El Proceso de Monstruo Verde para la generación de cepas de levadura que llevan deleciones múltiples genes

El objetivo general de este procedimiento es generar cepas de levadura que porten deleciones múltiples marcadas con un gen reportero de proteína verde fluorescente. Esto se logra primero preparando mutantes haploides simples denominados pro monstruos, cada uno de los cuales lleva un casete de deleción GFP en lugar de uno de los genes diana. El segundo paso consiste en combinar las deleciones mediante apareamiento y selección de cepas de levadura utilizando dos conjuntos de marcadores de selección diploides y haploides denominados kit genético A y kit genético alfa, que también están presentes en las cepas pro monstruo.

A continuación, se seleccionan células altamente fluorescentes a partir de la población mitótica mediante citometría de flujo para enriquecer las cepas que portan dos deleciones. El paso final consiste en confirmar los genotipos de las cepas ordenadas. En última instancia, rondas repetidas de cruces y enriquecimiento citométrico, iniciando con las cepas resultantes, conducen a la generación de cepas multideleción con un número mayor de deleciones.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el método G para la reutilización de marcadores y la eliminación secuencial de genes, es que se pueden obtener múltiples eliminaciones por ciclo, lo que resulta en un ensamblaje más rápido de múltiples mutantes. Tras la generación de los pro monstruos según se describe en el protocolo escrito que acompaña a este video, se inicia el ciclo sexual preparando cultivos de las cepas establecidas de eliminación de pro monstruo GFP en un tubo Eppendorf de 1,6 mililitros para intercambio de aire. Prepare la cepa de eliminación de tipo de apareamiento A en 100 microlitros de medio sintético completo que carece de histidina, denominado medio menos his. También prepare la cepa de eliminación de tipo de apareamiento alfa en 100 microlitros de medio sintético completo que carece de leucina, o medio menos leu, en un tubo Eppendorf de 1,6 mililitros para intercambio de aire.

Haga agujeros en las tapas de los tubos utilizando un alfiler tratado con etanol al 70%. Gire los tubos horizontalmente a 30 grados Celsius durante la noche. El eje de rotación debe ser paralelo al eje longitudinal del tubo.

Estimando a partir de la densidad óptica, mezcle aproximadamente 250 000 células haploides a y 250 000 células haploides alfa de cepas de deleción GFP en un tubo Eppendorf de 1,6 mililitros. Este número de células generalmente corresponde a siete microlitros de cada cultivo nocturno vortexeado. Centrifugue las células a continuación a 800 × g durante dos minutos para procesarlas.

Después de eliminar el sobrenadante, haga un orificio en la tapa utilizando un alfiler tratado con etanol al 70%. Para permitir el intercambio de aire, agregue 50 microlitros de medio YPDA tras un breve vortex y centrifugue su muestra a 800 G durante cinco minutos. Luego coloque el tubo en una caja húmeda elaborada con una caja de puntas vacía, un pequeño soporte para puntas y una toalla de papel mojada.

Incube la caja durante la noche a 30 grados Celsius. Transfiera 10 microlitros de la mezcla de apareamiento a 500 microlitros de medio GNA sin agar que contenga los antibióticos G418 y nat en un tubo de cultivo de cinco mililitros con tapa aflojada; la densidad óptica inicial a 600 nanómetros es aproximadamente 0,1. Agite el cultivo a 30 grados Celsius durante 24 horas.

Esto permite la selección de diploides porque solo los diploides que contienen tanto MX cuatro en el kit GM A como nat MX cuatro pueden crecer en presencia de G cuatro 18 y Nat. Transfiera 20 microlitros de la cultura de un día a 500 microlitros de medio GN fresco que contenga G cuatro 18 y nat. La densidad óptica inicial a 600 nanómetros es aproximadamente 0,2.

Gire el tubo a 30 grados Celsius durante cinco horas para llevar las células a la fase logarítmica. A continuación, correlacione los diploides y aísle las esporas. Siga el procedimiento descrito en el protocolo escrito.

Proceda a dividir la suspensión de células relacionadas con SPO en dos partes de 300 microlitros e introduzca cada una en un tubo eppendorf de 1,5 mililitros separado. Centrifugue los tubos a 800 G durante cinco minutos. Tras la eliminación del sobrenadante S, haga un orificio en la tapa de cada tubo.

Usando una aguja de presión, agregue 100 microlitros de medio menos his al pellet de un tubo. Para seleccionar haploides a la PT del otro tubo, agregue 100 microlitros de medio menos loo. Para seleccionar haploides alfa.

Incube los tubos a 30 grados Celsius durante la noche. La densidad óptica final a 600 nanómetros debe ser inferior a 0,5. Si la densidad óptica a 600 nanómetros tiende a ser demasiado alta, realice el ensayo a temperatura ambiente.

Para inducir la GFP, agregue 100 microlitros de medio fresco sin his ni LU que contenga 20 microgramos por mililitro de doxiciclina a las diferentes cepas. La concentración final de doxiciclina es de 10 microgramos por mililitro. Vortexee el tubo y rote a 30 grados Celsius durante dos días.

