Name: La implantación estereotáctica intracraneal y En vivo Radiología bioluminiscente de xenoinjertos de tumores en un sistema modelo de ratón de glioblastoma multiforme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-25T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Aprende a implantar células de glioblastoma multiforme en cerebros de ratones nude mediante técnicas estereotácticas precisas. Este método permite el seguimiento no invasivo del crecimiento tumoral mediante imagen bioluminiscente y resonancia magnética.

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Estamos muy agradecidos con el Dr. Andrew Hollander, Sara Davis, Shuman Lee, Tim Jenkins, y el Dr. Xu Xiangsheng por su ayuda experta. Queremos agradecer el apoyo de la Dra. Ann Kennedy. BCB contó con el apoyo de la Beca de Formación Radiobiología C5T32CA009677. JFD se apoya en el Premio a la Trayectoria Burroughs Wellcome para Científicos Médicos (1.006.792). JLB contó con el apoyo de la concesión supers (5 R25 CA140116-03). Nos gustaría agradecer al Dr. Steve Hahn, cuyo aliento y apoyo ha contribuido a que nuestra investigación sea posible. También nos gustaría dar las gracias a la Universidad de Pennsylvania Centro de Nano-Bio Interface (NBIC) y el Dr. Dennis Discher para el estímulo y útiles comentarios. Reconocemos el Animalario de imagen pequeña (SAIF) en la Universidad de Pennsylvania para el uso de sus instalaciones centrales de resonancia magnética y óptica / bioluminiscencia. Estas técnicas fueron desarrolladas como parte de los proyectos que recibieron el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (RC1 y K08 CA145075 NS076548-01).

