Name: Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Aprenda a generar ratones adultos a partir de células madre pluripotentes inducidas mediante complementación de embriones tetraploides. Este protocolo valida la pluripotencia completa de líneas iPSC para investigación en biología del desarrollo.

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Apoyo a KKB, MJB, JLH y KLN fue proporcionada por el Instituto de Medicina Regenerativa de California, el Programa Pew Charitable Trusts Biomédica Scholars, el Esther B. O&#39;Keeffe Family Foundation y la Fundación de la Familia Shapiro. KKB es un Donald E. y Delia B. Baxter Fundación Facultad Scholar.

<ol><li>Boland, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mice+generated+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult mice generated from induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 461, 91-94 (2009).</li>
<li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li>
<li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 8424-8428 (1993).</li>
<li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vigor%2C+fetal+overgrowth%2C+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6209-6214 (2001).</li>
<li>Eggan, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEggan%2C+K+%22Generation+of+embryonic+stem+%28ES%29+cell-derived+embryos+and+mice+by+tetraploid-embryo+complementation%22">Generation of embryonic stem (ES) cell-derived embryos and mice by tetraploid-embryo complementation</a>. , Springer. (2006).</li>
<li>McLaughlin, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+tetraploid+embryos+by+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Production of tetraploid embryos by electrofusion.</a> Methods Enzymol. 225, 919-930 (1993).</li>
<li>Humpherys, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+instability+in+ES+cells+and+cloned+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Epigenetic instability in ES cells and cloned mice.</a> Science. 293, 95-97 (2001).</li>
<li>Kang, L., Wang, J., Zhang, Y., Kou, Z., Gao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells+can+support+full-term+development+of+tetraploid+blastocyst-complemented+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">iPS cells can support full-term development of tetraploid blastocyst-complemented embryos.</a> Cell Stem Cell. 5 (09), 135-138 (2009).</li>
<li>Zhao, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells+produce+viable+mice+through+tetraploid+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation.</a> Nature. 461, 86-90 (2009).</li>
<li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+mice+produced+from+three-factor+induced+pluripotent+stem+%28iPS%29+cells+through+tetraploid+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Viable mice produced from three-factor induced pluripotent stem (iPS) cells through tetraploid complementation.</a> Cell Res. 21, 546-549 (2011).</li>
<li>Zhao, X. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+Fertile+Mice+Generated+from+Fully+Pluripotent+iPS+Cells+Derived+from+Adult+Somatic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Viable Fertile Mice Generated from Fully Pluripotent iPS Cells Derived from Adult Somatic Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6, 390-397 (2010).</li>
<li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx3+improves+the+germ-line+competency+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tbx3 improves the germ-line competency of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 463, 1096-1100 (2010).</li>
<li>Stadtfeld, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+prevents+loss+of+Dlk1-Dio3+imprinting+and+facilitates+generation+of+all-iPS+cell+mice+from+terminally+differentiated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells.</a> Nat. Genet. 44, 398-405 (2012).</li>
<li>Stadtfeld, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+silencing+of+imprinted+genes+on+chromosome+12qF1+in+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aberrant silencing of imprinted genes on chromosome 12qF1 in mouse induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 465, 175-181 (2010).</li>
<li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+stoichiometry+influences+the+epigenetic+state+and+biological+properties+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).</li>
<li>Go, W. Y., Ho, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+direct+comparison+of+the+dimerizer+and+reverse+tet+transcriptional+control+systems%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Optimization and direct comparison of the dimerizer and reverse tet transcriptional control systems.</a> The Journal of Gene Medicine. 4, 258-270 (2002).</li>
<li>Huangfu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+by+defined+factors+is+greatly+improved+by+small-molecule+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds.</a> Nature. 26, 795-797 (2008).</li>
<li>Li, X. -y, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+number+affects+the+pluripotency+of+mouse+embryonic+stem+cells+as+judged+by+tetraploid+embryo+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation.</a> Cell and Tissue Research. 327, 607-614 (2007).</li>
<li>George, S. H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+adult+phenotyping+directly+from+mutant+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Developmental and adult phenotyping directly from mutant embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 4455-4460 (2007).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+A+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).</li>
<li>Kirak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transnuclear+Mice+with+Pre-defined+T+Cell+Receptor+Specificities+Against+Toxoplasma+gondii+Obtained+Via+SCNT%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT.</a> J. Vis. Exp. (43), e2168(2010).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Generación de ratones a partir de líneas de IPSC usando ensayos TEC ofrece una rigurosa prueba funcional de la pluripotencia de una línea de IPSC. Esta prueba puede ser útil para evaluar la eficacia relativa de los diferentes métodos de reprogramación o para identificar líneas de IPSC que pueden ser más útiles para generar ciertos tipos de células in vitro. Los ratones generados a partir de iPSCs puede ser utilizado para probar rigurosamente la estabilidad a largo plazo y la tumorigenicidad de IPSC derivados de tejidos. Este protocolo será de utilidad para los investigadores que deseen generar líneas IPSC plenamente pluripotentes o ratones IPSC o para comparar la utilidad relativa de los diferentes métodos de reprogramación. Los mecanismos que controlan la generación e identificación de iPSCs plenamente pluripotentes tampoco se conoce bien y es posible que algunas líneas de IPSC producido utilizando este método no pasará la prueba TEC. Hay muchos factores que pueden variar entre los experimentos genéticos, incluidos los fondos de titulación lentiviral, los patrones de lentiviral insertion, los parámetros del ciclo celular de la población de donantes, entre laboratorios diferencias en diversas etapas del procedimiento de TEC y propensiones variables de iPSCs para albergar aberraciones genéticas o epigenéticas. Para garantizar el mejor éxito, nos ocupamos de establecer los niveles apropiados de expresión génica lentiviral en experimentos de derivación IPSC probando diluciones virales en MEFs de control para asegurar que cada virus está suficientemente concentrada como para producir la expresión del gen detectable al menos 80% y, preferiblemente, 100% de la MEFs. Esto nos permite identificar líneas con múltiples copias de los lentivirus diferentes, mientras que la toxicidad limitante de la MEFs y producir colonias sin hacinamiento de los pozos. Cabe señalar que varios otros protocolos han demostrado producir iPSCs con potencial de desarrollo completo, utilizando múltiples métodos y fuentes de donantes de células que sugieren que múltiples rutas hacia completo pluripotencia pueden existir 1,8-13,15. En la actualidad, sin embargo, ningún biomarcador definitivo de completamente pluripotentes CMPiSe ha identificado y por lo tanto el ensayo de TEC sigue siendo la prueba patrón oro de si una línea de IPSC puede generar todos los linajes de células en un organismo.

