMA al 97% por GMA recién preparado tres veces durante seis horas a menos 30 grados centígrados.Después del tercer intercambio, golpee suavemente la matriz bacteriana para separar la muestra del crioprotector. Añada el iniciador nn dimetil udina al 97% GMA en un vial ventilado. La cantidad de iniciador añadido es de 1,5 microlitros por cada mililitro de GMA; inmediatamente, añada la solución de GMA a cada molde de inclusión y coloque los animales en el molde de manera que queden equidistantes.Reinicie el programa para que la temperatura aumente a menos 20 grados Celsius. Aunque la resina se polimeriza rápidamente en una hora, deje que el plástico cure durante la noche a menos 20 grados Celsius. Para asegurarse de que se polimerice completamente.Una vez que el plástico haya fraguado, guarde el espécimen en una bolsa al vacío llena con gas nitrógeno a menos 20 grados Celsius. El corte de espécimenes incluidos en GMA debe realizarse entonces según se describe en el documento adjunto para microscopía de localización por activación fotónica o imagenología PALM. El sistema microscópico debe configurarse con la cámara E-M-C-C-D ajustada a menos 70 grados Celsius o inferior.Utilizando una pipeta, aplique aproximadamente 50 microlitros de partículas de oro de 100 nanómetros a una concentración de 1 × 10¹⁰ partículas por mililitro en solución sobre la muestra que se va a imaginar. Coloque una funda negra sobre las muestras y deje que la solución repose durante 30 segundos sobre el portaobjetos. Para eliminar la solución de oro, sople suavemente hacia el borde del portaobjetos y absorba la solución con una toallita absorbente.Luego, aplique grasa para vacío a un portaobjetos circular y coloque el cubreobjetos. Aplique aceite de inmersión en la cara inferior del cubreobjetos. Deslícelo directamente debajo de la muestra.Inserte el portaobjetos en la ranura del portaobjetos del microscopio y ajústelo para que quede bien ajustado y centre las secciones sobre el objetivo. Tenga especial cuidado en no tocar los objetivos. A continuación, utilizando iluminación de campo claro, localice las secciones empleando un objetivo de 10 x.Luego cambie al objetivo de 100 x y enfoque el espécimen. Si es necesario, cambie a la iluminación de fluorescencia utilizando el láser de 488 nanómetros con la intensidad ajustada al 10 %. Espere cinco minutos para que la temperatura de la muestra se equilibre. Luego identifique las regiones con la fluorescencia más intensa y enfoque.Cambie los láseres a 561 nanómetros y aumente la intensidad al 100 %. Para eliminar la autofluorescencia de fondo, blanquee la muestra durante aproximadamente dos minutos. Si el enfoque cambia durante el blanqueo, espere cinco minutos antes de ajustar el enfoque y capturar las imágenes. Cuando el blanqueo haya finalizado, active el láser de 405 nanómetros y ajústelo a la intensidad más baja.Comience a recolectar las imágenes a 20 cuadros por segundo. Recolecte suficientes cuadros para alcanzar el objetivo del experimento aquí. Se toman de 5.000 a 6.000 cuadros para determinar la localización de 584 proteínas histónicas dentro de un núcleo.Una vez que se han recopilado 5.000 cuadros, el software de imagen identifica y localiza todas las moléculas. La imagen final de fluorescencia, o llamada imagen de some turf, es un compuesto de toda la fluorescencia detectada en la cámara. En contraste, la imagen palm localiza el OID de cada punto fluorescente e indica únicamente la ubicación de cada proteína.Antes de la imagenología por MEB, tiña los cortes utilizando acetato de uranilo al 2,5 % en agua durante cuatro minutos. Lave cuidadosamente el acetato de uranilo con agua Milli-Q filtrada. Una vez que los cortes estén secos, utilice un pulverizador catódico para recubrir con carbono la laminilla hasta que se vuelva bastante oscura.Aplique cinta conductora de carbono en el borde del portaobjetos en un extremo y en el soporte metálico en el otro extremo, de modo que los electrones que se acumulan en la superficie del portaobjetos sean conectados a tierra. Monte el portaobjetos en la cámara del MEB y localice la muestra en el microscopio. Tome una imagen de baja magnificación