A. Pre-Operativo preparación de células del tumor <ol><li> Transducir células U251 con glioblastoma multiforme con un vector de expresión lentiviral (pGreenFire, Sistema Biosciences) para expresar de forma estable el gen de la luciferasa de luciérnaga. </li><li> Estas células fueron cultivadas en 10 ml de modificación completa de Dulbecco del medio Eagle (DMEM), que consiste en DMEM suplementado con suero de ternera fetal al 10%, 1% penicilina estreptomicina, y 1% de aminoácidos no esenciales en un matraz de tejido T75 cultivo incubando a 5% de C0 2 y 37 ° C. </li><li> Realizar cultivo celular estándar, a partir de lavar las células con tampón fosfato salino (PBS), seguido de tripsinización. </li><li> Se inactiva la tripsina con DMEM completo, transferir la solución a un matraz cónico de 50 ml y determinar la concentración celular utilizando un contador de Coulter. </li><li> Centrifugar las células cosechadas en DMEM completo durante 3 min a aproximadamente 3.000 revoluciones por minuto. </li><li> Después de la centrifugación, de aspirarf los medios de comunicación, dejando sólo un pellet de células en el fondo del matraz cónico de 50 ml. </li><li> Trabajando rápidamente para evitar que las células de la desecación, volver a suspender las células en un volumen de DMEM completo fresco para conseguir la concentración deseada de 50.000 células / l y la transferencia a un vial de 2 ml estériles se colocaron en hielo. </li><li> Las células en hielo debe ser vortex brevemente en un nivel bajo cada ~ 20 min para evitar la adhesión celular. Las células pueden utilizarse con seguridad para implantes intracraneales hasta dos horas después de la colocación en hielo. </li></ol> B. Implantación Xenoinjerto ortotópico <ol><li> Pesar desnudos atímicos NCr ratón (nu / nu) para establecer una línea de base, antes de la implantación de peso. Por lo general, seleccione ratones de 6-10 semanas de edad, con pesos entre 17 y 24 gramos. </li><li> 1 hr antes de la implantación, pre-medicar el ratón con 5 mg / kg del fármaco meloxicam no esteroide anti-inflamatorio por vía subcutánea como un tratamiento para el dolor postoperatorio y la inflamación. </li><li> Anesthetize el animal con una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina / xilazina a dosis de 140 mg / kg y 10 mg / kg, respectivamente. </li><li> Confirmar que el ratón es suficientemente anestesiado mediante la evaluación de la respuesta espontánea del animal a una pizca dedo del pie. Si el animal responde a la pizca dedo del pie, retrasar el procedimiento hasta que la anestesia puede tener efecto o considerar la inyección de anestesia adicional (&lt;25% de la cantidad original). </li><li> Prepare el ratón anestesiado para el posicionamiento en el Digital Stoelting Just for plataforma Ratón estereotáctica (Stoelting Inc.) enganchando los dientes del ratón incisivos en la barra de bocado de la inmovilización hocico y apretar la abrazadera nariz sobre el hocico al tiempo que garantiza que la cabeza del ratón está sobre un plano nivelado. </li><li> Transferir el ratón restringida a la plataforma estereotáctica Stoelting, el ajuste de la posición del animal de modo que las puntas de las barras de las orejas son en el extremo caudal del canal del oído. Una vez que el animal craneal a caudal de posicionamiento ha sido adjusted, asegure la barra de bocado para el marco estereotáxico. El ratón debe descansar sobre una placa firme calefacción plástico (Harvard Apparatus) sujeta con cinta a la plataforma Stoelting para proporcionar retroalimentación controlada por regulación de la temperatura durante la cirugía. </li><li> Ajuste la altura de las barras de oído según sea necesario y luego avanzar las barras del oído en la porción caudal del conducto auditivo externo, asegurándolos de tal manera que la cabeza del ratón está en un plano nivelado y se inmovilizan en toque de un dedo. Monitorear cuidadosamente en busca de signos de dificultad respiratoria después de la colocación de las barras de oído. Suelte y vuelva a situar si el animal está en peligro. </li><li> Insertar la punta lubricada de una sonda de temperatura rectal conectado al controlador de temperatura TCAT-2DF (Harvard Apparatus) para controlar la temperatura del animal y para proporcionar control de realimentación para la placa de calentamiento posicionado debajo del ratón para mantener la temperatura corporal del animal a 36 ° C durante el procedimiento. </li><li> Aplicar pomada oftálmica para los ojos para prevent secado. </li><li> Aplicar solución de betadine a la parte superior de la cabeza del ratón para desinfectar el lugar de la incisión, teniendo cuidado de evitar los ojos. </li><li> Realizar una pizca dedo del pie para confirmar que el ratón es inconsciente, la entrega de una pequeña cantidad de ketamina adicional / xilazina (&lt;25% de la dosis inicial) si es necesario. </li><li> Limpiar el 0,45 mm broca de fresa (Stoelting) unido a la perforación (Foredom microtaladro) utilizando una almohadilla con alcohol y luego esterilizar la broca en un esterilizador de perlas de vidrio (Germinator 500, CellPoint Scientific) durante 15 seg, sumergiendo sólo la broca en las perlas esterilizador. </li><li> El uso de un bisturí estéril practicar una incisión 0,75 cm longitudinalmente en la mitad del cuero cabelludo que se extiende desde el nivel de los ojos en sentido caudal. Confirmar la visualización de la bregma. </li><li> Fije el soporte a la plataforma de perforación Stoelting y colocar un taladro (Foredom microtaladro) con un poco 0,45 mm taladro fresa (Stoelting) en el soporte del taladro, manteniéndola en su posición. </li><li> Coloque la broca exactamente sobre tél bregma y de finalización y la x, y, z de la pantalla estereotáxica digital. Mover la punta de la broca a una posición de 2 mm posterior y 1,5 mm lateral a la bregma en el hemisferio cerebral derecho, y un taladro en el cráneo del animal con el taladro Foredom, perforando sólo el hueso. Una torunda de algodón estéril se puede utilizar para retraer suavemente los bordes de la incisión para facilitar la visualización del cráneo. </li><li> Eliminar el taladro y el taladro de soporte de la plataforma estereotáctica. </li><li> Una el Nanomite inyector bomba de jeringa (Harvard Apparatus) para la plataforma estereotáctica. </li><li> Retire las pilas de hielo y, o bien suavemente vórtice del vial que contiene las células tumorales con breves impulsos o dé golpecitos en el vial para resuspender las células. Elaborar 7 l de la suspensión celular a través de un calibre 30 de 1 &quot;larga aguja de bisel plano adjunto a una jeringa de 10 l (Hamilton jeringa). Evite grandes burbujas de aire en la jeringa. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la inicial de 6 l de fluido which será el volumen total inyectado en el ratón. Las pequeñas burbujas de aire en el resto de 1 l son de ninguna preocupación. Evitar una repetición de drenaje planos de la suspensión de células a ser posible para minimizar el daño a las células. </li><li> Coloque la jeringa cargada en la jeringa del inyector. Uso de una almohadilla de alcohol, eliminar cualquier líquido de la suspensión de células que aparece en la punta de la aguja para evitar la contaminación del sitio de la incisión con células de cáncer que pueden resultar en el crecimiento del tumor en el espacio extracraneal. </li><li> Ajustar la bomba de inyector para suministrar 6,0 l a una velocidad de 0,5 l / min. El 1 l de suspensión celular queda en la jeringa después de la implantación asegura que las burbujas de aire que con frecuencia se acumulan en la jeringa no se inyectan en el animal. La inyección de burbujas de aire podría resultar en una embolia de aire fatal. </li><li> Avanzar la aguja de la jeringa en el orificio de trepanación mantener la aguja perpendicular (90 grados) con el cráneo. Una vez que la aguja ha atravesado el cráneo, cero fuera de los coordinAtes de la pantalla estereotáctica digital y luego avanzar lentamente la punta de la aguja durante un periodo de 4 min hasta que se alcanza una profundidad de 2,5 mm. La aguja