Nano-FEM: Proteína localización usando la foto activada por microscopía de localización y Microscopía Electrónica

El objetivo general del siguiente experimento consiste en localizar proteínas en micrografías electrónicas mediante microscopía de fluorescencia y microscopía electrónica correlacionadas. Este método, conocido como nano FEM, se utiliza para localizar proteínas en C. elegans. Primero, un gusano transgénico que expresa la histona TD eos se incluye en plástico y se secciona.

Cada sección se imagina mediante microscopía de localización por activación fotónica o PALM y microscopía electrónica de barrido. Las dos micrografías de cada sección se alinean utilizando marcadores fiduciales con Photoshop. La imagen correlativa muestra la localización de las moléculas de histonas en el núcleo.

Entonces, la principal ventaja de la técnica que vamos a describir hoy es que, en lugar de utilizar inmunomicroscopía electrónica, estamos utilizando marcadores fluorescentes codificados genéticamente, de modo que cada proteína esté asociada con una proteína fluorescente. Al trabajar con inmunomicroscopía electrónica, muchos de los anticuerpos no pueden actuar sobre los plásticos. Simplemente no son compatibles, y si lo son, los anticuerpos no logran penetrar profundamente en la sección donde se encuentran los antígenos.

Al utilizar proteínas fluorescentes, cada proteína se marca con un fluoróforo. Así que hoy Shige WBI demostrará esta técnica. El siguiente procedimiento se demostrará utilizando nematodos transgénicos que expresan histonas marcadas con la proteína fluorescente TDE os.

Para esta demostración, utilizaremos bacterias como agente crioprotector, pero también puede usar BSA al 20 % para congelar *sea elegance*. Una hora antes de la sustitución por congelación, llene el aparato automático de sustitución por congelación o un dispositivo FS con nitrógeno líquido. También con antelación, prepare los fijadores necesarios según las instrucciones del documento adjunto, almacene los fijadores en alícuotas de un mililitro en viales criogénicos y colóquelos en nitrógeno líquido hasta su uso.

Utilice un pincel para recoger los animales de un césped bacteriano y transfiéralos para llenar un portamuestras de 100 micrones. Llene ligeramente por encima del borde para asegurar que no queden burbujas de aire. Una vez listo, coloque el portamuestras en la armadura de un congelador de alta presión para congelarlo. Luego, transfiera inmediatamente la muestra a un baño de nitrógeno líquido junto a la cámara de congelación.

A continuación, utilizando un embudo y un par de pinzas, transfiera el espécimen a un vial criogénico que contenga fijadores. Asegúrese de que el espécimen permanezca siempre sumergido en nitrógeno líquido. Repita este procedimiento para cada espécimen y luego transfiera todos los viales criogénicos a una unidad FS.

Una vez colocados todos los viales criogénicos en la unidad de FS, inicie el programa. En este diagrama se muestra el protocolo de congelación y procesamiento. Durante la incubación inicial a menos 90 grados Celsius, el hielo vítreo se sustituye por el fijador en acetona.

Luego, a medida que aumenta la temperatura de la muestra, el fijador en la acetona líquida realiza enlaces cruzados con la muestra para preservar su estructura. Cuando la temperatura en una unidad FS alcance menos 60 grados Celsius, coloque viales de centelleo que contengan 20 mililitros de acetona al 95 % en la unidad FS para enfriarlos. Luego, cuando la temperatura alcance menos 50 grados Celsius, utilice una pipeta Pasteur con una punta P 200 para retirar el fijador y añada aproximadamente un mililitro de acetona al 95 % previamente enfriada a cada muestra. Bilis.

Repita este proceso cada 20 minutos durante dos horas. Además, durante la incubación a menos 50 grados Celsius, coloque un vial de centelleo que contenga 20 mililitros de acetato de uranilo al 0,1 % en acetona al 95 % dentro de una cámara FS para preenfriarlo a menos 50 grados Celsius. Luego, tras el último lavado con acetona, agregue aproximadamente un mililitro de solución de acetato de uranilo a cada vial para teñir la muestra y realzar el contraste de la membrana.

Si el programa se ha detenido, reinícielo. Cuando la temperatura alcance menos 40 grados Celsius, coloque viales de centelleo que contengan etanol al 95 % en una cámara FS. Cuando la temperatura alcance menos 30 grados Celsius, utilice una pipeta Pasteur para reemplazar el acetato de uranilo con etanol al 95 % cada 20 minutos durante dos horas.

