Name: Mapeo bacterianas redes funcionales y vías en Escherichia Coli Utilizando matrices sintéticas genéticos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: Aprende a investigar relaciones funcionales entre genes bacterianos y vías metabólicas en Escherichia coli utilizando la tecnología eSGA de alto rendimiento. Este método permite identificar interacciones genéticas y calcular puntuaciones de interacción mediante análisis de tamaño de colonias.

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Este trabajo fue apoyado por fondos del Genoma Canadá, el Instituto de Genómica de Ontario, y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud de las subvenciones a JG AG y AE es un recipiente de Vanier Canadá Becas de Posgrado.

<ol><li>Bandyopadhyay, S., Kelley, R., Krogan, N. J., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maps+of+protein+complexes+from+quantitative+genetic+interaction+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional maps of protein complexes from quantitative genetic interaction data.</a> PLoS Comput. Biol. 4, e1000065(2008).</li>
<li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+the+genetic+interaction+map+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Charting the genetic interaction map of a cell.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 66-74 (2011).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-4231 (2010).</li>
<li>Fiedler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+S.+cerevisiae+phosphorylation+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the S. cerevisiae phosphorylation network.</a> Cell. 136, 952-963 (2009).</li>
<li>Roguev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+rewiring+of+functional+modules+revealed+by+an+epistasis+map+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conservation and rewiring of functional modules revealed by an epistasis map in fission yeast.</a> Science. 322, 405-4010 (2008).</li>
<li>Schuldiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Wilmes, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+interaction+map+of+RNA-processing+factors+reveals+links+between+Sem1%2FDss1-containing+complexes+and+mRNA+export+and+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic interaction map of RNA-processing factors reveals links between Sem1/Dss1-containing complexes and mRNA export and splicing.</a> Mol. Cell. 32, 735-746 (2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+approaches+for+identifying+and+analyzing+genetic+interaction+networks+in+Escherichia+coli+and+extensions+to+other+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Systems-level approaches for identifying and analyzing genetic interaction networks in Escherichia coli and extensions to other prokaryotes.</a> Mol. Biosyst. 12, 1439-1455 (2009).</li>
<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coli+synthetic+genetic+array+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">coli synthetic genetic array analysis.</a> Nat. Methods. 5, 789-7895 (2008).</li>
<li>Typas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+peptidoglycan+synthesis+by+outer-membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of peptidoglycan synthesis by outer-membrane proteins.</a> Cell. 143, 1097-10109 (2010).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 2006-200008 (2006).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interaction+maps+in+Escherichia+coli+reveal+functional+crosstalk+among+cell+envelope+biogenesis+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic interaction maps in Escherichia coli reveal functional crosstalk among cell envelope biogenesis pathways.</a> PLoS Genet. 7, e1002377(2011).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+a+bacterial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of a bacterial cell.</a> Cell. 144, 143-156 (2011).</li>
<li>Babu, M., Gagarinova, A., Greenblatt, J., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array-based+synthetic+genetic+screens+to+map+bacterial+pathways+and+functional+networks+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Array-based synthetic genetic screens to map bacterial pathways and functional networks in Escherichia coli.</a> Methods Mol Biol. 765, 125-153 (2011).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-665 (2000).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).</li>
<li>Typas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((quantitative+analyses+of+genetic+interactions+in%5BTitle%5D)+AND+%22E.+coli.+Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">quantitative analyses of genetic interactions in.</a> E. coli. Nat. Methods. 5, 781-787 (2008).</li>
<li>Zeghouf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Peptide+Affinity+%28SPA%29+system+for+the+identification+of+mammalian+and+bacterial+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes.</a> J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).</li>
<li>Davierwala, A. P., et al. , 1147-1152 (2005).</li>
<li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat. Methods. 5, 711-718 (2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+peptide+affinity+purification+system+for+the+systematic+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli.</a> Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).</li>
<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+network+containing+conserved+and+essential+protein+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli.</a> Nature. 433, 531-537 (2005).</li>
<li>Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+functional+atlas+of+Escherichia+coli+encompassing+previously+uncharacterized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins.</a> PLoS Biol. 7, (2009).</li>
<li>Anderson, R. P., Roth, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+genetic+duplications+in+phage+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tandem genetic duplications in phage and bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 31, 473-505 (1977).</li>
<li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+genetic+interactions+and+networks+with+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploring genetic interactions and networks with yeast.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 437-449 (2007).</li>
<li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissection+of+protein+complexes+involved+in+yeast+chromosome+biology+using+a+genetic+interaction+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map.</a> Nature. 446, 806-8010 (2007).</li>
<li>Le Meur, N., Gentleman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+synthetic+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling synthetic lethality.</a> Genome Biol. 9, R135(2008).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+mapping+of+the+yeast+genetic+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global mapping of the yeast genetic interaction network.</a> Science. 303, 808-813 (2004).</li>
<li>Wong, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+biological+networks+to+predict+genetic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Combining biological networks to predict genetic interactions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15682-15687 (2004).</li>
<li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn-seq%3A+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nat. Methods. 6, 767-772 (2009).</li>
<li>Gagarinova, A., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+genetic+manipulation+methods+for+exploring+bacterial+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Genome-scale genetic manipulation methods for exploring bacterial molecular biology.</a> Mol. Biosyst. 8, 1626-1638 (2012).</li>
<li>Dewey, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+orthology%3A+putting+genomic+evolutionary+relationships+into+context%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Positional orthology: putting genomic evolutionary relationships into context.</a> Brief Bioinform. 12, 401-412 (2011).</li>