pasa a través de la corteza y las porciones del hipocampo posterior. El x, y, z las coordenadas de implantación estereotáxica fueron elegidos para generar un tumor lateralmente colocada dentro del hemisferio cerebral evitando lesiones a las estructuras cerebrales críticas tales como el tálamo y la proximidad a los ventrículos, reduciendo así la probabilidad de sembrar el líquido cefalorraquídeo con células tumorales que puede dar lugar a indeseables tumores vertebrales. Una ubicación posterior con respecto a la bregma fue seleccionado para reducir la probabilidad de un tumor grande, localmente avanzado ulcerosas en la órbita. Pausa con la aguja a una profundidad de 2 min y luego iniciar la implantación de células. </li><li> Durante la implantación, se seca el cráneo repetidamente con una lanza esponja microquirúrgica para eliminar cualquier fluido que contiene tumor que pueden haber reflujo de la trepanación duranteimplantación. Evite interrumpir la aguja con la esponja microquirúrgica. La eliminación de este líquido debería reducir la probabilidad de tumor que crece en el espacio extracraneal. </li><li> Después de completar la inyección, deje la aguja en el cerebro durante aproximadamente 2 min y luego, lentamente, retirar la aguja durante un periodo de 3-4 min. </li><li> Afloje las barras de oído y restrictores hocico y retire el ratón del aparato estereotáxico. </li><li> Cierre el orificio de trépano en el cráneo con cera ósea estéril depositado por el roce de cera de ida y vuelta a través del orificio de trepanación del final de madera de un estéril con punta de algodón aplicador. Continuar aplicando cera de hueso hasta que el orificio está completamente sellado y la cera de hueso sellar el orificio de trépano está alineado con el cráneo adyacente. </li><li> Re-aproximados los bordes de la incisión con hisopos de algodón estériles y aplicar pegamento tejido veterinaria para sellar la herida, teniendo cuidado de evitar la exposición de pegamento a los ojos del animal. </li><li> Por último, coloque el cursor sobre una almohadilla térmica a 37 °C hasta que el animal recupera la consciencia. Traslado al animal de vuelta a su jaula original una vez que el ratón está alerta y preparado. </li></ol> C. bioluminiscente de imágenes (BLI) para controlar el crecimiento tumoral y la respuesta al tratamiento Guía rápida para seguir para obtener imágenes bioluminiscentes. <ol><li> Anestesiar los ratones implantados previamente con tumor en una cámara con isoflurano 2% y oxígeno. </li><li> Mientras que los ratones se anestesian, les inyectan por vía subcutánea o por vía intraperitoneal con 60 l de sal de potasio de D-luciferina diluido en PBS a una concentración de 50 mg / ml. </li><li> Encender el flujo de la anestesia a los conos de ojiva en el escáner de imágenes bioluminiscentes y transferir rápidamente a los ratones para el escáner colocando sus hocicos en los conos de ojiva. </li><li> Coloque divisores negras entre los ratones para limitar el sangrado de señal bioluminiscente de un tumor con alta intensidad de señal a un tumor adyacente con señal mucho menor. </li><li> Usoel software Image Living, tomar frecuentes exposiciones de serie para una duración total de hasta 30 min después del tiempo de inyección de D-luciferina. Estamos a favor de establecer el tiempo de exposición a &quot;Auto&quot; para limitar la probabilidad de una imagen bajo o sobre expuestas. No sola exposición debe ser&gt; 5 min. </li><li> Realizar repetir bioluminiscente de imágenes a intervalos apropiados. Formación de imágenes semanal de serie es una opción razonable para muchos experimentos longitudinales evaluar la respuesta al tratamiento. </li><li> Después de la adquisición de imágenes, usar el programa de software Image Living para analizar los tumores mediante la elaboración de una región de interés (ROI) alrededor de cada tumor en cada imagen adquirida durante la sesión de formación de imágenes bioluminiscentes. Aplicar una segunda región, más pequeña de interés para el flanco inferior de cada ratón en cada imagen como una región de fondo de interés para corregir la señal bioluminiscente del tumor en función del grado de intensidad de señal de fondo bioluminiscente. Nosotros preferimos usar el &quot;Radiance&quot; en lugar de &quot;ajuste de cuenta&quot; como la salidavalores de señal bioluminiscente. </li><li> Exportar los resultados de ROI en Excel y determinar el máximo fondo ajustado señal bioluminiscente para cada ratón. </li><li> Repita imágenes bioluminiscentes, como se indica para la monitorización seriada de crecimiento del tumor. En nuestros experimentos, se realiza semanalmente BLI. Nosotros preferimos la determinación de la máxima señal de BLI para una sesión de imágenes obtenido tomando exposiciones frecuentes sobre 5 - 30 min después de la inyección de D-luciferina. </li></ol> D. Representante Resultados Esta técnica de implantación estereotáxica se asocia con un éxito tumor tasa de absorción de 90-100% y con baja mortalidad perioperatoria que es por lo general menos de 5%. El riesgo de efectos secundarios no deseados es también bajo con esta técnica, incluyendo las complicaciones tales como la siembra de la médula espinal a partir de células tumorales implantadas en los ventrículos, o el crecimiento del tumor extracraneal de cualquiera de siembra de la incisión con células tumorales o el cierre inadecuado de la trepanación unguientes tumor intracraneal para expandirse a través de la abertura en el cráneo. Análisis ex vivo de xenoinjertos de tumores demostraron áreas que se espera de la hipoxia, el aumento de la expresión del VEGF, y necrosis. Microscopía de fluorescencia de la proteína verde fluorescente (GFP) estable expresado por nuestra línea celular GBM revelaron la naturaleza infiltrante de estos xenoinjertos. La Figura 1 muestra los resultados de una implantación estereotáxica típico con éxito de células de GBM en el cerebro de un ratón. Este es un escáner cerebral ponderada en T2 MRI de un cerebro de ratón realizó con un imán de 9,4 Tesla 21 días después de la implantación con la técnica aquí descrita. Figura 1 revela un único foco de tumor en el hemisferio derecho (contorneada en rosa) medición de 19 mm 3 que se localiza en las coordenadas precisas del sitio de implantación. La Figura 2 muestra los resultados de formación de imágenes bioluminiscente usando el techn<html> iques descrito aquí por un grupo de 10 ratones con tumores implantados estereotácticamente que estaban uniformemente estratificada basada en la intensidad máxima de la señal bioluminiscente para recibir irradiación craneal (4 x 4 Gy fracciones diarias) o ningún tratamiento en absoluto. En este experimento, bioluminiscente de imágenes muestra que la terapia de radiación inhibe la proliferación de los tumores implantados, lo que resulta en ningún aumento en la señal detectada bioluminiscente, mientras que la señal aumenta sustancialmente en los tumores de control mock-irradiados, debido a la proliferación descontrolada de las células cancerosas. Figura 1 (Video). Coronal secciones de IRM de un cerebro de ratón que contiene un tumor glioblastoma multiforme U251 con el contorno del volumen del tumor (en color rosa). El análisis se ha realizado mediante un spin eco ponderada protocolo T2 en un escáner 9.4 Tesla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4089/4089movie1.m4v" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película</a> . RE 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4089/4089fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. 10 ratones con tumores implantados estereotácticamente glioblastoma multiforme fueron tratados con radioterapia de haz externo a 16 Gy en fracciones de 4 o ningún tratamiento. Los ratones fueron imágenes con imágenes bioluminiscentes antes del tratamiento y cada semana después del inicio del tratamiento. El gráfico presenta bioluminiscencia relativa calculada como cambio de la mediana pliegue donde se define el cambio veces como la relación del valor de la corriente máxima BLI a pre-tratamiento máximo valor BLI.

