Colección Protocolo de páncreas humano

El objetivo general de este procedimiento es diseccionar el páncreas humano de una manera que mantenga la orientación anatómica. Esto se logra mediante la extirpación del duodeno y el bazo del páncreas, y luego se elimina el exceso de grasa y los vasos del páncreas. El segundo paso es pintar la superficie anterior con tinta azul y la superficie posterior con tinta negra.

A continuación, el páncreas se divide en tres regiones. A continuación, cada región se corta transversalmente en bloques uniformes y se coloca en casetes de parafina, moldes OCT o se pica aún más y se coloca en viales. En última instancia, se recogen muestras de las tres regiones del páncreas, mientras se mantiene la orientación anatómica correcta para futuros análisis.

Este método puede ayudar a abordar preguntas clave en la investigación de la diabetes tipo uno, como los mecanismos subyacentes a la pérdida de masa o función de las células beta y la naturaleza del ataque de las células inmunitarias. La demostración visual del método de procesamiento del páncreas es fundamental, ya que mantener la orientación in vivo del páncreas requiere atención a los detalles. La demostración del procedimiento estará a cargo de Linda Snyder, tecnóloga de histo, y Emily Montgomery, científica biológica de mi laboratorio.

Comience por preparar todos los materiales necesarios para el procedimiento. Primero, etiquete los casetes que contendrán los bloques de parafina con un identificador de donante, tipo de muestra, número de alícuota y cualquier información adicional. A continuación, etiquete los moldes OCT de la misma manera.

Corte suficientes trozos de papel de aluminio para envolver cada bloque OCT y déjelos a un lado para usarlos más tarde. Prepare todos los viales necesarios para almacenar las muestras frescas y congeladas. Agregue ARN más tarde y medios RPMI cuando corresponda.

A continuación, prepare las áreas de trabajo, coloque las tablas de disección, los instrumentos esterilizados y todos los demás suministros necesarios para el procedimiento tanto en una campana de bioseguridad como en una encimera. Tenga todos los casetes y moldes OCT dispuestos en orden de uso. Cerca. Crea un baño de congelación agregando suficiente pentano isop para cubrir el hielo seco en el fondo de una caja de espuma de poliestireno.

Para comenzar la disección, extirpe el duodeno y el bazo. Comience a separar el duodeno y el páncreas en un extremo y continúe hasta que se desprendan por completo. El bazo está suelto y se extrae fácilmente de la grasa y el páncreas.

A continuación, limpie el páncreas de los vasos grasos extraños y los nervios mediante una combinación de disección roma y afilada. Deje a un lado la grasa y los ganglios linfáticos para procesarlos más tarde. Una vez limpio, coloque el páncreas en una tabla de disección cubierta con toallas de papel.

Mantener la orientación correcta del páncreas es el aspecto más difícil de este procedimiento. Para garantizar el éxito, las superficies anterior y posterior se pintan con tintas de diferentes colores. Sumerja un aplicador con punta de algodón en tinta azul, extienda la tinta en la superficie anterior del páncreas y seque el exceso.

A continuación, sumerja un nuevo aplicador en tinta negra y extiéndalo sobre la superficie posterior del páncreas. Vuelva a colocar el páncreas en su orientación normal. Con la superficie anterior hacia arriba, el páncreas ahora está listo para ser cortado en tres secciones.

Primero, corta la unión entre la cabeza y el cuerpo. A continuación, divida la porción restante en porciones aproximadamente iguales para separar el cuerpo y la cola, registre el peso de cada región del páncreas. Empezando por la sección de la cabeza.

Divida cada región en secciones de aproximadamente 0,5 centímetros cortando de manera transversal, similar a cortar una barra de pan. Una vez que se haya cortado cada región del páncreas, retire la última sección de la región de la cabeza, que es la sección de unión del cuerpo de la cabeza, y colóquela en una tabla de disección separada. Pica esta sección en trozos pequeños y divídelos uniformemente entre los viales criogénicos marcados con y sin ARN.

Posteriormente, los viales se congelan. Seguir los procedimientos estándar. Repita este procedimiento para la sección de unión de la cola del cuerpo.

Una vez que se hayan recogido las muestras picadas, incline todas las secciones transversales hacia la derecha. Se eliminarán las secciones alternas de cada región. En el caso de los bloques de parafina y OCT, elimine la primera sección para el bloqueo de parafina.

Si una sección es demasiado grande, córtala por la mitad. Etiquete los casetes como A y B. Si la pieza aún es demasiado grande, corte cada sección perpendicular al corte anterior y luego etiquete los casetes de la A a la D en el sentido de las agujas del reloj. Como se ve aquí, coloque el casete de modo que la etiqueta quede a la izquierda.

A continuación, coloque el pañuelo en el casete y cierre la tapa. Transfiera el casete a un recipiente que contenga formina tamponada neutra. Numere el bloque secuencialmente dentro de cada región, comenzando con la sección más medial para los bloques OCT.

Vierta una capa delgada de medios OCT en un molde preetiquetado Antes de introducir el tejido, cubra el tejido con medios OCT y congele rápidamente la muestra para su uso posterior, volviendo al tejido que se reservó anteriormente. Aísla los ganglios linfáticos pancreáticos recortando la grasa y el tejido conectivo que rodea la cápsula ganglionar. Coloque los nudos en un plato estéril que contenga DMEF, pique los nudos grandes en trozos de no más de 0,5 centímetros.

Una vez aislados los ganglios linfáticos pancreáticos, divida el tejido entre los viales y casetes preparados para su posterior procesamiento. Después de terminar los ganglios linfáticos, el bazo se pica y se almacena de manera similar. Para procesar el duodeno, use una gasa humedecida para limpiar la mucosa de mucosidad, corte la mucosa y luego córtela en secciones.

Divida las muestras de mucosa como se muestra anteriormente. Con este procedimiento, se recogen muestras representativas de cada región del páncreas, como se ve aquí. Los pesos de la cabeza, el cuerpo y la región de la cola eran aproximadamente iguales.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo procesar un páncreas humano en diferentes tipos de muestras, específicamente la capacidad de mantener la orientación, así como la forma de aislar los ganglios linfáticos de la grasa peripancreática.