<li>St Onge, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+pathway+analysis+using+high-resolution+fitness+profiling+of+combinatorial+gene+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Systematic pathway analysis using high-resolution fitness profiling of combinatorial gene deletions.</a> Nat. Genet. 39, 199-206 (2007).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Hemos esbozado un protocolo de paso a paso para el uso de robótica de detección eSGA para investigar las funciones de genes de bacterias a un nivel interrogando vía gastrointestinal. Este enfoque puede ser utilizado para estudiar los genes individuales, así como los sistemas biológicos completos en E. coli. Con cuidado, la ejecución de las medidas experimentales descritas anteriormente, incluyendo todos los controles adecuados, y con rigor el análisis y la validación de los datos de forma independiente GI son a...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;fuerte&gt;I. Antibióticos&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Bioshop</td><td>#CLR201</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td></td><td>#KAN201</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td></td><td># AMP201</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;fuerte&gt;2. Medio Luria-Bertani&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>polvo de LB</td><td>Bioshop</td><td>#LBL405</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bioshop</td><td>#AGR003</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;fuerte&gt;3. Cepas bacterianas y plásmidos&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>cepa Hfr Cavalli &amp;#955;&lt;sub&gt;rojo&lt;/sub&gt; sistema (JL238)</td><td>Babu &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKD3</td><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; Centro de Recursos Genéticos, Yale</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keio &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; Recopilación de receptores F-</td><td>Proyecto Nacional de Recursos Biológicos (NBRP) de Japón&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hipomórfico &lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;Cepas con etiqueta F-SPA</td><td>Sistemas biológicos abiertos; Babu &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;fuerte&gt;4. Cebadores&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cebadores constantes desalados basados en pKD3</td><td></td><td></td><td>F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3'&#039;&lt;br/&gt; R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'</td></tr><tr><td>Cebadores personalizados desalados</td><td></td><td></td><td>Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3'&#039;&lt;br/&gt; Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3'</td></tr><tr><td>Cebadores personalizados desalados</td><td></td><td></td><td>F2 y R2: regiones constantes de 20 nt basadas en la secuencia pKD3 y regiones de homología personalizadas de 45 nt&lt;br/&gt; Región constante F2&lt;br/&gt; 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3'&#039;&lt;br/&gt; Región constante R2:&lt;br/&gt; 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3' S1 y S2: regiones constantes de 27 nt para el cebado de la amplificación del casete SPA-Cm y regiones de homología personalizadas de 45 nt&lt;br/&gt; Región constante S1&lt;br/&gt; 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG-3'&#039;&lt;br/&gt; Región constante S2:&lt;br/&gt; 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3'&#039;&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; KOCO-F y KOCO-C: cebadores de 20 nt situados a 200 pb del sitio de eliminación de un gen no esencial o del gen esencial&lt;br/&gt; sitio de inserción del marcador génico SPA</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;fuerte&gt;5. Reactivos para PCR y electroforesis&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Taq polimerasa DNA</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>tampón PCR 10X</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTPs</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>25 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Bioshop</td><td># AGA002</td><td></td></tr><tr><td>Colorante de carga</td><td>NEB</td><td>#B7021S</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Bioshop</td><td># ETB444</td><td></td></tr><tr><td>buffer TBE 10X</td><td>Bioshop</td><td># ETB444.10</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Bioshop</td><td># TRS001</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma</td><td># T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>Sigma</td><td># B6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>escalera de ADN</td><td>NEB</td><td>#N3232L</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;fuerte&gt;6. Kits de aislamiento y purificación de ADN&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kit de aislamiento y purificación de ADN genómico</td><td>Promega</td><td>#A1120</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Midi kit</td><td>Qiagen</td><td># 12143</td><td></td></tr><tr><td>kit de purificación QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>#28104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;fuerte&gt;7. Equipo para PCR, transformación y replica-pinning&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Ciclador térmico</td><td>BioRad, iCycler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroforesis en gel de agarosa</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroporador</td><td>Bio-Rad GenePulser II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cubeta de electroforesis de 0,2 cm</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>42 &amp;deg;agitatubo de baño de agua a C</td><td>Innova 3100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter TJ-25 centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;C shaker</td><td>New Brunswick Scientific, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;incubadora de placas C</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Robot de sobremesa RoToR-HDA</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas con densidades de pines de 96, 384 y 1.536</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 o 384 pines largos</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;fuerte&gt;8. Equipos de imagenología&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Soporte para cámara</td><td>Kaiser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara digital, 10 megapíxeles</td><td>Cualquier proveedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cajas de luz, Testrite 16&quot; x 24&quot; unidades</td><td>Testrite</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;fuerte&gt;9. Reciclaje de placas o almohadillas &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>lejía al 10 %</td><td>Cualquier proveedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>etanol al 70 %</td><td>Cualquier proveedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua destilada estéril</td><td>Cualquier proveedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabina de flujo</td><td>Cualquier proveedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lámpara ultravioleta</td><td>Cualquier proveedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;fuerte&gt;10. Material de laboratorio&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno de 50 ml</td><td>Cualquier proveedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos microcentrífugos de 1,5 ml</td><td>Cualquier proveedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>frascos cónicos de 250 ml</td><td>VWR</td><td># 29140-045</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultivo estériles de 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td># 366052</td><td></td></tr><tr><td>Viales criogénicos</td><td>VWR</td><td># 479-3221</td><td></td></tr><tr><td>Placas rectangulares</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas microtituladoras de 96 y 384 pocillos</td><td>Singer Instruments</td><td>Nunc</td><td></td></tr><tr><td>Rodillo para placas para sellar placas multipozo</td><td>Sigma</td><td>#R1275</td><td></td></tr><tr><td>placas</td><td>ABgene</td><td># AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>Sello adhesivo de placas</td><td>Fisher Scientific</td><td># 13-990-14</td><td></td></tr><tr><td>-80 &amp;deg;congelador C</td><td>Cualquier proveedor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapeo bacterianas redes funcionales y vías en<em&gt; escherichia coli</em&gt; utilizando matrices sintéticas genéticos

