Mapeo bacterianas redes funcionales y vías en Escherichia Coli Utilizando matrices sintéticas genéticos

El objetivo de este procedimiento es investigar las relaciones funcionales entre los genes y las vías bacterianas. Esto se logra preparando primero una matriz de ceia coli, cepas mutantes individuales que se conjugarán o aparearán. El segundo paso es conjugar los mutantes individuales en un formato de matriz en placas.

A continuación, se seleccionan los mutantes dobles. El paso final es obtener imágenes de las placas dobles mutantes y cuantificar las colonias dobles mutantes para determinar la aptitud de la cepa. En última instancia, los datos del tamaño de la colonia se analizan para calcular las puntuaciones de interacción genética e identificar genes, vías y procesos que interactúan funcionalmente.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la mutagénesis aleatoria, es que se pueden crear muchas cepas dobles mutantes individuales. Además, las interacciones entre muchos genes pueden evaluarse simultáneamente independientemente del tamaño del gen, la esencialidad o la aptitud mutante de un solo gen. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de sistemas, como las relacionadas con las funciones de los genes y la diafonía funcional entre vías y procesos.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de las infecciones bacterianas porque el conocimiento sobre la mayoría de los genes y procesos funcionalmente centrales, así como la comprensión de qué combinaciones de genes, vías y procesos bacterianos cuando se alteran mejoran o reducen la aptitud bacteriana ayudará a desarrollar las estrategias de intervención más efectivas para comenzar este protocolo. Dos pasos anidados. La amplificación por PCR se emplea para reemplazar el marco de lectura abierto objetivo con un marcador de resistencia al cloranfenicol del plásmido PKD tres, como se describe en el procedimiento escrito.

Confirmar el producto esperado y purificar por PCR el fragmento obtenido siguiendo el protocolo del fabricante. Después de eluir el producto de PCR en 30 microlitros de agua destilada estéril, diluir a aproximadamente 50 miligramos por concentración de microlitro. El producto purificado se almacena a menos 20 grados centígrados antes de la transformación.

A continuación, prepare las células competentes de alta frecuencia de recombinación o HFR Caval para la construcción de donantes. En primer lugar, inocule un mililitro de un cultivo saturado durante la noche de la cepa HFR Cavalli en 70 mililitros de medio LB fresco con 35 microlitros de 50 miligramos por mililitro. Ampicilina en un matraz de 250 mililitros.

Incubar el cultivo a 32 grados centígrados agitando suavemente a 220 RPM hasta obtener una densidad óptica de aproximadamente 0,5 a 0,6. Luego transfiera el cultivo a un baño de agua para la inducción de calor del sistema de recombinación Lambda Red a 42 grados Celsius durante 15 minutos con agitación a 160 RPM para detener la inducción. Transfiera el cultivo a un baño de agua con suspensión de hielo frío durante 10 a 20 minutos a 160 RPM.

Asegúrese de mantener las células frías hasta después de la transformación. Después de lavar y recolectar las células por centrifugación como se describe en el protocolo escrito, decantar el sen y resuspender el pellet en 500 microlitros de Eloqua de glicerol al 10% congelado. Las celdas en volúmenes de 50 microlitros en micro tubos centri individuales preenfriados de 1,5 mililitros y proceden inmediatamente a la transformación.

Agregue 100 nanogramos de deleción de genes purificados, casete a las células competentes. Mueve el tubo y deja que la suspensión se asiente sobre el hielo durante cinco minutos. A continuación, transfiera la suspensión a un electro vete electro de electroporación preenfriado, opere la mezcla de celdas inmediatamente.

Agregue un mililitro de medio SOC a temperatura ambiente y transfiera las células electroporadas en medio a un tubo de cultivo de 15 mililitros. Incubar las células a 32 grados centígrados durante una hora con agitación orbital a 220 RPM. Después de la incubación, centrifugar las células de 4.400 veces G durante cinco minutos.

A temperatura ambiente, retire aproximadamente 850 microlitros del supinato y vuelva a suspender el pellet de celda en el líquido restante. Extienda las células en placas LB que contengan 17 microgramos por mililitro, cloranfenicol e incube a 32 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, raye dos transformantes individuales en placas de cloranfenicol LB para la confirmación de mutantes, raye los mismos transformantes en placas de micina de lata LB para confirmar que las cepas no son resistentes a la micina.

A continuación, el ADN se amplifica con tres conjuntos diferentes de cebadores de confirmación de knockout, tal y como se describe en el protocolo escrito. El primer juego de cebadores consta de un cebador delantero de 20 nucleótidos ubicado a 200 pares de bases aguas arriba de la región objetivo, y un cebador inverso, que es complementario al casete de resistencia al cloranfenicol. Se espera que esta amplificación produzca un amplicón de 445 nucleótidos.

El segundo conjunto incluye un cebador directo, un arrodillamiento ante la secuencia de casete de resistencia al cloranfenicol y un cebador de confirmación de flanco inverso, que está diseñado para anar 200 pares de bases aguas abajo de los tres extremos primos del gen eliminado. Se espera que esta reacción de amplificación produzca un amplicón de 309 nucleótidos. El tercer PCR contiene cebadores de flanqueo aguas arriba y aguas abajo.

Esta reacción es necesaria para confirmar que la cepa seleccionada no es un diploide de médula ósea con un locus genético que ha sido reemplazado por el casete y otra copia duplicada, pero por lo demás de tipo salvaje, todavía presente. Se espera que esta amplificación produzca un producto de 1,4 KB. La colección de mutantes de deleción de genes no esenciales únicos de e coli ke io se replica robóticamente a 24 384.

