Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

El objetivo general de este procedimiento es generar ratones adultos a partir de células madre pluripotentes inducidas, o PSC I, por complementación de embriones tetraploides. Esto se logra llegando primero. I PSCs de fibroblastos embrionarios de ratón utilizando lentivirus, portadores de OCT cuatro, SOX dos, KLA cuatro y cmic y suplementando los medios con ácido valproico o VPA.

Una vez que se generan los IPC, se caracterizan por inmunotinción, recuento de cromosomas y formación de cuerpos embrionarios. El siguiente paso es generar la asistencia blástica tetraploide del receptor mediante fusión y cultivo in vitro. Posteriormente, las IPSC se inyectan en el asistente blasto tetraploide y el asistente blast complementado se trasplanta a las hembras receptoras para la gestación.

En el paso final, los animales a término se entregan por cesárea y a madres sustitutas. Por lo tanto, el desarrollo postnatal puede ser monitoreado. En última instancia, si se generan animales viables a término.

La línea de ensayo IPSC se considera totalmente pluripotente. La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos de generación de PSCs I es que nuestro método genera de forma reproducible líneas celulares IPS totalmente pluripotentes Las líneas celulares IPS generadas por estos métodos pueden ser útiles para otros investigadores que deseen comparar la pluripotencia de sus células IPS o establecer la equivalencia de otros métodos de reprogramación. Estos métodos serán útiles para los investigadores que deseen generar líneas celulares IPS totalmente pluripotentes para aplicaciones posteriores específicas, como los ensayos de diferenciación in vitro.

Avanzar en la generación de todos los ratones IPSC. El uso de la complementación telo puede servir como un medio útil para determinar la estabilidad genética y epigenética de varias líneas celulares. Las manipulaciones de microm involucradas en la complementación de embriones tetraploides son técnicamente desafiantes.

Pueden pasar varios meses antes de que alguien se vuelva competente En las técnicas IPSC se desarrolla mediante esta técnica requiere condiciones de cultivo similares a las utilizadas en los experimentos tradicionales de orientación génica de ESL. 24 horas después de la transfección de células T HEC 2 9 3 con lentivirus. Retire el medio de crecimiento y reemplácelo con 25 mililitros de tecnología de precalentamiento fresco.

Medio retorno hexágono TRANSFECTADO a la incubadora durante 24 horas, 48 horas después de la transfección de las células T HEC 2 9 3 con lentivirus recogen el medio de crecimiento que contiene partículas lentivirales de las células transfectadas. Elimine los restos de partículas del medio que contiene el virus mediante centrifugación a 3000 Gs durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, concentrar el virus por ultracentrifugación a través de un cojín de sacarosa al 20% durante dos horas a 112.000 Gs a cuatro grados centígrados.

Decantar cuidadosamente en un contenedor de residuos para su descontaminación sin alterar la gránula viral. Vuelva a suspender el gránulo viral en 0,4 mililitros de medio de fibroblastos embrionarios de ratón y selle el tubo. Luego mézclelo suavemente a cuatro grados centígrados durante 15 a 30 minutos.

Almacene las partículas virales y las alícuotas de un solo uso a menos 80 grados centígrados.IPSC. Las líneas se derivan de fibroblastos embrionarios de ratón o células de metanfetamina. Una vez que las colonias de IPSC poseen un borde refractivo brillante y bien definido y contienen de 30 a 50 células, están listas para ser seleccionadas y expandidas manualmente como líneas IPSC independientes.

Elija colonias individuales con una punta de pipeta de carga de gel y transfiera cada colonia directamente a un solo pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en U que contenga 20 microlitros de tripsina al 0,25%, EDTA, incube las colonias seleccionadas y tripsina durante unos ocho minutos a 37 grados Celsius o hasta que las colonias se disocien en células individuales. Monitorear el progreso de la disociación mediante microscopía óptica. Puede ser necesaria una tación suave.

Transfiera la suspensión celular disociada a una placa de 96 pocillos que contenga una capa de alimentación y 150 microlitros de medio ESC suplementado con doxiciclina y VPA Cuando las colonias de IPSC reaparecen en cada pocillo, divididas en pocillos más grandes para su análisis y almacenamiento de células, utilizando los procedimientos estándar de derivación de ESC y cultivo celular para comenzar el procedimiento de generación de asistencia de explosión tetraploid. Los embriones de una célula recolectados de ratones hembra se cultivan en dos embriones celulares durante la noche en KSOM a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono al día siguiente. Coloque un micro portaobjetos BTX en una placa de Petri de 10 centímetros.

Vierta suficientes medios de electrofusión a temperatura ambiente para sumergir el portaobjetos en la solución, pero no tanto como para que los polos del electrodo queden completamente sumergidos. Encienda el manipulador de celdas eléctricas BTX ECM 2001 y BTX enhancer 400. Conecte los cables del ECM al electrodo de los microportaobjetos y fije los cables al lado de la placa de Petri para evitar el movimiento involuntario del portaobjetos.

Ejecute un pulso manual para obtener una lectura en el potenciador BTX y observe el voltaje de las corrientes de CC que se aplican. La corriente alterna controlará la velocidad a la que los embriones se alinean entre los electrodos. La corriente continua fusionará los blasfemos y el tiempo de pulso establecerá la longitud del pulso de CC.

Un buen punto de partida es CA, tres voltios, CC, 100 voltios y multiplicado por 0,05 milisegundos. La CC óptima varía en el rango de 90 a 150 voltios. Usando una pipeta bucal.

Tome de 30 a 42 embriones celulares de cultivo KSOM y transfiéralos a una gota de electrofusión. Lavar en medio varias gotas de medio de electrofusión. A continuación, extraiga un medio de electrofusión fresco de la placa de microdeslizamiento en la pipeta bucal.