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Fenotipos están determinados por una serie compleja de física (por ejemplo, proteína-proteína) y funcionales (por ejemplo, gen-gen o genética) interacciones (GI) 1. Aunque las interacciones físicas pueden indicar que las proteínas bacterianas se asocian en forma de complejos, que no necesariamente revelan nivel vía-relationships1 funcionales. Pantallas GI, en las que se mide el crecimiento de los mutantes dobles que llevan dos genes eliminados o inactivados y en comparación con los mutantes individuales correspondientes, puede iluminar dependencias epistática entre loci y por lo tanto, proporcionar un medio para consultar y descubrir nuevas relaciones funcionales 2. Mapas a gran escala GI se ha informado de los organismos eucariotas como las levaduras 3-7, pero la información sigue siendo escasa GI para procariotas 8, que impide la anotación funcional de genomas bacterianos. Con este fin, nosotros y otros han desarrollado de alto rendimiento métodos cuantitativos de detección de bacterias gastrointestinales 9, 10 </sup&gt;. A continuación, se presentan los principales pasos necesarios para realizar cuantitativo E. coli sintético de matriz genética (eSGA) procedimiento de detección en una escala del genoma 9, utilizando conjugación bacteriana natural y la recombinación homóloga para generar sistémicamente y medir la aptitud de un gran número de mutantes dobles en un formato de matriz de colonia. Brevemente, un robot se utiliza para transferir , a través de la conjugación, cloranfenicol (Cm) - marcado alelos mutantes de Hfr ingeniería (alta frecuencia de recombinación) &#39;cepas donantes en una serie ordenada de kanamicina (Kan) - F-receptores marcados cepas. Típicamente, se utiliza la pérdida de función de los mutantes individuales no esenciales que llevan deleciones del gen (por ejemplo, la colección &quot;Keio &#39;11) y mutaciones de genes esenciales hipomórficos alelos (es decir, que confieren expresión de proteínas reducida, estabilidad, actividad o 9, 12, 13) a consultar a las asociaciones funcionales de genes no esenciales y esenciales, respectivamente. Después de la conjugación mediada y subsiguiente intercambio genético por recombinación homóloga, los dobles mutantes resultantes se seleccionaron en medio sólido que contiene ambos antibióticos. Después consecuencia, las placas son digitalmente fotografiado y tamaños de colonia son cuantitativamente calificado usando un sistema interno de procesamiento automático de imagen 14. Indicaciones geográficas se revela cuando la tasa de crecimiento de un mutante doble o es significativamente mejor o peor que el esperado 9. No deseados (o negativa) entre las indicaciones geográficas a menudo como resultado mutaciones de pérdida de función en los pares de genes de las vías compensatorias que inciden en el mismo proceso esencial 2. Aquí, la pérdida de un solo gen está tamponada, de tal manera que sea único mutante es viable. Sin embargo, la pérdida de las dos vías es perjudicial y resulta en la letalidad sintética o enfermedad (es decir, crecimiento lento). A la inversa, aliviar (o positivo) pueden ocurrir interacciones entre los genes en la misma vía o complejo de proteínas como la 2supresión de genes, ya sea solo a menudo es suficiente para perturbar la función normal de la vía o un complejo tal que las perturbaciones adicionales no reducen la actividad, y por lo tanto el crecimiento, aún más. En general, la identificación sistemática y el análisis de redes de GI puede proporcionar mapas globales, recomendaciones, de las relaciones funcionales entre un gran número de genes, de los cuales pueden ser vía la información a nivel perdido por otros enfoques inferidos 9.

