La detección de microARNs en la microglía por PCR en tiempo real en el SNC normal y durante la neuroinflamación

El objetivo general de este procedimiento es analizar la expresión de microARN en microglía. Esto se logra primero mediante la disección del cerebro y la médula espinal, y luego homogenizando el tejido del sistema nervioso central o SNC. En el segundo paso, se aíslan las células mononucleares del SNC mediante un gradiente por capa, y posteriormente se identifica la población de microglía mediante citometría de flujo.

A continuación, se aísla el ARN de los microglías y se analiza la calidad de la muestra. Finalmente, se realiza una PCR en tiempo real para el microARN de interés específico. En última instancia, el método delta delta CT puede utilizarse para mostrar el nivel relativo de expresión de un microARN específico en microglías.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no logran aislar un número suficiente de células mononucleares del SNC o porque la muestra está contaminada con mielina y restos celulares. Ambos casos dan como resultado una preparación de baja calidad, ya sea por una baja concentración de ARN o por contaminación con proteínas, respectivamente. El procedimiento será demostrado por mí y por vir.

Después de la perfusión de todos los ratones, diseccionar los cerebros y las médulas espinales. Luego, colocar un cerebro y una médula espinal a la vez en un homogenizador de 15 mililitros, añadiendo cinco mililitros de PBS a los tejidos cada vez. Tras realizar de 10 a 20 golpes suaves, pasar el homogeneizado a través de filtros celulares de 70 micrones hacia tubos cónicos individuales de 50 mililitros y centrifugar los tubos durante cinco a siete minutos a 834 ×g y 4 °C.

Después de desechar el sobrenadante, resuspenda el homogenado de cerebro y médula espinal de dos a tres ratones en cinco a siete mililitros de Percoll al 70%. A continuación, superponga siete mililitros de Percoll al 40% y centrifugue la solución de Percoll y células durante 30 minutos a 850 × g a 20 grados Celsius sin freno. Deseche las células dañadas y el mijo y los restos en la parte superior del Percoll al 70%.

Luego, recolecte las células mononucleares en la interfase entre las soluciones de 70 % y 40 % por llamada y diluya las células recolectadas en PBS, al menos en una proporción uno a uno. Después de centrifugar las células, resuspenda el precipitado en medio mililitro de PBS y transfiéralas a un tubo einor de 1,7 mililitro. Comience transfiriendo 50 microlitros de las células ordenadas por gradiente de densidad a un nuevo tubo einor de 1,7 mililitro y agregue 350 microlitros de tampón fax al tubo.

Luego, después de agregar de cinco a 10 microlitros de anticuerpos anti-FCR al tubo, incubar las células de 10 a 15 minutos en hielo. Dividir la muestra celular en dos tubos eppendorf, colocando una parte en un tubo. Agregar un microlitro de anticuerpos anti-CD11B y dos microlitros de anticuerpos anti-CD45.

Incubar las células durante 10 a 15 minutos adicionales en hielo. Etiquetar el segundo tubo como control negativo y colocarlo en hielo. Después de la incubación con los anticuerpos de tinción, añadir un mililitro de tampón fax a ambos tubos y centrifugar las células en una microcentrífuga durante cinco minutos a 1200 ×g.

A continuación, fije los pellet en 400 microlitros de paraformaldehído al 1 % en PBS y vortexee los tubos para evitar la formación de grumos. Finalmente, analice las células mediante citometría de flujo utilizando la muestra de control negativo de células y las cuentas BD com. Comience inmunizando por vía subcutánea un grupo de cinco a diez ratones C57 negro seis de ocho a doce semanas de edad con 150 miligramos del péptido MOG 35-55 en 4 miligramos por mililitro de adyuvante completo de Freund para inducir EAE. Luego, administre toxina de la pertussis por vía intraperitoneal el día cero y el día dos después de la inmunización.

Después de aislar y teñir las células como se acaba de mostrar, suspenda los pellets en 400 microlitros de PBS en lugar de fijador justo antes de la clasificación. Luego, llene dos tubos einor de 1,7 mililitros con 300 microlitros de PBS suplementado con 10 %FBS para recolectar las muestras. Finalmente, clasifique las poblaciones de microglía y macrófagos con una alta pureza utilizando la estrategia de selección ilustrada en este gráfico de densidad representativo.

Después de la clasificación, reanalice las poblaciones de microglía y macrófagos para determinar las purezas de las muestras celulares aisladas. Después de centrifugar las poblaciones celulares clasificadas a 1200 ×g durante cinco a siete minutos en una microcentrífuga, retire cuidadosamente el sobrenadante y congele los botones celulares en hielo seco. A continuación, transfiera los botones celulares congelados al hielo común.

Para la descongelación, agregue 300 microlitros de tampón de lisis de un kit Nirvana y luego mezcle suavemente la solución celular pipeteando de cinco a siete veces. A continuación, agregue 30 microlitros del aditivo para homogenato, vortexee la suspensión celular durante 30 segundos y coloque los tubos en hielo durante 10 minutos. Ahora agregue 300 microlitros de fenol ácido, cloroformo, y vortexee el tubo durante 30 segundos más.