Es importante usar etanol en este paso, ya que la resina no se polimerizará en presencia de acetona. En la siguiente parte del protocolo, los especímenes se incluyen en plástico mientras se encuentran a menos 30 grados Celsius. En el FS, sustituya el etanol al 95% por resina de glicol metacrilato o GMA al 30% preenfriada en etanol al 95%; tras tres a cinco horas, sustituya la GMA al 30% por GMA al 70%; tras cuatro a seis horas, retire la GMA al 70% e incube los especímenes en GMA al 97% durante la noche.

El aumento escalonado de la concentración de GMA permite la penetración del medio en los tejidos. Tenga en cuenta que, dado que se añade 3% de agua a la resina de GMA, el GMA al 97% no se diluye. Al día siguiente con etanol, transfiera las muestras a un molde de inclusión en el A FS utilizando una pipeta Pasteur; coloque las muestras en el molde de inclusión y luego sustituya el GMA al 97% por GMA recién preparado tres veces durante seis horas a menos 30 grados centígrados.

Después del tercer intercambio, golpee suavemente la matriz bacteriana para separar la muestra del crioprotector. Añada el iniciador nn dimetil udina al 97% GMA en un vial ventilado. La cantidad de iniciador añadido es de 1,5 microlitros por cada mililitro de GMA; inmediatamente, añada la solución de GMA a cada molde de inclusión y coloque los animales en el molde de manera que queden equidistantes.

Reinicie el programa para que la temperatura aumente a menos 20 grados Celsius. Aunque la resina se polimeriza rápidamente en una hora, deje que el plástico cure durante la noche a menos 20 grados Celsius. Para asegurarse de que se polimerice completamente.

Una vez que el plástico haya fraguado, guarde el espécimen en una bolsa al vacío llena con gas nitrógeno a menos 20 grados Celsius. El corte de espécimenes incluidos en GMA debe realizarse entonces según se describe en el documento adjunto para microscopía de localización por activación fotónica o imagenología PALM. El sistema microscópico debe configurarse con la cámara E-M-C-C-D ajustada a menos 70 grados Celsius o inferior.

Utilizando una pipeta, aplique aproximadamente 50 microlitros de partículas de oro de 100 nanómetros a una concentración de 1 × 10¹⁰ partículas por mililitro en solución sobre la muestra que se va a imaginar. Coloque una funda negra sobre las muestras y deje que la solución repose durante 30 segundos sobre el portaobjetos. Para eliminar la solución de oro, sople suavemente hacia el borde del portaobjetos y absorba la solución con una toallita absorbente.

Luego, aplique grasa para vacío a un portaobjetos circular y coloque el cubreobjetos. Aplique aceite de inmersión en la cara inferior del cubreobjetos. Deslícelo directamente debajo de la muestra.

Inserte el portaobjetos en la ranura del portaobjetos del microscopio y ajústelo para que quede bien ajustado y centre las secciones sobre el objetivo. Tenga especial cuidado en no tocar los objetivos. A continuación, utilizando iluminación de campo claro, localice las secciones empleando un objetivo de 10 x.

Luego cambie al objetivo de 100 x y enfoque el espécimen. Si es necesario, cambie a la iluminación de fluorescencia utilizando el láser de 488 nanómetros con la intensidad ajustada al 10 %. Espere cinco minutos para que la temperatura de la muestra se equilibre. Luego identifique las regiones con la fluorescencia más intensa y enfoque.

Cambie los láseres a 561 nanómetros y aumente la intensidad al 100 %. Para eliminar la autofluorescencia de fondo, blanquee la muestra durante aproximadamente dos minutos. Si el enfoque cambia durante el blanqueo, espere cinco minutos antes de ajustar el enfoque y capturar las imágenes. Cuando el blanqueo haya finalizado, active el láser de 405 nanómetros y ajústelo a la intensidad más baja.

Comience a recolectar las imágenes a 20 cuadros por segundo. Recolecte suficientes cuadros para alcanzar el objetivo del experimento aquí. Se toman de 5.000 a 6.000 cuadros para determinar la localización de 584 proteínas histónicas dentro de un núcleo.