<table><tbody><tr><td>DMEM (glucosa alta)</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>SFB calificado para células ES</td><td>Invitrogen</td><td>104392-024</td><td></td></tr><tr><td>SFB</td><td>Invitrogen</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapto&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma</td><td>Sigma M7522</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina al 0,1 %</td><td>Millipore</td><td>ES006-B</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos No Esenciales</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Medio 199</td><td>Invitrogen</td><td>11150-059</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO (LIF murino)</td><td>Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>Ácido valproico</td><td>Sigma</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>PBS Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>PBS Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; libre</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Gonadotropina sérica de yegua preñada, para superovulación, liofilizada, 2.000 UI</td><td>Instituto de Investigación Harbor-UCLA</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>gonadotropina coriónica humana</td><td>Sigma</td><td>C1063</td><td></td></tr><tr><td>Medio FHM con hialuronidasa</td><td>Millipore</td><td>MR-056-F</td><td></td></tr><tr><td>medio KSOM-1/2 AA</td><td>Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>HMF</td><td>Millipore</td><td>MR-024-D</td><td></td></tr><tr><td>Agua, para transferencia de embriones, embriones analizados</td><td>Sigma</td><td>W1503</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral, probado en embriones</td><td>Sigma</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>D-Manitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA), probada en embriones</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos embrionarios de ratón, no irradiados</td><td>Millipore</td><td>PMEF-CFL</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;p class=&quot;jove_contenido&quot;&gt;&lt;fuerte&gt;Medios y tampones utilizados en este protocolo&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_contenido&quot;&gt;Medio de crecimiento para HEK293T. 90 % DMEM, 10 % SFB, 100 U/ml de penicilina y 10 mg/ml de estreptomicina. Excluir penicilina y estreptomicina del medio para HEK utilizado el día de la transfección. El medio para HEK se puede almacenar a 4 &amp;deg;C durante hasta 1 mes.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_contenido&quot;&gt;2x HBS. 42 mM Hepes, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 12 mM Dextrosa. Ajustar el pH a 7,1 ± 0,1. ¡El pH es crítico! Filtrar estérilmente y almacenar a 4 &amp;deg;C.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_contenido&quot;&gt;Medio de crecimiento para fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) (también para uso con alimentadores). 70 % DMEM, 20 % Medio 199, 10 % SFB, 100 U/ml de penicilina y 10 mg/ml de estreptomicina. Almacene a 4 °C. &amp;deg;C durante hasta 1 mes.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_contenido&quot;&gt;Medio de crecimiento para ESC. 85 % DMEM, 15 % FBS calificado para células ES, Glutamax 1x, 0,1 mM aminoácidos no esenciales, 0,1 mM &amp;#946;-mercapto&amp;#8211;etanol, 1.000 U/ml de ESGRO, 100 U/ml de penicilina y 10 mg/ml de estreptomicina. El medio para ESC se puede almacenar a 4 &amp;deg;C durante hasta tres semanas.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_contenido&quot;&gt;Medio de electrofusión. Manitol 0.3 M, MgSO₄ 0.1 mM&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 50 mM CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;y 3% de BSA en agua de embrión probada. Almacene a 4 &amp;deg;C durante hasta 3 meses.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