<ol><li>Stupp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N. Engl. J. Med. 352, 987-996 (2005).</li>
<li>Jacobs, V. L., Valdes, P. A., Hickey, W. F., De Leo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+review+of+in+vivo+GBM+rodent+models%3A+emphasis+on+the+CNS-1+tumour+model%5BTitle%5D)+AND+%22ASN+Neuro%22%5BJournal%5D)">Current review of in vivo GBM rodent models: emphasis on the CNS-1 tumour model.</a> ASN Neuro. 3, e00063(2011).</li>
<li>Shelton, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+pre-clinical+in+vivo+mouse+model+for+malignant+brain+tumor+growth+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">A novel pre-clinical in vivo mouse model for malignant brain tumor growth and invasion.</a> J. Neurooncol. 99, 165-176 (2010).</li>
<li>Brehar, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+xenograft+glioblastoma+implants+in+nude+mice+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Life%22%5BJournal%5D)">The development of xenograft glioblastoma implants in nude mice brain.</a> J. Med. Life. 1, 275-286 (2008).</li>
<li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), e1986(2010).</li>
<li>Radaelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistopathological+and+neuroimaging+characterization+of+murine+orthotopic+xenograft+models+of+glioblastoma+multiforme+recapitulating+the+most+salient+features+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Immunohistopathological and neuroimaging characterization of murine orthotopic xenograft models of glioblastoma multiforme recapitulating the most salient features of human disease.</a> Histol. Histopathol. 24, 879-891 (2009).</li>
<li>Baumann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+efficacy+of+drug-loaded+nanocarriers+against+brain+tumors+by+targeted+radiation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Enhancing the efficacy of drug-loaded nanocarriers against brain tumors by targeted radiation therapy.</a> , Submitted (2012).</li>
<li>Baumann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+method+for+reproducible+and+accurate+image-guided+stereotactic+cranial+irradiation+of+brain+tumors+using+the+Small+Animal+Radiation+Research+Platform+%28SARRP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Oncol%22%5BJournal%5D)">An integrated method for reproducible and accurate image-guided stereotactic cranial irradiation of brain tumors using the Small Animal Radiation Research Platform (SARRP).</a> Transl. Oncol. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Park, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroPET%2FCT+imaging+of+an+orthotopic+model+of+human+glioblastoma+multiforme+and+evaluation+of+pulsed+low-dose+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiat.+Oncol.+Biol.+Phys%22%5BJournal%5D)">MicroPET/CT imaging of an orthotopic model of human glioblastoma multiforme and evaluation of pulsed low-dose irradiation.</a> Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 80, 885-892 (2011).</li>
<li>Szentirmai, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+of+luciferase+expressing+intracranial+U87+xenografts%3A+correlation+with+magnetic+resonance+imaging+determined+tumor+volume+and+longitudinal+use+in+assessing+tumor+growth+and+antiangiogenic+treatment+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging of luciferase expressing intracranial U87 xenografts: correlation with magnetic resonance imaging determined tumor volume and longitudinal use in assessing tumor growth and antiangiogenic treatment effect.</a> Neurosurgery. 58, 365-372 (2006).</li>
<li>Dinca, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+monitoring+of+intracranial+glioblastoma+xenograft%3A+response+to+primary+and+salvage+temozolomide+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence monitoring of intracranial glioblastoma xenograft: response to primary and salvage temozolomide therapy.</a> J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método de implantación estereotáctica de las células cancerosas en ratones descritos en este documento genera reproduciblemente tumores que razonablemente recapitular el modelo de infiltración y rápido crecimiento del glioblastoma multiforme clínico 2, 6-8. Esta técnica está especialmente bien adaptado a los experimentos que estratifican ratones uniformemente a distintos grupos de tratamiento donde los tumores reproducibles de tamaño comparable y las propiedades biológicas y, en determinadas localizaciones...