Una vez que se han recopilado 5.000 cuadros, el software de imagen identifica y localiza todas las moléculas. La imagen final de fluorescencia, o llamada imagen de some turf, es un compuesto de toda la fluorescencia detectada en la cámara. En contraste, la imagen palm localiza el OID de cada punto fluorescente e indica únicamente la ubicación de cada proteína.

Antes de la imagenología por MEB, tiña los cortes utilizando acetato de uranilo al 2,5 % en agua durante cuatro minutos. Lave cuidadosamente el acetato de uranilo con agua Milli-Q filtrada. Una vez que los cortes estén secos, utilice un pulverizador catódico para recubrir con carbono la laminilla hasta que se vuelva bastante oscura.

Aplique cinta conductora de carbono en el borde del portaobjetos en un extremo y en el soporte metálico en el otro extremo, de modo que los electrones que se acumulan en la superficie del portaobjetos sean conectados a tierra. Monte el portaobjetos en la cámara del MEB y localice la muestra en el microscopio. Tome una imagen de baja magnificación de la muestra, luego acerque la zona de interés y obtenga imágenes de alta magnificación.

Repita este proceso con una nueva sección hasta que todas las secciones hayan sido imagenadas. A continuación, las imágenes de palma y de ME deben alinearse. Para ello, primero abra las imágenes de ME adquiridas en Photoshop.

Cree una nueva ventana con dimensiones de 5.000 por 5.000 píxeles y una resolución de 300 píxeles por pulgada. Copie la imagen de microscopía electrónica de barrido (MEB) con la ampliación cargada en la nueva ventana. Utilice el comando de transformación libre que se encuentra en el menú de edición para escalar la imagen de modo que llene toda la ventana.

Luego copie las imágenes de SEM con mayor aumento y escale y transforme según sea necesario. Seleccione la rotación de la imagen desde la barra de menú desplegable de imagen y gire horizontalmente la imagen sumatoria del césped. Copie y pegue la imagen sumatoria del césped en una nueva capa.

Utilice el comando de transformación libre que se encuentra en el menú de edición para escalar la imagen, de modo que su tamaño sea aproximadamente igual al del micrografía electrónica de baja magnificación. Luego, gire la imagen según sea necesario para hacer coincidir la fluorescencia de las partículas de oro con las estructuras correspondientes visualizadas en el MEB. A continuación, copie la imagen de la palma en una nueva capa y aplique la misma transformación para extraer una imagen de mayor magnificación.

Aumente el zoom en la región de interés y copie la imagen de la palma desde esa región. Pegue la imagen en una imagen de MEB de mayor resolución para su presentación. Se debe aplicar una transparencia degradada a la imagen de la palma, de modo que solo el fondo negro, pero no las señales de la palma, se vuelva transparente.

Copie la imagen de la palma de transformación a una nueva capa. Seleccione las señales de la palma pero no el fondo utilizando el rango de color en el menú desplegable Seleccionar. Luego, seleccione un píxel del fondo como referencia y active la opción de invertir.

Corte las señales de palma deseadas y péguelas en una nueva capa. Aplique transparencia a la capa de fondo y ajústela al 10 %. Esto permite la visualización de las señales de palma al hacer transparente el fondo sin comprometer la intensidad. Proteína histona.

Se expresó establemente el TD eos marcado con His 11 en el nematodo C. elegans, y los animales transgénicos se procesaron e hicieron imágenes siguiendo el protocolo descrito en este video. Se obtuvieron micrografías de palma y micrografías electrónicas de la misma sección. Las nanopartículas de oro, que aparecen tanto en las micrografías de fluorescencia como en las electrónicas, se utilizaron entonces para alinear las dos imágenes.

Aquí hacemos un acercamiento en una región cercana al extremo superior de la micrografía. Como puede observarse aquí, detalles subcelulares como un núcleo.

Se puede observar un núcleo, poros nucleares y retículo endoplasmático. Sin embargo, las moléculas de histona marcadas están localizadas exclusivamente en el núcleo, pero no en el núcleo. Como era de esperar, la microscopía electrónica correlativa y PALM permite así la localización de proteínas con la máxima resolución. Tras realizar este procedimiento, se pueden tomar estas secciones con la distribución de proteínas y apilarlas mediante tomografía de matrices, de modo que se pueda generar una estructura tridimensional que muestre dónde están distribuidas las proteínas en la célula.

Y recuerde que al usar el tetraóxido de osmio, se trata de un producto químico muy peligroso, y siempre debe usar guantes.