La producción de células madre pluripotentes inducidas (iPS) a partir de células somáticas proporciona un medio para crear herramientas valiosas para la investigación básica y también puede producir una fuente de células encontrados en el paciente para terapias regenerativas. iPSCs se pueden generar usando múltiples protocolos y derivados de fuentes múltiples de la célula. Una vez generado, iPSCs se prueban utilizando una variedad de ensayos que incluyen la inmunotinción para marcadores de pluripotencia, generación de tres capas germinales en cuerpos embrioides y los teratomas, las comparaciones de la expresión génica con células madre embrionarias (CME) y la producción de ratones quiméricos con o sin línea germinal contribución 2 . Es importante destacar que las líneas de IPSC que pasan estas pruebas todavía varían en su capacidad para producir diferentes tipos de células diferenciadas 2. Esto ha hecho que sea difícil establecer qué protocolos IPSC derivación, fuentes de donantes de células o los métodos de selección son más útiles para diferentes aplicaciones. La prueba más rigurosade si una línea de células madre tiene el suficiente potencial de desarrollo para generar todos los tejidos necesarios para la supervivencia de un organismo (denominado completo pluripotencia) es la complementación embrión tetraploide (TEC) 3-5. Técnicamente, TEC implica electrofusión de embriones de dos células para generar tetraploides (4n) de una célula de embriones que se pueden cultivar in vitro hasta la etapa de blastocisto 6. Diploide (2N), las células madre pluripotentes (por ejemplo, los CES o IPSCs) se inyectan en la cavidad blastocele del blastocisto tetraploide y se transfiere a una hembra receptora para la gestación (ver Figura 1). El componente tetraploide del embrión complementado contribuye casi exclusivamente a los tejidos extraembrionarios (placenta, saco vitelino), mientras que las células diploides constituye el propio embrión, lo que resulta en un feto deriva totalmente de la línea de células madre inyectados. Recientemente, se informó de la derivación de líneas de IPSC que generan y reproducen los ratones adultospor TCE 1. Estas líneas IPSC dar lugar a crías viables con eficiencias del 5-13%, que es comparable a los CES 3,4,7 y mayor que el reportado para la mayoría de las otras líneas 8-12 IPSC. Estos informes muestran que la reprogramación directa puede producir iPSCs plenamente pluripotentes que coincidan con los CES en su potencial de desarrollo y la eficiencia de la generación de crías en las pruebas de TEC. En la actualidad, no está claro lo que distingue entre iPSCs plenamente pluripotentes y las líneas menos potentes 13-15. Tampoco está claro qué métodos de reprogramación se producen estas líneas con la máxima eficiencia. Aquí se describe un método que produce iPSCs plenamente pluripotentes y &quot;all-IPSC ratones&quot;, que pueden ser útiles para los investigadores que deseen comparar la pluripotencia de las líneas de IPSC o establecer la equivalencia de los diferentes métodos de reprogramación.

