Mapeo bacterianas redes funcionales y vías en

El objetivo de este procedimiento es investigar las relaciones funcionales entre genes y vías bacterianas. Esto se logra primero preparando matrices de ceia coli, cepas mutantes simples que serán conjugadas o apareadas. El segundo paso consiste en conjugar los mutantes simples en un formato de matriz sobre placas.

A continuación, se seleccionan los mutantes dobles. El paso final consiste en obtener imágenes de las placas con mutantes dobles y cuantificar las colonias de mutantes dobles para determinar la aptitud del cepa. Finalmente, se analizan los datos del tamaño de las colonias para calcular las puntuaciones de interacción genética e identificar genes, vías y procesos funcionalmente interactivos.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la mutagénesis aleatoria es que se pueden crear muchas cepas dobles mutantes individuales. Además, se pueden evaluar simultáneamente las interacciones entre muchos genes, independientemente del tamaño del gen, su esencialidad o la aptitud del mutante de gen único. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de sistemas, como aquellas relacionadas con las funciones génicas y la comunicación funcional entre vías y procesos.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de infecciones bacterianas, ya que el conocimiento sobre los genes y procesos funcionalmente más centrales, así como la comprensión de qué combinaciones de genes, vías y procesos bacterianos, cuando se alteran, mejoran o reducen la aptitud bacteriana, ayudará a desarrollar estrategias de intervención más efectivas. Para comenzar este protocolo, se emplea una amplificación por PCR anidada en dos pasos para reemplazar el marco de lectura abierto diana con un marcador de resistencia a cloranfenicol del plásmido PKD tres, tal como se describe en el procedimiento escrito.

Confirme el producto esperado y purifique por PCR el fragmento obtenido siguiendo el protocolo del fabricante. Después de eluir el producto de PCR en 30 microlitros de agua destilada estéril, dilúyalo a una concentración aproximada de 50 miligramos por microlitro. El producto purificado se almacena a menos 20 grados Celsius antes de la transformación.

A continuación, prepare células competentes de alta frecuencia de recombinación o HFR Caval para la construcción del donador. Inocule primero un mililitro de un cultivo sobrenadante nocturno saturado de la cepa HFR Cavalli en 70 mililitros de medio LB fresco con 35 microlitros de ampicilina al 50 miligramos por mililitro en un matraz de 250 mililitros.

Incube el cultivo a 32 grados Celsius agitando suavemente a 220 RPM hasta obtener una densidad óptica de aproximadamente 0,5 a 0,6. Luego, transfiera el cultivo a un baño de agua para la inducción térmica del sistema de recombinación Lambda Red a 42 grados Celsius durante 15 minutos con agitación a 160 RPM para detener la inducción. Transfiera el cultivo a un baño de agua con hielo triturado durante 10 a 20 minutos a 160 RPM.

Asegúrese de mantener las células frías hasta después de la transformación. Después de lavar y recolectar las células por centrifugación según se describe en el protocolo escrito, deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 500 microlitros de Eloqua con glicerol al 10% helado. Distribuya las células en volúmenes de 50 microlitros en tubos microcentrífuga de 1,5 mililitros individualmente preenfriados y proceda inmediatamente a la transformación.

Añada 100 nanogramos del cassette de eliminación génica purificado a las células competentes. Agite suavemente el tubo y deje que la suspensión repose en hielo durante cinco minutos. A continuación, transfiera la suspensión a un vial de electroforesis previamente enfriado y realice la electrotransformación inmediatamente.

Añada un mililitro de medio SOC a temperatura ambiente y transfiera las células electroporadas en el medio a un tubo de cultivo de 15 mililitros. Incube las células a 32 grados Celsius durante una hora con agitación orbital a 220 RPM. Tras la incubación, centrifugue las células a 4 400 ×g durante cinco minutos.

A temperatura ambiente, retire aproximadamente 850 microlitros del sobrenadante y resuspenda el botón celular en el líquido restante. Distribuya las células en placas de LB que contengan 17 microgramos por mililitro de cloranfenicol e incube a 32 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, realice estrías de dos transformantes individuales en placas de LB con cloranfenicol para confirmar el mutante, y realice estrías de los mismos transformantes en placas de LB con canamicina para confirmar que las cepas no son resistentes a la canamicina.

A continuación, el ADN se amplifica con tres conjuntos diferentes de cebadores de confirmación de eliminación génica tal como se describe en el protocolo escrito. El primer conjunto consta de un cebador directo aislante de 20 nucleótidos ubicado a 200 pares de bases aguas arriba de la región diana y un cebador inverso que es complementario al casete de resistencia a la cloranfenicol. Se espera que esta amplificación produzca un amplicón de 445 nucleótidos.

El segundo conjunto incluye un cebador directo, un cebador orientado hacia la secuencia del casete de resistencia a cloranfenicol, y un cebador de confirmación inverso, que está diseñado para unirse a 200 pares de bases aguas abajo del extremo tres prime del gen eliminado. Se espera que esta reacción de amplificación produzca un amplicón de 309 nucleótidos. La tercera PCR contiene ambos cebadores flanqueantes, aguas arriba y aguas abajo.

Esta reacción es necesaria para confirmar que la cepa seleccionada no es un diploide medular en el que un locus génico haya sido reemplazado por el casete y otro copiado en duplicado, pero con una copia del gen de tipo silvestre aún presente. Se espera que esta amplificación produzca un producto de 1,4 KB. La colección de mutantes con deleción individual de genes no esenciales de e coli ke io se replica mediante pinzas robóticas a 24 384.