<table border="1"><tbody><tr><td> Descripción </td><td> Proveedor </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Just for Digital Ratón instrumento estereotáxico </td><td> Stoelting </td><td> 51730D </td><td> Estereotáctica plataforma para la implantación del ratón </td></tr><tr><td> La ketamina / xilazina </td><td></td><td></td><td> Anestesia inyectable </td></tr><tr><td> Puralube ungüento Veterinario (oftálmica) </td><td> Amazon.com </td><td></td><td> Para prevenir la sequedad en los ojos del ratón </td></tr><tr><td> perforar soporte para la plataforma estereotáctica </td><td> Stoelting </td><td> 51681 </td><td></td></tr><tr><td> Taladro eléctrico Micromotor </td><td> Stoelting </td><td> 51449 </td><td> Para taladrar a través del cráneo </td></tr><tr><td> 0.45 mm carburo broca </td><td> Stoelting </td><td> 514551 </td><td></td></tr><tr><td> Hisopos de algodón estériles </td><td> Fisher Scientific </td><td> 23-400-100 </td><td></td></tr><tr><td> Cuenta de vidrio seco esterilizador (Germinator 500) </td><td> Braintree Scientific </td><td> GER-5287 </td><td> Para esterilizar los instrumentos quirúrgicos metálicos </td></tr><tr><td> Ratón sonda rectal </td><td> Braintree Scientific </td><td> RET-3-ISO </td><td> Compatible con el controlador de temperatura </td></tr><tr><td> Controlador de temperatura (TCAT-2DF) </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 727561 </td><td> Controlador de temperatura para mantener la temperatura del animal durante cirugía </td></tr><tr><td> Pequeña placa calefactora </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 727617 </td><td> Para el uso con controlador de temperatura para calentar ratón durante la cirugía. La placa de calefacción se ajusta debajo del ratón en la plataforma estereotáxica. </td></tr><tr><td> Escalpelos desechables </td><td> BD Bard-Parker </td><td> 2015-11 </td><td> # 10 bisturí </td></tr><tr><td> 10 microlitros jeringa </td><td> Hamilton </td><td> 7635-01 </td><td> Para la inyección de las células tumorales </td></tr><tr><td> Agujas de calibre 30, de 1 &quot;de largo, con punta plana </td><td> Hamilton </td><td> Vario </td><td> Debe ser compatible con la jeringa 10 l </td></tr><tr><td> Nanomite bomba de jeringa programable </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 704507 </td><td> Digital jeringa motorizada inyector para dispositivo estereotáxico </td></tr><tr><td> Celulosa estériles esponjas quirúrgicas lanza </td><td> Ultracell </td><td> 40410 </td><td> Para secar el campo quirúrgico </td></tr><tr><td> Bone cera </td><td> Ethicon </td><td> W31 </td><td> Para sellar el orificio de trepanación </td></tr><tr><td> Tissumend II adhesivo sintético tejido absorbible </td><td> Laboratorios de Productos Veterinarios </td><td> 3002931 </td><td> Para sellar la incisión </td></tr><tr><td> Bomba de agua caliente con cubierta térmica de colchón </td><td> Gaymar </td><td> TP-650 </td><td> Calienta ratones en el postoperatorio </td></tr><tr><td> IVIS Lumina II </td><td> Caliper Life Science </td><td></td><td> Bioluminiscente de imágenes </td></tr><tr><td> D-luciferina de potasio sal </td><td> Oro Biotecnología </td><td> SUERTE-1 </td><td> Luciferina para bioluminiscente de imágenes </td></tr></tbody></table>