En el paso 3, «Obtención de iPSC a partir de MEF», se debe observar heterogeneidad morfológica y formación de colonias de iPSC inmaduras a partir de los 4-5 días posteriores a la adición de doxiciclina/VPA, y colonias maduras entre los 7 y 10 días (Figura 2). La producción de embriones tetraploides de una sola célula en el paso 5 es altamente eficiente (Figura 3). Habitualmente observamos hasta un 95 % de embriones de dos células tratados que se fusionan con éxito para producir embriones tetraploides de una sola célula. El protocolo seguido para inyectar iPSC en blastocistos tetraploides (paso 6, Figura 4) es similar al protocolo para la inyección de ESC en blastocistos diploides con el fin de generar ratones quiméricos, y puede realizarse por un microinyector experimentado. El número de crías nacidas vivas depende de la línea celular (Tabla 1).
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="5">Eficiencia de preprogramación de MEF 0.01-0.03%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">Eficiencia de producción de iPSC murinas mediante TEC</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>Nombre</td>
			<td>Descripción</td>
			<td>Blastocistos inyectados</td>
			<td>Recién nacidos vivos</td>
			<td>Adultos vivos</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-21</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>867</td>
			<td>53 (6.1%)</td>
			<td>19 (2.2%)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-9</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>195</td>
			<td>7 (3.6%)</td>
			<td>4 (2.1%)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-11</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>338</td>
			<td>1(0.3%)</td>
			<td>0 (0%)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1. Resultados representativos.
<img alt="Diagrama de complementación de blastocistos tetraploides; creación de ratones iPSC a partir de embriones diploides, E13." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Esquema del diseño experimental. Arriba a la izquierda: producción de blastocistos tetraploides. Embriones fertilizados de dos células procedentes de ratones albinos se fusionan mediante electrofusión para generar embriones tetraploides de una sola célula, que se cultivan in vitro hasta la etapa de blastocisto. Abajo a la izquierda: reprogramación. Los fibroblastos embrionarios de ratón se transducen con partículas lentivirales que codifican Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc y la proteína transactivadora inversa de tetraciclina, rtTAM2.2. La adición de doxiciclina induce la expresión del transgén y el inicio de la reprogramación hacia células iPSC. Derecha: producción de ratones iPSC. Las células iPSC derivadas de ratones pigmentados se inyectan en el blastocele de blastocistos tetraploides y luego se implantan quirúrgicamente en ratones receptores pseudoembarazadas. Los ratones iPSC recién nacidos se obtienen mediante cesárea y se crían por cría cruzada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig1large.jpg" target="_blank"> Haga clic aquí para ver la figura en tamaño ampliado</a>.
<img alt="Proceso de reprogramación celular; imágenes de microscopía; transformación de MEFs a iPSCs a 10x, 20x de aumento." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Cambios morfológicos asociados con la reprogramación. De izquierda a derecha: ejemplos de la progresión morfológica desde fibroblastos hasta colonias de iPSCs durante el transcurso de un experimento de reprogramación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig2large.jpg" target="_blank"> Haga clic aquí para ver la figura en tamaño ampliado</a>.
<img alt="Etapas del desarrollo embrionario: de 2 células (2n), fusión de blastómeros, de 1 célula (4n); imágenes de microscopía." src="/files/ftp_upload/4003/4003fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Producción de embriones tetraploides. A embriones diploides de dos células se les aplica un impulso eléctrico que provoca la fusión de los blastómeros y la generación de embriones tetraploides de una sola célula.
<img alt="inyección de iPSC en blastocisto, resultado en recién nacido iPSC y ratón de 3 semanas; resultados del estudio celular." src="/files/ftp_upload/4003/4003fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4. Producción de ratones con iPSC. Izquierda: las iPSC se inyectan en el blastocele de un blastocisto tetraploide. Centro: los ratones recién nacidos con iPSC se distinguen por sus ojos pigmentados. Derecha: ratón iPSC a las tres semanas posteriores al parto.