de la muestra, luego acerque la zona de interés y obtenga imágenes de alta magnificación.Repita este proceso con una nueva sección hasta que todas las secciones hayan sido imagenadas. A continuación, las imágenes de palma y de ME deben alinearse. Para ello, primero abra las imágenes de ME adquiridas en Photoshop.Cree una nueva ventana con dimensiones de 5.000 por 5.000 píxeles y una resolución de 300 píxeles por pulgada. Copie la imagen de microscopía electrónica de barrido (MEB) con la ampliación cargada en la nueva ventana. Utilice el comando de transformación libre que se encuentra en el menú de edición para escalar la imagen de modo que llene toda la ventana.Luego copie las imágenes de SEM con mayor aumento y escale y transforme según sea necesario. Seleccione la rotación de la imagen desde la barra de menú desplegable de imagen y gire horizontalmente la imagen sumatoria del césped. Copie y pegue la imagen sumatoria del césped en una nueva capa.Utilice el comando de transformación libre que se encuentra en el menú de edición para escalar la imagen, de modo que su tamaño sea aproximadamente igual al del micrografía electrónica de baja magnificación. Luego, gire la imagen según sea necesario para hacer coincidir la fluorescencia de las partículas de oro con las estructuras correspondientes visualizadas en el MEB. A continuación, copie la imagen de la palma en una nueva capa y aplique la misma transformación para extraer una imagen de mayor magnificación.Aumente el zoom en la región de interés y copie la imagen de la palma desde esa región. Pegue la imagen en una imagen de MEB de mayor resolución para su presentación. Se debe aplicar una transparencia degradada a la imagen de la palma, de modo que solo el fondo negro, pero no las señales de la palma, se vuelva transparente.Copie la imagen de la palma de transformación a una nueva capa. Seleccione las señales de la palma pero no el fondo utilizando el rango de color en el menú desplegable Seleccionar. Luego, seleccione un píxel del fondo como referencia y active la opción de invertir.Corte las señales de palma deseadas y péguelas en una nueva capa. Aplique transparencia a la capa de fondo y ajústela al 10 %. Esto permite la visualización de las señales de palma al hacer transparente el fondo sin comprometer la intensidad. Proteína histona.Se expresó establemente el TD eos marcado con His 11 en el nematodo C. elegans, y los animales transgénicos se procesaron e hicieron imágenes siguiendo el protocolo descrito en este video. Se obtuvieron micrografías de palma y micrografías electrónicas de la misma sección. Las nanopartículas de oro, que aparecen tanto en las micrografías de fluorescencia como en las electrónicas, se utilizaron entonces para alinear las dos imágenes.Aquí hacemos un acercamiento en una región cercana al extremo superior de la micrografía. Como puede observarse aquí, detalles subcelulares como un núcleo.Se puede observar un núcleo, poros nucleares y retículo endoplasmático. Sin embargo, las moléculas de histona marcadas están localizadas exclusivamente en el núcleo, pero no en el núcleo. Como era de esperar, la microscopía electrónica correlativa y PALM permite así la localización de proteínas con la máxima resolución. Tras realizar este procedimiento, se pueden tomar estas secciones con la distribución de proteínas y apilarlas mediante tomografía de matrices, de modo que se pueda generar una estructura tridimensional que muestre dónde están distribuidas las proteínas en la célula.Y recuerde que al usar el tetraóxido de osmio, se trata de un producto químico muy peligroso, y siempre debe usar guantes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video describe BiFC-PALM, una combinación de microscopía de localización fotoactivada y complementación de fluorescencia bimolecular, para evaluar las interacciones proteína-proteína. BiFC implica la fusión de dos fragmentos de proteínas fluorescentes con dos proteínas de interés que interactúan. Cuando las dos proteínas interactúan, los fragmentos se acercan, lo que permite que las dos partes se unan y reconstituyan una proteína fluorescente funcional. La fluorescencia de un solo...