la implantación estereotáctica intracraneal y<em&gt; en vivo</em&gt; radiología bioluminiscente de xenoinjertos de tumores en un sistema modelo de ratón de glioblastoma multiforme

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

El glioblastoma multiforme (GBM) es un cáncer de alto grado primario del cerebro con una supervivencia media de sólo 14,6 meses en los seres humanos a pesar estándar tri-modalidad de tratamiento consiste en la resección quirúrgica, post-operatorio la radioterapia y la quimioterapia temozolomida 1. Nuevos enfoques terapéuticos se evidencia la necesidad de mejorar la supervivencia del paciente y la calidad de vida. El desarrollo de estrategias más efectivas de tratamiento se vería favorecida por los modelos animales de GBM que recapitular la enfermedad humana todavía permiten obtener imágenes en serie para controlar el crecimiento del tumor y la respuesta al tratamiento. En este trabajo, describimos nuestra técnica para la implantación estereotáxica precisa de bio-células capaces de formar imágenes GBM cáncer en el cerebro de ratones desnudos que resulta en xenoinjertos de tumores que recapitulan las principales características clínicas de la MBG 2. Este método produce tumores que son reproducibles y están situadas en localizaciones anatómicas precisas al tiempo que permite imágenes in vivo bioluminiscente para supervisar serie intrael crecimiento de xenoinjertos craneal y respuesta a los tratamientos 3-5. Este método es también bien tolerado por los animales con baja morbilidad y mortalidad perioperatorias.