Generación de células madre pluripotentes inducidas (IPSC) Líneas produce líneas con diferente potencial de desarrollo aún cuando pasan las pruebas estándar de pluripotencia. Aquí se describe un protocolo para producir ratones totalmente derivadas de iPS, que define las líneas de IPSC como poseedor completo pluripotencia<sup&gt; 1</sup&gt;.

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

La producción de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de células somáticas proporciona un medio para crear herramientas valiosas para la investigación básica y también puede...

El objetivo general de este procedimiento es generar ratones adultos a partir de células madre pluripotentes inducidas, o iPSC, mediante complementación de embriones tetraploides. Esto se logra primero obteniendo iPSC a partir de fibroblastos embrionarios de ratón utilizando virus lentivirales que portan OCT4, SOX2, KLF4 y c-Myc, y suplementando el medio con ácido valproico o VPA.Una vez generadas las CIP, se caracterizan mediante tinción inmunológica, conteo cromosómico y formación de cuerpos embrionarios. El siguiente paso consiste en generar un blastocisto tetraploide receptor mediante fusión y cultivo in vitro. Posteriormente, las CIPSC se inyectan en el blastocisto tetraploide receptor y los blastocistos complementados se trasplantan a hembras receptoras para la gestación.En el paso final, los animales a término completo se obtienen mediante cesárea y se entregan a madres sustitutas. Así, se puede monitorear el desarrollo posnatal. Finalmente, si se generan animales viables a término completo.Se considera que la línea de IPSC tiene pluripotencia completa. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos de generación de IPSC es que nuestro método genera de forma reproducible líneas celulares de IPS con pluripotencia completa. Las líneas celulares de IPS generadas mediante estos métodos pueden ser útiles para otros investigadores que deseen comparar la pluripotencia de sus células IPS o establecer la equivalencia de otros métodos de reprogramación. Estos métodos serán útiles para investigadores que deseen generar líneas celulares de IPS con pluripotencia completa para aplicaciones específicas posteriores, como ensayos de diferenciación in vitro.Además, la generación de todos los ratones IPSC. El uso de la complementación telomérica puede servir como un medio útil para determinar la estabilidad genética y epigenética de diversas líneas celulares. Las micromanipulaciones implicadas en la complementación de embriones tetraploides son técnicamente desafiantes.Puede llevar varios meses que alguien se vuelva competente en las técnicas. La IPSC desarrollada mediante esta técnica requiere condiciones de cultivo similares a las utilizadas en experimentos tradicionales de direccionamiento génico en ESL. 24 horas después de la transfección de células HEC 2 9 3 T con lentivirus, retire el medio de crecimiento y sustitúyalo con 25 mililitros de medio fresco precalentado.Devuelva el medio a la incubadora durante 24 horas. Cuarenta y ocho horas después de la transfección de las células HEC 293T con lentivirus, recolecte el medio de crecimiento que contiene partículas lentivirales de las células transfectadas. Elimine los restos particulados del medio que contiene el virus mediante centrifugación a 3000 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. A continuación, concentre el virus mediante ultracentrifugación a través de un cojín de sacarosa al 20 % durante dos horas a 112.000 G a cuatro grados Celsius.Vierta cuidadosamente el sobrenadante en un recipiente de desecho para descontaminación sin perturbar el pellet vírico. Resuspenda el pellet vírico en 0,4 mililitros de medio para fibroblastos embrionarios de ratón y cierre herméticamente el tubo. Luego, agítelo suavemente a cuatro grados Celsius durante 15 a 30 minutos.Almacene partículas virales y alícuotas de un solo uso a menos 80 grados Celsius. Las líneas de IPSC se derivan de fibroblastos embrionarios de ratón o células meth. Una vez que las colonias de IPSC presentan un borde bien definido brillante y refringente y contienen entre 30 y 50 células, están listas para ser seleccionadas manualmente y ampliadas como líneas independientes de IPSC.Seleccione colonias individuales con una punta de pipeta para carga de geles y transfiera cada colonia directamente a un pocillo individual de una