Pues bien, microplaca que contiene 80 microlitros de medio LB líquido por pocillo. Suplementado con 50 microgramos por mililitro puede micina para hacer espacio para la cepa de control fronterizo, que faltaba como control positivo y ayuda en la normalización de placas, así como en la cuantificación automatizada de colonias. Retire los medios inoculados de los pocillos más externos de cada placa y transfiéralos a nuevas placas, dejando vacíos los pocillos más externos.

Del mismo modo, cree puntos de control negativos eliminando dos cepas cualesquiera de una ubicación diferente dentro de cada placa y transfiriendo las cepas a una nueva placa. A continuación, llene los pozos vacíos, incluidos los pozos de control fronterizos y los pozos de control negativos, con medios de baja tensión que contengan 17 microgramos por mililitro de cloranfenicol. Se espera que estos puntos de control negativos estén vacíos en el receptor y, por lo tanto, placas dobles mutantes.

Sirven para garantizar que no haya errores de procesamiento o manipulación de placas al numerar, crear imágenes o fijar las placas. Después de preparar la cepa positiva del borde como se describe en el procedimiento escrito, las cepas del conjunto, así como la cepa positiva del borde se cultivan durante la noche a 32 grados Celsius con un temblor orbital de 190 RPM al día siguiente, llene los pocillos del borde con aproximadamente 80 microlitros del cultivo durante la noche. Las placas ensambladas se pueden usar para acoplarse como se describe en la siguiente sección.

Alternativamente, para el almacenamiento a largo plazo, cada pocillo en las placas receptoras se complementa con un 15% de glicerol y el medio y el glicerol se mezclan. A continuación, las placas se almacenan a menos 80 grados centígrados. Comience el procedimiento de apareamiento cultivando la cepa donante HFR, con la deleción del gen de consulta marcada con un casete de resistencia al cloranfenicol durante la noche a 32 grados Celsius en un medio líquido rico en LB con 17 microgramos por mililitro de pin de cloranfenicol.

El TH ordenó la recolección de mutantes receptores en 3 84 colonias de densidad en placas LB sólidas. Suplementado con 50 microgramos por mililitro de micina en lata. En paralelo, fije la cepa mutante de consulta donante en 3 84 de densidad de colonias en el mismo número de placas LB.

Suplementado con 17 microgramos por mililitro de cloranfenicol. Incubar las placas durante la noche a 32 grados centígrados para conjugar las cepas. Fije el donante de las placas de donantes nocturnos de 3 84 colonias en placas LB sólidas.

A continuación, fije las cepas de una sola placa receptora de 3 84 colonias durante la noche sobre los donantes recién clavados. Incubar las placas de conjugación fijadas a 32 grados centígrados durante 16 a 24 horas. A continuación, fije cada placa de conjugación de densidad 384 en una sola placa LB sólida que contenga cloranfenicol.

¿Y puede la micina repetir este proceso hasta que todas las placas de conjugación hayan sido fijadas? Incubar las placas de primera selección recién fijadas durante 16 a 36 horas a 32 grados centígrados. Después de la incubación, vuelva a fijar cada primera placa de selección en una segunda placa de selección de fármaco doble en formato 1536 SPOT para que cada primera colonia de selección esté representada por cuatro colonias.

En la segunda placa de selección, incube las placas durante 16 a 36 horas. A 32 grados, fotografíe las placas finales de selección de mutantes dobles para medir cuantitativamente la aptitud de crecimiento de los mutantes y analizar las interacciones entre pares de genes. Dado que los genes de la misma vía muestran patrones gastrointestinales estrechamente correlacionados, los genes funcionalmente relacionados se pueden agrupar agrupándolos de acuerdo con la similitud general de sus perfiles de puntuación S.

La similitud del perfil gastrointestinal representa la congruencia de los fenotipos tras la mutación de dos genes y debe ser indicativa de si los dos genes actúan en la misma vía o se superponen. Aquí se muestra la distribución de los coeficientes de correlación entre los perfiles GI de los pares de genes que codifican proteínas que interactúan físicamente frente a los pares de genes extraídos al azar. Un ejemplo de un diagrama de dispersión de perfiles genéticos correlacionados para dos transportadores que forman un complejo heterotrimérico requerido para la excreción de espermatozoides se muestra con el gen de ecolina de levadura que exhibe.

El alivio de las interacciones con perfiles gastrointestinales altamente correlacionados tiende a codificar vías que están físicamente asociadas o que actúan coherentemente en una vía bioquímica común. Aquí se muestra un ejemplo representativo en el que los componentes de las vías de biosíntesis de hierro y azufre ISC y SUF, funcionalmente redundantes, que participan conjuntamente en un proceso esencial, forman grupos distintos que están vinculados entre sí por extensas interacciones agravantes. Se puede utilizar una medida estadística para encontrar cualquier enriquecimiento significativo de las interacciones entre combinaciones específicas de vías, la integración de las redes GI con las interacciones físicas y otros datos de asociación funcional, como el contexto genómico.

Las relaciones pueden revelar la organización de módulos funcionales de orden superior que definen los sistemas biológicos centrales de las bacterias. El análisis de conglomerados también se puede aplicar a las redes GI para predecir las funciones de los genes anotados. Dado que los algoritmos de agrupación varían.

Sin embargo, las asignaciones funcionales putativas determinadas a través de la agrupación requieren una verificación experimental independiente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar incluir todos los aspectos positivos y negativos necesarios después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos como la proteómica, los experimentos de seguimiento bioquímico y la genómica química para responder preguntas adicionales sobre funciones específicas de los genes, así como sobre la naturaleza de las relaciones funcionales entre los genes y las vías.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir cepas de mutantes dobles, ensamblar matrices receptoras y realizar pruebas de detección de ESGA para investigar las relaciones funcionales entre los genes y los procesos en E. coli.