Luego, después de centrifugar las células durante cinco minutos a 9.500 × g, transfiera cuidadosamente los 300 microlitros superiores del sobrenadante que contiene la fase acuosa a un nuevo tubo einor de 1,7 mililitros. Mezcle la solución con 375 microlitros de etanol al 100 %. Transfiera todo el contenido del tubo a un cartucho de filtro del kit Nirvana y centrifugue el cartucho durante un minuto a 9.500 × g. A continuación, deseche el tampón del flujo atravesado.

Añada 700 microlitros de la solución de lavado uno del kit Nirvana y centrifugue durante otro minuto a 9,500 ×g después de lavar el cartucho. Repita dos veces más con 500 microlitros de la solución de lavado dos del kit Nirvana. Eluya el ARN del cartucho con 60 microlitros de agua libre de nucleasas precalentada.

Finalmente, utilice un espectrofotómetro NanoDrop para evaluar la pureza y la cantidad de ARN después de realizar la Q-R-T-P-C-R en tiempo real para detectar microARN en las muestras de microglía y macrófagos. Se pueden crear curvas de P-R-T-P-C-R para productos de PCR de meros 1 24 y ARN 55 de snow etiquetados con fluorescencia como se muestra aquí en el primer gráfico. Se muestran curvas típicas de la cantidad de productos de PCR específicos etiquetados con fluorescencia para muestras de control de ARN 55 de snow de ARN aisladas de microglía o macrófagos derivados de médula ósea en comparación con el número de ciclos de PCR.

Observe cómo se determinan los valores CT para el análisis de la expresión de ARN de snow RNA 55 a partir de las diferentes poblaciones celulares en la intersección de la línea base con la parte inferior del rango lineal de las curvas de Q-R-T-P-C-R, como se indica en la gráfica mediante las líneas verticales verde y azul. En esta segunda gráfica, se muestra la cantidad de productos específicos de PCR marcados con fluorescencia para las muestras experimentales de ARN mere 1 24 procedentes de microglía o macrófagos derivados de médula ósea en comparación con el número de ciclos de PCR. Observe cómo los valores CT para el análisis de la expresión de mere 1 24 a partir de las diferentes poblaciones celulares se determinan nuevamente en la intersección de la línea base con la parte inferior del rango lineal de las curvas de Q-R-T-P-C-R, como se indica en la gráfica mediante las líneas verticales verde y azul.

Después de determinar los valores CT para cada una de las muestras, al igual que la expresión de snow RNA 55 y mere 1 24 en microglía y BM dms de ratones normales y EAE mostrados en esta tabla, reste el valor CT de la muestra control snow RNA 55 del valor CT de la muestra experimental mere 1 24 para calcular los valores delta CT para cada duplicado de cada muestra. Luego, reste el delta CT de la muestra de referencia de los valores delta CT de las otras muestras para calcular los valores delta delta CT. Finalmente, el nivel relativo de expresión para cada muestra se calcula como dos elevado a la potencia de menos delta delta CT, como se observa en este gráfico de densidad.

En el caso de un buen aislamiento de microglía a partir del SNC normal, el 95 a 98 % de las células representarán microglía CD11b positiva CD45 baja, con un 2 a 5 % de la suspensión celular compuesta por macrófagos perivasculares CD11b positivos CD45 altos, y menos del 1 % de linfocitos CD11b negativos CD45 altos o astroglias CD11b negativas CD45 negativas o células gliales oligodendrocíticas o fragmentos celulares estarán presentes. En comparación, en una preparación deficiente existe una contaminación significativa de células o fragmentos celulares CD11b negativos CD45 negativos, tales como astroglias o partículas de mielina, lo que hace que las células no sean adecuadas para el aislamiento de ARN y análisis posteriores. Además, también pueden estar presentes células CD11b negativas CD45 altas, lo que indica contaminación por linfocitos sanguíneos debido a una perfusión insuficiente. En este gráfico de densidad, se muestran las tres poblaciones celulares presentes en el SNC durante la neuroinflamación: microglía CD11b positiva CD45 baja, macrófagos CD11b positivos CD45 altos y linfocitos CD11b negativos CD45 altos.

Se muestra la calidad del ARN determinada mediante electroforesis en gel después de un aislamiento bueno frente a uno malo. Cuando el ARN se aísla de manera limpia, son evidentes una escalera de ARN y el ARN ribosómico; cuando el proceso de aislamiento se realiza deficientemente, aparecen halos y productos de degradación de bajo peso molecular. Estos datos finales demuestran la expresión de meros 1 24 en microglía normal de adultos, microglía de ratones con EAE y microglía aislada de ratones durante las primeras etapas del desarrollo.

En este primer gráfico de barras, la expresión relativa de mere 1 24 es mucho mayor en microglía del SNC normal en comparación con la observada en macrófagos derivados de médula ósea. De manera similar, aunque existe un aumento en el ARN de mere 1 24 en macrófagos del SNC de ratones con EAE, la microglía aún expresa cinco veces la cantidad de ARN de mere 1 24. Este último gráfico de barras demuestra cómo los cambios en el nivel de expresión de mere 1 24 en la microglía durante el desarrollo de ratones de una, dos y cuatro semanas de edad, en comparación con ratones adultos de ocho semanas, también pueden evaluarse utilizando este método durante el intento del procedimiento.

Es importante recordar contar con una cantidad suficiente y una buena calidad de células aisladas, lo que garantizará buenos resultados para todo el experimento.