Se describe un método integrado para la implantación precisa, estereotáctica de las células de glioblastoma multiforme en el cerebro de ratones desnudos y posterior serie<em&gt; In vivo</em&gt; Formación de imágenes para controlar el crecimiento y la respuesta al tratamiento de los xenoinjertos resultantes.

La implantación estereotáctica intracraneal y<em&gt; En vivo</em&gt; Radiología bioluminiscente de xenoinjertos de tumores en un sistema modelo de ratón de glioblastoma multiforme

El glioblastoma multiforme (GBM) es un cáncer cerebral primario de grado elevado con una mediana de supervivencia de solo 14,6 meses en humanos, a pesar de la trimodalidad estándar...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la implantación estereotáctica precisa de células cancerosas de glioblastoma multiforme bioimagenables en los cerebros de ratones desnudos para generar xenoinjertos tumorales que recapitulen características clínicas clave del glioblastoma multiforme. Esto se logra primero preparando células tumorales de glioblastoma multiforme para que expresen establemente luciferasa, permitiendo imágenes bioluminiscentes no invasivas en series. El segundo paso consiste en anestesiar al ratón y colocarlo en el sujetador estereotáxico.A continuación, se realiza una incisión en la piel y se perfora un orificio de trépano en las coordenadas precisas a partir del B bgma. El último paso consiste en la implantación lenta de células tumorales en el cerebro mediante técnicas estereotácticas, seguida de la retirada de la aguja y el cierre de la incisión. Finalmente, se utilizan imágenes bioluminiscentes y resonancia magnética para realizar estudios de imagen no invasivos seriados con el fin de rastrear el crecimiento tumoral y la respuesta a tratamientos experimentales.La principal ventaja de esta técnica en comparación con métodos existentes, como la implantación manual no estereotáxica de células cancerosas, es que el método de implantación intracraneal estereotáxica de células tumorales en ratones descrito aquí genera tumores más reproducibles que imitan razonablemente el patrón de crecimiento infiltrativo y rápido del glioblastoma multiforme clínico. La morbilidad y mortalidad perioperatoria del procedimiento son muy bajas, y la tasa de establecimiento tumoral es muy alta. Esta técnica es especialmente adecuada para experimentos en los que se distribuyen ratones de forma equitativa en diferentes grupos de tratamiento, cuando se desea obtener tumores reproducibles de tamaño, propiedades biológicas y localización anatómica comparables. Para comenzar este procedimiento.Después de anestesiar al ratón con la mezcla de ketamina y xilacina, colóquelo en la plataforma estereotáxica para ratón Stulting Digital sujetando sus dientes incisivos en la barra de mordida del sujetador de hocico. A continuación, apriete la pinza nasal sobre el hocico. Mientras tanto, asegúrese de que la cabeza del ratón esté en un plano horizontal.A continuación, traslade el ratón inmovilizado a la plataforma estereotáxica. Ajuste la posición del animal de modo que las puntas de las barras oticas queden al final del conducto auditivo. Luego asegure la barra mordedera al marco estereotáxico.El ratón debe estar reposando sobre una placa calefactora de plástico firme sujeta con cinta adhesiva a la plataforma, para proporcionar regulación de temperatura controlada con retroalimentación durante la cirugía. Después, introduzca las barras auriculares en la porción del conducto auditivo. Fíjelas de forma que la cabeza del ratón quede en un plano horizontal y inmovilizada.A continuación, inserte la punta lubricada de una sonda de temperatura rectal para monitorear la temperatura del animal y proporcionar control de retroalimentación a la placa calefactora con el fin de mantener la temperatura corporal del animal a 36 grados Celsius durante la cirugía. Luego, aplique una pomada oftálmica a los ojos para prevenir el secado. Posteriormente, aplique solución de Betadine sobre la cabeza del ratón.Después de confirmar que el ratón está inconsciente mediante un pellizco en el dedo del pie, use un escalpelo estéril para hacer una incisión longitudinal de 0,75 centímetros en la línea media del cuero cabelludo, extendiéndose desde el nivel de los ojos hacia atrás. Asegúrese de que el BMA sea visible. Luego, fije el portabrocas al soporte de estereotaxia.Luego, coloque una fresa con una broca de 0,5 milímetros en el portabrocas y fíjela firmemente en su posición. Ahora, coloque la broca exactamente encima del rema. Utilice un hisopo estéril para retraer suavemente los bordes de la incisión con el fin de facilitar la visualización del cráneo. Desplace la punta de la fresa a una posición situada a dos milímetros por detrás y 1,5 milímetros en sentido lateral respecto al bgma en el hemisferio cerebral derecho, y realice la perforación en el cráneo del animal utilizando la fresa Fordham, penetrando únicamente el hueso.Luego retire el taladro de la plataforma estereotáxica. A continuación, sujete la bomba de jeringa inyectora de ácaros a la plataforma estereotáxica. Retire las células del hielo y, bien vortexe suavemente el vial que contiene las células tumorales con pulsos breves o bien golpee suavemente el vial para resuspender las células.Luego aspire siete microlitros de la suspensión celular a través de una aguja de bisel plano de 30 gauge y una pulgada de largo, conectada a una jeringa de 10 microlitros. Evite burbujas de aire grandes en la jeringa y asegúrese de que no haya burbujas de aire en los primeros seis microlitros de líquido, que constituirán el volumen total inyectado en el ratón. Coloque la jeringa cargada en el inyector de jeringas.Utilice una torunda con alcohol para eliminar cualquier líquido de la suspensión celular que aparezca en la punta de la aguja, con el fin de prevenir la contaminación del sitio de incisión con células cancerosas, lo que podría provocar el crecimiento de un tumor en el espacio extracraneal. Ahora, configure la bomba de inyección para administrar 6,0 µL a una velocidad de 0,5 µL por minuto. El microlitro de suspensión celular que queda en la jeringa después de la implantación asegura que las burbujas de aire que con frecuencia se acumulan en la jeringa no sean inyectadas en el animal; la inyección de burbujas de aire podría provocar una embolia aérea fatal.A continuación, avance la aguja de la jeringa hacia el orificio de trepanación manteniendo la aguja perpendicular al cráneo. Una vez que la aguja haya atravesado el cráneo, ajuste a cero las coordenadas en la pantalla digital estereotáxica. Luego, avance lentamente la punta de la aguja durante un período de cuatro minutos hasta que alcance una profundidad de 2,5 milímetros.Pausar durante dos minutos y luego iniciar la implantación de las células después de que la inyección haya finalizado; dejar la aguja en el cerebro durante aproximadamente dos minutos. A continuación, retirar lentamente la aguja durante un período de tres a cuatro minutos. Aflojar las barras de sujeción de las orejas y el sujetador de la nariz.A continuación, retire el ratón del aparato estereotáxico. Cierre el orificio de trepanación en el cráneo con cera ósea estéril frotándola hacia adelante y hacia atrás sobre el orificio. Continúe aplicando la cera ósea hasta que el orificio quede completamente sellado y el orificio sellado esté al ras con el cráneo adyacente.A continuación, aplique pegamento quirúrgico veterinario para sellar la herida y vuelva a aproximar los bordes de la incisión con hisopos estériles, asegurándose de que los ojos del animal no entren en contacto con el pegamento. Finalmente, coloque al ratón sobre una almohadilla calefactora ajustada a 37 grados Celsius hasta que recupere la conciencia. Transfiera al animal de regreso a su jaula original.Una vez que el ratón esté alerta y respondiendo mientras está anestesiado, inyecte 60 microlitros de sal potásica de D-luciferina, diluidos en PBS hasta una concentración de 50 miligramos por mililitro, ya sea por vía subcutánea o intraperitoneal. Encienda el flujo de anestesia hacia los conos nasales en el escáner de imagen bioluminiscente y transfiera rápidamente los ratones al escáner, colocando sus hocicos dentro de los conos nasales.Coloque los divisores negros entre los ratones para limitar la capacidad de un tumor grande con alta intensidad de señal de aumentar artificialmente la intensidad de señal medida de un tumor adyacente con una señal mucho más baja. Finalmente, utilizando el software Living Image, realice exposiciones seriadas frecuentes, cada una de menos de cinco minutos, durante un tiempo total de hasta 30 minutos a partir del momento de la inyección de luciferina. Se muestra aquí el resultado de una implantación estereotáxica exitosa de células de glioblastoma multiforme en el cerebro de ratón.La resonancia magnética cerebral ponderada en T2 realizada con un imán de 9,4 teslas 21 días después del implante revela un único foco tumoral en el hemisferio derecho que mide 19 milímetros cúbicos y se localiza en las coordenadas exactas del sitio de implante. El cerebro normal circundante se delinea en gris; en este estudio, 10 ratones con tumores de glioblastoma multiforme implantados estereotácticamente fueron tratados con radioterapia de haz externo de 16 grays en cuatro fracciones o sin tratamiento. El imagenológico bioluminiscente muestra que la radioterapia inhibe la proliferación de los tumores implantados, lo que resulta en ninguna elevación de la señal bioluminiscente detectada, mientras que la señal aumenta sustancialmente en los tumores control simulados sin irradiación debido a la proliferación descontrolada de las células cancerosas una vez dominado.Esta técnica puede completarse en aproximadamente 25 minutos por ratón utilizando el mismo lote de células mientras se intenta este procedimiento. Es importante asegurarse de que los animales estén adecuadamente anestesiados y no presenten respuesta a un fuerte pellizco en los dedos del pie antes de iniciar la cirugía. Al mismo tiempo, se debe tener cuidado de no anestesiar en exceso a los animales.Como en nuestra experiencia, la mayoría de las muertes perioperatorias parecen estar asociadas con la depresión respiratoria inducida por anestesia. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la implantación estereotáxica precisa de células cancerosas en los cerebros de ratones desnudos, y cómo llevar a cabo imágenes bioluminiscentes in vivo seriadas para monitorear el crecimiento en respuesta al tratamiento del tumor intracraneal resultante. Xenoinjertos.