placa de 96 pocillos con fondo en U que contenga 20 microlitros de tripsina-EDTA al 0,25 %. Incube las colonias seleccionadas con la tripsina durante aproximadamente ocho minutos a 37 grados Celsius o hasta que las colonias se disocien en células individuales. Monitoree el progreso de la disociación mediante microscopía de luz. Puede ser necesario agitar suavemente.Transfiera la suspensión celular disociada a una placa de 96 pocillos que contenga una capa alimentadora y 150 microlitros de medio para ESC suplementado con doxiciclina y VPA. Cuando reaparezcan las colonias de iPSC en cada pocillo, páselas a pocillos más grandes para análisis y almacenamiento celular siguiendo los procedimientos estándar de derivación de ESC y cultivo celular para iniciar el procedimiento de generación de embrión tetraploide auxiliar. Los embriones de una célula recolectados de ratones hembra se cultivan durante la noche hasta el estadio de dos células en KSOM a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono, al día siguiente. Coloque un microportaobjeto BTX en una placa de Petri de 10 centímetros.Vierta suficiente medio de electrofusión a temperatura ambiente para sumergir completamente la laminilla en la solución, pero no en exceso como para que los polos del electrodo queden completamente sumergidos. Encienda el manipulador de células eléctricas BTX ECM 2001 y el potenciador BTX 400. Conecte los cables del ECM al electrodo de la micro laminilla y fije los cables al costado de la placa de Petri para evitar movimientos no deseados de la laminilla.Realice un pulso manual para obtener una lectura en el potenciador BTX y anote el voltaje de las corrientes de CC que se aplican. La corriente de CA controlará la velocidad con la que los embriones se alinean entre los electrodos. La corriente de CC fusionará los blasfemos y el tiempo de pulso determinará la duración del pulso de CC.Un buen punto de partida es CA tres voltios CC 100 voltios y 0,05 milisegundos. La CC óptima varía en el rango de 90 a 150 voltios. Utilizando una pipeta de boca.Tome embriones de 30 a 42 células del cultivo KSOM y transfiéralos a una gota de fusión electroeléctrica. Lave mediante varias gotas de medio de fusión electroeléct游戏副本. A continuación, aspire medio de fusión electroeléctrica fresco desde la placa microscópica hacia la pipeta de boca.Tome los embriones lavados y colóquelos en el espacio de un milímetro entre los electrodos sobre la microplaca. Tenga cuidado de que los embriones estén alineados en el centro del espacio y no estén en contacto entre sí. Aplique corriente alterna presionando el botón de inicio manual.Los embriones girarán en el campo de corriente alterna hasta que el plano de contacto de la blástula quede paralelo a los electrodos. Si los embriones no se alinean en unos pocos segundos, aumente la configuración de corriente alterna. Una vez que los embriones se hayan alineado, presione nuevamente el botón de inicio manual para aplicar el pulso de corriente continua con el medio de electrofusión en la pipeta.Recolecte los embriones del portaobjetos de microdeslizamiento, lávelos pasándolos por varias gotas de medio KSOM y luego cultive los embriones en KSOM bajo aceite mineral a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. La fusión del embrión debe completarse en menos de 30 minutos. Durante el cultivo, supervise y seleccione los embriones con blastómeros fusionados con éxito.Los embriones fusionados parecerán estar en la etapa de una sola célula; deseche los embriones lisados y los de dos células después de 30 minutos en cultivo. Continúe el cultivo de los embriones fusionados en microgotas de KSOM bajo aceite mineral a 37 grados Celsius, con 5 % de dióxido de carbono. Para preparar las IPC para la inyección en blastocisto, descongele previamente las IPC almacenadas y siembre las células sobre alimentadoras en medio para células madre embrionarias (ESC). Pase las células al menos una vez sobre alimentadoras después del descongelamiento, antes de su uso para inyección.Un pocillo de una placa de seis pocillos que contenga IPC con una confluencia del 70 al 80 % proporcionará un número más que suficiente de células para la inyección. Aspire el medio de crecimiento y lave las células con tres mililitros de PBS sin calcio ni magnesio. Añada 0,5 mililitros de tripsina-EDTA al 0,05 % precalentada a las células e incube a 37 grados Celsius durante 