Tome los embriones lavados y colóquelos en el espacio de un milímetro entre los electrodos en el microportaobjetos. Tenga cuidado de que los embriones estén alineados en el medio del espacio y no estén en contacto entre sí. Aplique corriente alterna presionando el botón de inicio manual.

Los embriones rotarán en el campo de CA hasta que el plano de contacto más blasier sea paralelo a los electrodos. Si los embriones no se alinean en unos segundos, aumente la configuración de CA. Una vez que los embriones se hayan alineado, presione el botón de inicio manual nuevamente para aplicar el pulso de CC con medio de electrofusión en la pipeta.

Recoja los embriones del microportaobjetos, lave los embriones a través de varias gotas de medio KSOM y luego cultive los embriones en KSOM bajo aceite mineral a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. La fusión del blaster debería completarse en menos de 30 minutos. En cultivo, monitorizar y seleccionar embriones con blastómeros fusionados con éxito.

Los embriones fusionados parecerán estar en la etapa de una célula descartada y dos embriones celulares después de 30 minutos en cultivo, continuarán cultivando embriones fusionados en micro gotas de KSOM bajo aceite mineral a 37 grados Celsius. 5% de dióxido de carbono para preparar los IPC para la inyección rápida, descongele los IPC previamente almacenados y póngalos en los alimentadores en medio ESC paso a las células al menos una vez en los alimentadores. Después de descongelar antes de usar para inyección.

Un pocillo de una placa de seis pocillos que contiene entre un 70 y un 80% de IPC confluentes proporcionará un número más que suficiente de células para la inyección, aspire el medio de crecimiento y lave las células con tres mililitros de PBS sin calcio ni magnesio a 0,5 mililitros de precalentamiento, 0,05% de EDTA a las células e incube a 37 grados Celsius durante 10 minutos con balanceo ocasional a 3,0 mililitros de medio ESC e itere para obtener un solo suspensión de la célula. Observe las células mediante microscopía óptica para asegurarse de que una sola suspensión, colonias o agregados celulares obstruyan la pipeta de inyección. Una vez que se haya logrado una suspensión de una sola celda, agregue un mililitro de medio ESC al pocillo y devuelva la placa a la incubadora a 37 grados Celsius.

Incube durante unos 15 minutos o hasta que la mayoría de las celdas del alimentador hayan comenzado a adherirse, retire suavemente el medio que contiene las IPC. Teniendo cuidado de no desplazar las células alimentadoras adherentes semanales. Coloque los IPC en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de centrífuga media ESC a 200 G durante cinco minutos.

Aspire el sobrenadante y elimine el resto del medio ESC con una micropipeta. Golpee el tubo para desalojar el pellet y vuelva a suspender suavemente las células en 0,2 a 0,5 mililitros de medio FHM preenfriado. Almacene las células en hielo hasta y durante la inyección en las asistencias de explosión tetraploides. Para obtener información sobre el protocolo para la inyección de asistencia de explosión, consulte el manuscrito que acompaña a este artículo y un artículo de Strove publicado anteriormente, un extracto del cual se muestra en la pantalla aquí.

En estas imágenes se muestran ejemplos de la progresión morfológica de fibroblastos a colonias de IPSC durante el curso de un experimento de reprogramación. La heterogeneidad morfológica y la formación de colonias de IPSC parcialmente reprogramada deben observarse a partir de los cuatro o cinco días después de la edición de la doxiciclina VPA, como se muestra en los paneles B del CESE. Al igual que las IPSC, las colonias deben aparecer entre siete y 10 días, como se muestra en el Panel F. La producción de embriones de telo de una célula por electrofusión de embriones diploides de dos células es altamente eficiente.

Es habitual observar hasta el 95% de los embriones de dos células tratados fusionados con éxito para producir embriones tetraploides de una célula. El protocolo utilizado en este experimento para inyectar IPSC en la asistencia de blasto tetraploide es similar al protocolo para la inyección de E SES en la asistencia de blasto diploide para generar ratones quiméricos para descartar fácilmente la generación de quimeras diploides, la pigmentación de las cepas de ratón utilizadas para generar IPS y embriones tetraploides se eligen cuidadosamente cuando es posible. En este ejemplo, los embriones tetraploides se producen a partir de una cepa albina y los IPSC se generan a partir de una cepa pigmentada.

Así, los ratones IPSC recién nacidos muestran ojos pigmentados y un color de pelaje uniformemente pigmentado en la edad adulta, mientras que los kyras diploides mostrarían una coloración mixta albina y pigmentada. El número de crías vivas nacidas depende de la línea celular, como se muestra en esta tabla. Para una línea IPSC medianamente buena, los experimentadores deben esperar que entre el 1% y el 10% de la asistencia blástica inyectada produzca cachorros recién nacidos vivos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo derivar células IPS completamente pluripotentes y también cómo validar su potencial de desarrollo. Utilizando el ensayo de complementación tetraploide Una vez dominada esta técnica desde la derivación de MES hasta el IPSC recién nacido, los ratones pueden completarse de dos a tres meses. El desarrollo y mantenimiento de las PSC I requiere un alto nivel de técnica de cultivo celular.

La experiencia previa con la cultura ESL es esencial. No olvide que trabajar con lentivirus, especialmente con lentivirus concentrado, puede ser extremadamente peligroso. Siempre se debe usar el equipo de protección personal requerido por su institución y asegurarse de tratar todo lo que haya estado en contacto con el virus, con lejía al 10% durante al menos 20 minutos después de este procedimiento.

Todos los ratones IPSC y sus tejidos pueden ser analizados para determinar los fenotipos fisiológicos, patológicos y conductuales.