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Luciferasa modificados xenoinjertos de tumores humanos el cerebro puede ser establecida por vía intracraneal en ratones atímicos, con posterior seguimiento del crecimiento del tumor y la respuesta a la terapia que utiliza imágenes de bioluminiscencia. En combinación con el análisis de supervivencia, la supervisión de bioluminiscencia es una herramienta esencial para la investigación pre-clínica de las terapias que se consideran para el tratamiento de tumores cerebrales.

El establecimiento de xenoinjertos de tumor cerebral intracraneal, con posterior análisis del crecimiento tumoral y respuesta al tratamiento con imágenes de bioluminiscencia

Implantación intracraneal de GL261 células en ratones C57BL / 6 produce los gliomas malignos que recapitular muchas de las características del glioblastoma multiforme humano. Hemos utilizado GL261 células que expresan establemente la luciferasa que nos permita...

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Fuente: Clark, A.J., et al. Imágenes de bioluminiscencia de un modelo animal inmunocompetente para el glioblastoma. J. Vis. Exp. (2016)Este video muestra imágenes de bioluminiscencia para rastrear la progresión del glioblastoma en un modelo de ratón inmunocompetente, utilizando células tumorales que expresan luciferasa y luciferina para cuantificar el crecimiento tumoral de forma no invasiva.

Imágenes de bioluminiscencia de un modelo de ratón inmunocompetente para el glioblastoma

Hemos establecido un modelo ortotópico de glioblastoma cortical en ratones para intravital microscopía de dos fotones que recapitula las limitaciones biofísicas normalmente en juego durante el crecimiento del tumor. Una ventana de cristal crónica reemplazando el cráneo por encima de la del tumor permite el seguimiento de la progresión del tumor con el tiempo por microscopía de dos fotones.

El mantenimiento de un modelo de ratón ortotópico Glioblastoma Restricciones cerebral parenquimatosa físicas y Conveniente para intravital microscopía de dos fotones

El cerebro es un sitio único con cualidades que no están bien representados por los análisis in vitro o ectópicos. Modelos ortotópico de ratón con la ubicación y características de crecimiento reproducibles se pueden crear de forma fiable con inyecciones intracraneales utilizando un instrumento de fijación estereotáxica y una bomba de inyección de baja presión.

Crear anatómicamente exactos y reproducibles intracraneal xenoinjertos de tumores cerebrales humanos

GL261 proporcionan un modelo animal inmunocompetente útil de glioblastoma. Los objetivos de este protocolo son demostrar las técnicas adecuadas para monitorizar el crecimiento tumoral intracraneal mediante imágenes de bioluminiscencia in vivo, y verificar la utilidad de las células GL261 modificadas con luciferasa para el estudio de la inmunología tumoral y los enfoques inmunoterapéuticos para el tratamiento del glioblastoma.

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Ortotópico inyección intracraneal de células del tumor se ha utilizado en la investigación del cáncer para el estudio de la biología del tumor de cerebro, evolución, evolución y respuesta terapéutica. Presentamos la tomografía molecular fluorescencia de xenoinjertos tumorales, que proporciona en tiempo real imágenes intravital y cuantificación de un tumor masivo en modelos preclínicos de glioblastoma.

Tomografía Molecular de la fluorescencia para obtener imágenes In Vivo de xenoinjertos de Glioblastoma

Aquí, describimos un modelo de ratón ortotópico preclínico para GBM, establecido por inyección intracraneal de células derivadas de tumores modelo de ratón genéticamente modificados. Este modelo muestra las características de la enfermedad del GBM humano. Para estudios traslacionales, el tumor cerebral de ratón se rastrea mediante resonancia magnética in vivo e histopatología.

Modelos ortotópicos traslacionales del glioblastoma multiforme

Presentamos un enfoque novedoso para la microscopía de dos fotones de la administración tumoral de nanopartículas de óxido de hierro marcadas con fluorescencia al glioblastoma en un modelo de ratón.

Microscopía intravital de dos fotones de glioblastoma en un modelo murino

El objetivo de este protocolo es proporcionar a los investigadores una técnica altamente reproducible para las implantaciones intracraneales.

Implantación intracraneal estereotáctica de líneas celulares de xenoinjertos derivadas de pacientes con glioblastoma en ratones

Aprende a implantar células de glioblastoma multiforme en cerebros de ratones nude mediante técnicas estereotácticas precisas. Este método permite el seguimiento no invasivo del crecimiento tumoral mediante imagen bioluminiscente y resonancia magnética.

La implantación estereotáctica intracraneal y En vivo Radiología bioluminiscente de xenoinjertos de tumores en un sistema modelo de ratón de glioblastoma multiforme (Video) | JoVE Journal

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