Para comenzar la citometría de flujo, agregue 900 microlitros de tampón TE previamente filtrado a un tubo de polipropileno de cinco mililitros con la tapa intercambiada por una tapa con filtro proveniente de un tubo de poliestireno de cinco mililitros. Los tubos de polipropileno son adecuados para la citometría de flujo. La tapa con filtro es recomendada para eliminar partículas grandes.

Coloque suavemente 75 microlitros del tampón sobre la tapa del filtro celular. Añada 25 microlitros de las células inducidas a la solución sobre la tapa, presionando la punta del perpipete contra la malla. Pase toda la solución combinada a través del filtro.

Presione la tapa del colador y vortexee el tubo. Prepare los tubos de recolección, tubos fendor de 1,6 mililitros llenos con 200 microlitros de medio menos hiss o menos lube. Encienda el clasificador celular y ajuste la configuración según el manual del fabricante.

Vortexe los tubos de recolección para recubrir la pared con el medio. También vortexe el tubo que contiene las células antes de cargarlas en el clasificador de células. Adquiera los datos de citometría de flujo de la muestra.

Una cepa sin GFP puede servir como control negativo. Dibuje compuertas para clasificación con el fin de evitar agregados celulares, que podrían exhibir una intensidad alta de GFP. Descarte los valores atípicos con un ancho o área de pulso desproporcionadamente grandes para la dispersión directa, abreviada como FSC, utilizando una gráfica de ancho de pulso frente a altura de pulso, o una gráfica de área de FSC frente a altura de FSC.

Dado que una FSC elevada se espera únicamente en agregados celulares, seleccione células en el 20 % inferior de FSC. Evite las regiones con los valores más bajos de FSC y dispersión lateral o SSC, donde frecuentemente se encuentra material celular en desecho. La señal de SSC y la de GFP suelen estar positivamente correlacionadas.

Para evitar enriquecer las células con un valor más alto de SSC, dibuje una compuerta a lo largo del perímetro de la población utilizando un gráfico de intensidad de GFP y SSC para seleccionar un porcentaje similar de las células más brillantes de cada punto a lo largo del eje de SSC en conjunto. Del 0,1 al 1 % de la subpoblación seleccionada utilizando las compuertas de FSC y SSC antes de este paso debe marcarse para ordenar 200 hacia el tubo de recolección. Vortexe el tubo de recolección para cubrir las células ordenadas con medio de placa.

Un subconjunto de células en placa A-Y-P-D-A para genotipificación. Incubar la placa a 30 grados Celsius durante dos días tras la incubación. Preparar un lisado de aproximadamente 12 colonias.

Después de seguir los pasos descritos en el protocolo escrito para la genotipificación, analice un microlitro de un lisado diluido utilizando una reacción de PCR de 10 microlitros con un cebador directo. Ese cebador se une a la región flanqueante ascendente de cada gen eliminado, emparejado con un cebador común que se une a todos los loci de eliminación.

La PCR se puede realizar en formato de 96 o 384 pocillos tras la amplificación. Analice los productos de PCR mediante electroforesis.

Identifique los haploides que probablemente tengan los genotipos deseados. Establezca estas cepas en una placa fresca. También congélelos en glicerol al 25 % a menos 80 grados Celsius.

Se recomiendan pruebas adicionales, como la confirmación de la ausencia de secuencias de tipo silvestre para genes eliminados y la electroforesis posterior en gel de campo pulsado. Repita el ciclo sexual con cepas útiles. Se indujo la expresión de GFP en descendencia haploide proveniente de un cruce entre dos cepas.

Se utilizó un cassette GFP para cada delección génica mediante compuertas en un citómetro de flujo, y se seleccionó una población de las células resultantes. Es poco probable que esta población contenga restos celulares o agregados de células. Se clasificaron y retuvieron el 1% de las células más brillantes mediante la selección de células basada en el área de dispersión hacia adelante y la altura de dispersión hacia adelante.

Los agregados celulares, que tienden a tener un área de dispersión anterior desproporcionadamente grande, o se excluyen mediante el filtrado de células en función de la dispersión anterior y la dispersión lateral; se aceptaron las células en el rango inferior del 20 % en dispersión anterior, excluyendo al mismo tiempo los restos celulares con la dispersión anterior y lateral más baja. Mediante el filtrado de células en función de la dispersión lateral y la señal de GFP, se seleccionaron las células más fluorescentes dentro de un rango determinado de dispersión lateral, lo que permitió la comparación entre la mezcla mitótica y la muestra de control negativo que no expresa GFP. Un GA idéntico al utilizado para seleccionar la población P tres se muestra en el diagrama. Para las células del control negativo seleccionadas de manera similar, en un haplo distinto, se realizó análisis mediante PCR después de que se indujera su expresión de GFP y se clasificaran según fluorescencia. El número esperado de deleciones en una célula no clasificada, resultado de la segregación aleatoria, fue de 7,5.

En este experimento en particular, las células ordenadas tuvieron un número promedio de deleciones de 8,8 ± 0,3, incluyendo cinco células que contenían 10 deleciones. Genotipo DO. El PCL de las cepas ordenadas se realizó utilizando un cebador inverso.

Ese 10 se une a la región flanqueante aguas abajo emparejada con un cebador directo. Ese 10 se une al extremo del casete. La presencia de una banda indica la presencia del casete GFP.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar el método verde Monster para diseñar deleciones en levadura.