Los IS revelan relaciones funcionales entre genes. De forma similar, dado que los genes en la misma vía muestran patrones de IS similares y la similitud de los perfiles de IS representa la congruencia de fenotipos, podemos agrupar genes funcionalmente relacionados en vías mediante la agrupación (clustering) de sus perfiles de IS. La integración de redes de IS y de correlación de IS con información de interacciones físicas u otros datos de asociación, como relaciones de contexto genómico (CG), también puede revelar la org...

Sistemáticos ya gran escala sintéticos genéticos (gen-gen o epistasis) pantallas de interacción puede ser utilizado para explorar la redundancia genética y la vía de la diafonía. A continuación, se describe un alto rendimiento cuantitativo sintético tecnología de detección genética amplia, denominada eSGA que hemos desarrollado para la aclaración de las relaciones y explorar epistatic interacción en redes genéticas<em&gt; Escherichia coli</em&gt;.

Mapeo bacterianas redes funcionales y vías en<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizando matrices sintéticas genéticos

Los fenotipos están determinados por una serie compleja de interacciones (II) físicas (p. ej., proteína-proteína) y funcionales (p. ej., gen-gen o genéticas)1. Mientras que...

El objetivo de este procedimiento es investigar las relaciones funcionales entre genes y vías bacterianas. Esto se logra primero preparando matrices de ceia coli, cepas mutantes simples que serán conjugadas o apareadas. El segundo paso consiste en conjugar los mutantes simples en un formato de matriz sobre placas.A continuación, se seleccionan los mutantes dobles. El paso final consiste en obtener imágenes de las placas con mutantes dobles y cuantificar las colonias de mutantes dobles para determinar la aptitud del cepa. Finalmente, se analizan los datos del tamaño de las colonias para calcular las puntuaciones de interacción genética e identificar genes, vías y procesos funcionalmente interactivos.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la mutagénesis aleatoria es que se pueden crear muchas cepas dobles mutantes individuales. Además, se pueden evaluar simultáneamente las interacciones entre muchos genes, independientemente del tamaño del gen, su esencialidad o la aptitud del mutante de gen único. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de sistemas, como aquellas relacionadas con las funciones génicas y la comuni

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Gen bacteriano y Análisis de Expresión El uso de microarrays

La purificación por afinidad de las proteínas etiquetadas en combinación con espectrometría de masas (APMS) es un potente método para la asignación sistemática de las redes de interacción de proteínas y para la investigación de la base mecánica de los procesos biológicos. A continuación, se describe un péptido secuencial optimizado afinidad (SPA) APMS procedimiento desarrollado por la...

Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

El diseño de un operón que codifica sintético tanto el aparato secretor y los monómeros estructurales de fibras curli se describe. La sobreproducción de estos amiloides y polímeros adherentes permite una ganancia apreciable de adhesión de...

Ingeniería bacterias adherentes mediante la creación de un único operón sintético curli

Este protocolo de cinco días se esbozan todos los pasos, el equipo y el software complementario necesario para la creación y ejecución de un eficiente Escherichia coli endógeno basado sistema de expresión libre de células TX-TL a partir de cero. Con los reactivos, el protocolo de toma 8 horas o menos a la configuración de una reacción, recopilar y procesar datos.

Los protocolos para la implementación de un Escherichia coli Basado TX-TL-Cell de Libre Expresión de la biología sintética

Microscopía de localización fotoactivado (PALM) combinada con el seguimiento de una sola molécula permite la observación directa y la cuantificación de la proteína-DNA en células de E. coli vivas de Escherichia.

Visualización de la proteína-DNA en células bacterianas en directo mediante fotoactivado Tracking Single-molécula

Aquí, presentamos enfoques fenómicos para la caracterización funcional de genes de fagos putativos. Las técnicas incluyen un ensayo desarrollado capaz de monitorear el metabolismo anabólico del huésped, las placas de ensayo multifenotipo (MAP), además del método establecido de metabolómica, capaz de medir los efectos del metabolismo catabólico.

Fenómica fagos: enfoques fisiológicos para caracterizar Novela Virales Proteínas

proteínas efectoras bacterianas son importantes para establecer infecciones exitosas. Este protocolo describe la identificación experimental de parejas de unión proteica de una proteína efectora bacteriana en su huésped natural de la planta. La identificación de estas interacciones efectoras a través de levadura híbrido de dos pantallas se ha convertido en una herramienta importante en el descubrimiento de estrategias moleculares de patogenicidad.

Desenredar la función de un efector bacteriana de una planta de patógenos no cultivables Uso de una levadura de dos híbridos pantalla

Este artículo presenta una serie de protocolos para el desarrollo de células modificadas y las superficies funcionalizadas que permiten sintéticamente por ingeniería genética de E. coli para controlar y manipular las superficies de materiales programables.

El uso de la biología sintética para Ingeniero células vivas que interactúan con materiales programables

Aquí, el poder de una inserción al azar de un elemento de DNA no codificante mediada por transposones se utilizó para resolver su posición cromosómica óptima.

Determinación de la óptima Localización cromosómica de un elemento de DNA en Escherichia coli utilizando un nuevo enfoque mediada por transposones

La viabilidad de las estrategias de secuenciación del genoma completo (WGS) utilizando instrumentos de sobremesa ha simplificado la interrogación del genoma de cada microbio de relevancia para la salud pública en un entorno de laboratorio. Se describe una adaptación metodológica del flujo de trabajo para WGS bacteriano y también se presenta una tubería bioinformática para el análisis.

Caracterización de una cepa patógena de Escherichia coli derivada de granjas de Oreochromis spp.

Aquí, se presenta un protocolo para diseñar, construir y administrar un circuito sintético inducible basado en tetraciclinas. El efecto de los circuitos sintéticos sobre la eliminación de parásitos y la expresión de citoquinas se puede estudiar mediante la canalización de la tubería presentada. Este protocolo es relevante para los investigadores que estudian terapias basadas en circuitos sintéticos en enfermedades infecciosas.

Circuitos inmunometabólicos en la infección para el avance de las terapias dirigidas al huésped

Aprende a investigar relaciones funcionales entre genes bacterianos y vías metabólicas en Escherichia coli utilizando la tecnología eSGA de alto rendimiento. Este método permite identificar interacciones genéticas y calcular puntuaciones de interacción mediante análisis de tamaño de colonias.

Mapeo bacterianas redes funcionales y vías en

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