10 minutos con agitación ocasional. Añada 3,0 mililitros de medio ESC e itere el proceso para obtener una suspensión de células individuales. Observe las células mediante microscopía de luz para asegurar una suspensión de células individuales, ya que colonias o agregados celulares obstruirán la pipeta de inyección. Una vez obtenida la suspensión de células individuales, añada un mililitro de medio ESC al pocillo y devuelva la placa al incubador a 37 grados Celsius.Incubar durante aproximadamente 15 minutos o hasta que la mayoría de las células alimentadoras hayan comenzado a adherirse; luego, retirar suavemente el medio que contiene las CIP. Tener cuidado de no desalojar las células alimentadoras adheridas semanalmente. Colocar las CIP en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de medio para CEE y centrifugar a 200 G durante cinco minutos.Aspire el sobrenadante y retire el resto del medio de ESC con una pipeta micrométrica. Agite suavemente el tubo para despegar el sedimento y resuspenda cuidadosamente las células en 0,2 a 0,5 mililitros de medio FHM previamente enfriado. Mantenga las células en hielo hasta el momento de la inyección y durante esta, en blastocitos tetraplóides. Para el protocolo de inyección en blastocitos, consulte el manuscrito que acompaña este artículo y un artículo previamente publicado en strove, del cual se muestra un extracto en pantalla aquí.En estas imágenes se muestran ejemplos de la progresión morfológica desde fibroblastos hasta colonias de IPSC durante el transcurso de un experimento de reprogramación. Se debe observar heterogeneidad morfológica y formación de colonias de IPSC parcialmente reprogramadas a partir de cuatro a cinco días después de la adición de doxiciclina y VPA, como se muestra en los paneles B a EESC. Colonias similares a colonias de IPSC deberían aparecer entre siete y 10 días, como se muestra en el panel F. La producción de embriones de un solo núcleo por fusión electroquímica de embriones diploides de dos células es altamente eficiente.Es habitual observar que hasta el 95 % de los embriones de dos células tratados se fusionan con éxito para producir embriones tetraploides de una sola célula. El protocolo utilizado en este experimento para inyectar IPSC en blastocistos tetraploides es similar al protocolo para la inyección de ESES en blastocistos diploides con el fin de generar ratones quiméricos; para descartar fácilmente la generación de quimeras diploides, se eligen cuidadosamente las cepas de ratón utilizadas para generar las IPSC y los embriones tetraploides según sea posible. En este ejemplo, los embriones tetraploides se producen a partir de una cepa albina y las IPSC se generan a partir de una cepa pigmentada.Por lo tanto, los ratones IPSC recién nacidos presentan ojos pigmentados y un color de pelaje uniformemente pigmentado en la edad adulta, mientras que los diploides kyras mostrarían una coloración mixta albina y pigmentada. La cantidad de crías nacidas con vida depende de la línea celular, como se muestra en esta tabla. Para una línea IPSC promedio de buena calidad, los investigadores deben esperar que entre el 1% y el 10% de las blastocistos inyectados produzcan crías recién nacidas viables.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo derivar células IPS totalmente pluripotentes y también de cómo validar su potencial de desarrollo. Utilizando el ensayo de complementación tetraploide, una vez dominada esta técnica desde la derivación de MES hasta ratones recién nacidos a partir de IPSC, el proceso puede completarse en dos o tres meses. El desarrollo y mantenimiento de las IPSC requiere un alto nivel de técnica en cultivo celular.La experiencia previa con la cultura ESL es esencial. No olvide que trabajar con lentivirus, especialmente lentivirus concentrado, puede ser extremadamente peligroso. Siempre debe usar el equipo de protección personal requerido por su institución y asegurarse de tratar todo lo que haya tenido contacto con el virus con lejía al 10 % durante al menos 20 minutos siguiendo este procedimiento.Todos los ratones IPSC y sus tejidos pueden analizarse para fenotipos fisiológicos, patológicos y conductuales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra el procedimiento para generar células madre pluripotentes inducidas mediante lentivirus inducible que expresan Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4.