Microscopía de localización fotoactivada acoplada a la complementación de fluorescencia bimolecular

Demostramos el uso de la microscopía de localización por fotoactivación de fluorescencia (FPALM) para obtener imágenes simultáneas de múltiples tipos de moléculas marcadas con fluorescencia dentro de las células. Las técnicas descritas producen la localización de miles a cientos de miles de proteínas individuales marcadas con fluorescentes, con una precisión de decenas de nanómetros dentro de células individuales.

Imágenes Multicolor Simultáneas de Estructuras Biológicas con Microscopía de Localización de Fotoactivación de Fluorescencia

Microscopía de localización fotoactivado (PALM) combinada con el seguimiento de una sola molécula permite la observación directa y la cuantificación de la proteína-DNA en células de E. coli vivas de Escherichia.

Visualización de la proteína-DNA en células bacterianas en directo mediante fotoactivado Tracking Single-molécula

Fluoróforos individuales pueden ser localizados con precisión nanométrica utilizando FIONA. Aquí se reporta un resumen de la técnica de FIONA, y la forma de llevar a cabo experimentos de FIONA se describe.

Imágenes de fluorescencia con un nanómetros Precisión (FIONA)

Las interacciones proteína-proteína se visualizan en células con resolución espacial nanométrica mediante la combinación de complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) con microscopía de localización fotoactivada (PALM). Aquí se describe el uso de BiFC-PALM para obtener imágenes de las interacciones Ras-Raf en células U2OS para visualizar la agrupación y difusión a nanoescala de complejos Ras-Raf individuales.

Fotoactivado Localización Microscopía con bimolecular fluorescencia Complementación (BiFC-PALM)

Aquí ilustramos cómo sola molécula de microscopía de localización foto-activado puede llevarse a cabo en la terminal del nervio motor de un vivo Drosophila melanogaster tercer instar de la larva.

En Vivo Una sola molécula de seguimiento en la Terminal presináptica del nervio Motor del Drosophila

Describimos cómo técnicas de micro - y Fotomanipulación como FRAP y fotoactivación permiten la determinación de los parámetros de motilidad y la dinámica espacio-temporal de las proteínas a migración de las células. Lecturas experimentales incluyen la dinámica subcelular y facturación de los reguladores de la motilidad o subyacente del citoesqueleto de actina.

Técnicas de micromanipulación que permite el análisis de las dinámicas morfogenéticas y facturación de los reguladores citoesqueléticos

Aquí, presentamos un protocolo para la localización de varios color de proteínas de membrana único en organelos de células vivas. Para colocar fluoróforos, se usan proteínas auto etiquetadas. Proteínas, situadas en compartimientos diferentes membranas de la mismo orgánulo, se pueden localizar con una precisión de ~ 18 nm.

Microscopía de localización de varios colores solo de proteínas de membrana en organelos de células mamíferas vivas

Este protocolo describe el método crioAPEX, en el que una proteína de membrana etiquetada con APEX2 puede ser localizada por microscopía electrónica de transmisión dentro de la ultraestructura celular óptimamente conservada.

El método CryoAPEX para el análisis de microscopía electrónica de la localización de proteínas de membrana dentro de células ultraestructuralmente conservadas

El presente protocolo describe una tecnología de etiquetado de microscopía electrónica clonable para detectar proteínas marcadas con metalotioneína en células utilizando una nueva técnica de síntesis de nanopartículas de oro basada en el mecanismo de supresión de autonucleación.

Síntesis directa de nanopartículas de oro EM-visibles en células para análisis de localización de proteínas con ultraestructura bien conservada

Aprende a localizar proteínas en micrografías electrónicas usando nano-FEM con microscopía de fluorescencia correlacionada en nematodos transgénicos. Este método supera las limitaciones de la inmuno-EM tradicional.

Nano-FEM: Proteína localización usando la foto activada por microscopía de localización y Microscopía Electrónica

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