Bien, microplaca que contiene 80 microlitros de medio LB líquido por pocillo. Suplementado con 50 microgramos por mililitro de canamicina para alojar la cepa de control de borde, que carece de esta, como control positivo y para ayudar en la normalización de la placa, así como en la cuantificación automatizada de colonias. Retire el medio inoculado de los pocillos más externos de cada placa y transfiéralo a nuevas placas, dejando los pocillos más externos vacíos.

Asimismo, cree puntos de control negativo eliminando dos cepas cualesquiera de una ubicación diferente dentro de cada placa y transfiriendo las cepas a una nueva placa. A continuación, llene los pozos vacíos, incluidos los pozos de control de borde y los pozos de control negativo, con medio LV que contenga 17 microgramos por mililitro de cloranfenicol. Se espera que estos puntos de control negativo estén vacíos en el receptor y, por lo tanto, en las placas de doble mutante.

Sirven para asegurar que no hubo errores de procesamiento o manipulación de las placas al numerar las imágenes o al colocar las placas. Después de preparar la cepa positiva de borde según se describe en el procedimiento escrito, las cepas del arreglo, así como la cepa positiva de borde, se cultivan durante la noche a 32 grados Celsius con agitación orbital de 190 RPM; al día siguiente, llenar los pozos del borde con aproximadamente 80 microlitros de la cultura nocturna. Las placas ensambladas pueden utilizarse para el apareamiento según se describe en la siguiente sección.

Alternativamente, para almacenamiento a largo plazo, cada pocillo en las placas receptoras se suplementa con glicerol al 15 % y se mezclan el medio y el glicerol. Luego, las placas se almacenan a menos 80 grados Celsius. Inicie el procedimiento de apareamiento cultivando la cepa donadora HFR, que porta la deleción del gen de interés marcada con un casete de resistencia a cloranfenicol, durante la noche a 32 grados Celsius en medio líquido LB rico con 17 microgramos por mililitro de cloranfenicol.

El TH ordenó la colección de mutantes receptores en una densidad de 3 84 colonias sobre placas sólidas de LB, suplementadas con 50 microgramos por mililitro de canamicina. En paralelo, pinchar el mutante donante de consulta en una densidad de 3 84 colonias sobre el mismo número de placas de LB.

Suplementado con 17 microgramos por mililitro de cloranfenicol. Incubar las placas durante la noche a 32 grados Celsius para conjugar las cepas. Inocular el donador de las placas donadoras de 84 colonias durante la noche sobre placas de LB sólido.

Luego, clave las cepas de una sola placa receptora de 84 colonias incubada durante la noche sobre los donadores recién clavados. Incube las placas de conjugación clavadas a 32 grados Celsius durante 16 a 24 horas. A continuación, clave cada placa de conjugación de densidad 384 en una sola placa sólida de LB que contenga cloranfenicol.

¿Y puede miicina repetir este proceso hasta que se hayan pinado todas las placas de conjugación? Incubar las placas de primera selección recién pinadas durante 16 a 36 horas a 32 grados Celsius. Tras la incubación, volver a pinar cada placa de primera selección en una segunda placa de selección doble con fármacos en formato SPOT 1536, de modo que cada colonia de primera selección esté representada por cuatro colonias.

En la segunda placa de selección, incubar las placas durante 16 a 36 horas. A 32 grados, fotografiar las placas finales de selección de doble mutante para medir cuantitativamente la aptitud de crecimiento de los mutantes y analizar las interacciones entre pares de genes. Dado que los genes pertenecientes a la misma vía presentan patrones de IG estrechamente correlacionados, los genes funcionalmente relacionados pueden agruparse mediante agrupamiento según la similitud general de sus perfiles de puntuación S.

La similitud del perfil de interacciones genéticas representa la congruencia de los fenotipos tras la mutación de dos genes y debería indicar si ambos genes actúan en la misma vía o en vías que se solapan. Aquí se muestra la distribución de los coeficientes de correlación entre los perfiles de interacciones genéticas de pares de genes que codifican proteínas que interactúan físicamente frente a pares de genes seleccionados aleatoriamente. Se presenta como ejemplo un diagrama de dispersión de perfiles genéticos correlacionados para dos transportadores que forman un complejo heterotrimérico necesario para la excreción de espermatozoides, tal como se observa con el gen ecoline de levadura.

Las interacciones que alivian los perfiles de interacción genética (GI) altamente correlacionados tienden a codificar vías que están físicamente asociadas o que actúan de manera coordinada en una misma vía bioquímica común. Aquí se muestra un ejemplo representativo en el que los componentes de las vías funcionalmente redundantes de biosíntesis de hierro-azufre ISC y SUF, que participan conjuntamente en un proceso esencial, forman grupos distintos que están conectados entre sí mediante extensas interacciones agravantes. Se puede utilizar una medida estadística para detectar cualquier enriquecimiento significativo de interacciones entre combinaciones específicas de vías, integrando redes de interacciones genéticas con interacciones físicas y otros datos de asociación funcional, como el contexto genómico.

Las relaciones pueden revelar la organización de módulos funcionales de orden superior que definen sistemas biológicos fundamentales en bacterias. El análisis de agrupamiento también puede aplicarse a redes de interacciones genéticas para predecir las funciones de genes anotados. Dado que los algoritmos de agrupamiento varían.

Sin embargo, las asignaciones funcionales putativas determinadas mediante agrupamiento requieren verificación experimental independiente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar incluir todos los controles positivos y negativos necesarios siguiendo este protocolo. Otros métodos como proteómica, experimentos bioquímicos de seguimiento y genómica química pueden realizarse para responder preguntas adicionales sobre funciones génicas específicas, así como sobre la naturaleza de las relaciones funcionales entre genes y vías metabólicas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir cepas dobles mutantes, ensamblar matrices de receptores y realizar análisis ESGA para investigar las relaciones funcionales entre genes y procesos en e coli.