La generación de células iPS a partir de MEFs través de la expresión forzada de Sox-2, Oct-4, c-Myc y Klf4

El Inducible Stemgent Dox ratón TF Set Lentivirus puede reprogramar fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) de células madre pluripotentes inducidas (iPS) a las células. Aquí se demuestra el protocolo para la expresión de DOX-inducible de los factores de la transcripción del ratón reprogramación Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc para generar iPS colonias que expresan marcadores comunes MES pluripotencia.

Generación de células madre pluripotentes inducidas por reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con un factor de transcripción Cuatro, doxiciclina inducible sistema de transducción de lentivirales

El siguiente protocolo proporciona instrucciones para la adaptación humana células madre pluripotentes inducidas (iPS) celdas para alimentación libre de la cultura a través del alimentador de Libre completa golpe de gracia suero sustitución medio (KSR-FF). Una vez adaptado, instrucciones para el mantenimiento continuo también se proporcionan.

Alimentador de Libre adaptación, Cultura y pases de células iPS humanas con alimentador de Libre Completa golpe de gracia suero sustitución Media

Este protocolo describe el procedimiento detallado para criopreservar las células iPS humanas en el medio de criopreservación golpe de gracia SR y la recuperación de estas células en el golpe de gracia completa alimentador gratis SR (KSR-FF) a medio o en el alimentador medio basado golpe de gracia SR.

Criopreservación y recuperación de células iPS humanas con anulación completa del alimentador de sustitución sin suero medio

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) representan una fuente de tejidos específicos del paciente para aplicaciones clínicas y de investigación básica. A continuación, presentamos un protocolo detallado para reprogramar células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) obtenidos a partir de buffy abrigos congelados en CMPI-virales gratis utilizando no integración de plásmidos episomales.

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de Frozen Buffy Coats utilizando para no integrar episomal plásmidos

Este protocolo describe cómo generar células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) a partir de células T periféricas humanas en condiciones libres de alimentadores utilizando una combinación de vectores de virus Matrigel y Sendai que contienen factores de reprogramación.

Generación de pluripotentes inducidas células madre a partir de células T periféricas Humanos Uso de Sendai virus en Condiciones-Feeder gratuita

En este estudio, generamos células madre pluripotentes inducidas a partir de células de líquido amniótico de ratón, utilizando un sistema de transposones no viral.

La producción de células madre pluripotentes a partir de células de ratón amniótico líquido mediante un sistema de transposón

Este artículo describe un protocolo y eficiente derivar líneas de células madre pluripotentes de embriones de ratón de la cultura en la etapa de blastocisto.

Derivación de líneas de células madre de embriones de preimplantación de ratón

Aquí presentamos un protocolo para desarrollar modelos de ratón modificados genéticamente utilizando células madre embrionarias, especialmente para ADN grande knock-in (KI). Este protocolo se ajusta utilizando la edición del genoma CRISPR / Cas9, lo que resulta en una eficiencia de KI significativamente mejorada en comparación con el método convencional de orientación de ADN linealizado mediado por recombinación homóloga.

Focalización génica altamente eficiente mediada por CRISPR/Cas9 en células madre embrionarias para desarrollar modelos de ratón manipulados genéticamente

El presente protocolo describe un método para aislar, expandir y reprogramar células derivadas de orina de primates humanos y no humanos a células madre pluripotentes inducidas (iPSC), así como instrucciones para el mantenimiento sin alimentador de las iPSC recién generadas.

Generación y mantenimiento de células madre pluripotentes inducidas por primates derivadas de la orina

Aprenda a generar ratones adultos a partir de células madre pluripotentes inducidas mediante complementación de embriones tetraploides. Este protocolo valida la pluripotencia completa de líneas iPSC para investigación en biología del desarrollo.

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

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