Name: La detección de microARNs en la microglía por PCR en tiempo real en el SNC normal y durante la neuroinflamación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Aprende a detectar microARNs en microglía mediante PCR en tiempo real en el SNC normal y durante neuroinflamación. Este método permite analizar la expresión génica en células inmunes del sistema nervioso central.

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El trabajo fue apoyado por el NIH R01-01A1 NS071039 beca de investigación.

<ol><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Microglia+in+the+Healthy+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Role of Microglia in the Healthy Brain.</a> J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).</li>
<li>Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microglia+in+CNS+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Role of microglia in CNS inflammation.</a> FEBS Lett. , (2011).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li>
<li>Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+stem+cell+reprogramming+for+neuronal+induction+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation.</a> Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).</li>
<li>McCoy, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+miRNAs+in+cytokine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">The role of miRNAs in cytokine signaling.</a> Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).</li>
<li>He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-155+regulates+inflammatory+cytokine+production+in+tumor-associated+macrophages+via+targeting+C%2FEBPbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta.</a> Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-124+promotes+microglia+quiescence+and+suppresses+EAE+by+deactivating+macrophages+via+the+C%2FEBP-alpha-PU.1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway.</a> Nat. Med. 17, 64-70 (2011).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).</li>
<li>Gabriely, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+21+promotes+glioma+invasion+by+targeting+matrix+metalloproteinase+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators.</a> Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).</li>
<li>Caffarelli, E., Filetici, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+in+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation in cancer development.</a> Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).</li>
<li>Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Throughput+MicroRNA+Profiling%3A+Optimized+Multiplex+qRT-PCR+at+Nanoliter+Scale+on+the+Fluidigm+Dynamic+ArrayTM+IFCs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs.</a> J. Vis. Exp. (54), e2552(2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Recientemente un gran interés fue dado a la microglía y la participación de estas células en muchas patologías asociadas a la neuroinflamación y la neurodegeneración. Además, el papel de los microRNAs en la diferenciación de las células del sistema inmune y el cáncer ha crecido dramáticamente durante los últimos varios años 5,10. Hemos informado anteriormente el papel de miR-124 en el mantenimiento del fenotipo no activado o en reposo de la microglía en el SNC normal 7, pero el papel de los otros t...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> GIBCO </td><td> 14190 </td><td> Puede ser preparado a partir de componentes secos en el laboratorio, pH: 7.2-7.4 </td></tr><tr><td> PBS 10 veces </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30258.02 </td><td> Puede ser preparado a partir de componentes secos en el laboratorio, pH: 7.2-7.4 </td></tr><tr><td> DMEM; FBS </td><td> GBCO </td><td> 11965, 10438 </td><td></td></tr><tr><td> Mirvana kit </td><td> Invitrogen </td><td> AM1561 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Sigma </td><td> P4937-500 ml </td><td> 100 ml de 100% de Percoll se prepara mezclando 10 ml de 10X PBS y 90 ml de Percoll de Sigma. 50 ml de 70% de Percoll espreparado por mezcla de 35 ml de 100% de Percoll y 15 ml de DMEM 50 ml de 40% de Percoll se prepara mezclando 20 ml de 100% de Percoll y 30 ml de 1X PBS </td></tr><tr><td> MOG 35-55 péptido </td><td> AnaSpec Inc </td><td> 60130-5 </td><td></td></tr><tr><td> Comité de Libertad Sindical </td><td> DIFCO </td><td> 263810 </td><td></td></tr><tr><td> Toxina pertussis </td><td> Sigma </td><td> P7208 </td><td></td></tr><tr><td> FcR anticuerpos bloqueantes </td><td> BD Biosciences </td><td> 553142 </td><td> Clon 2.4G2 </td></tr><tr><td> Anti-CD11b - PE MAB </td><td> BD Biosciences </td><td> 553311 </td><td> Puede ser utilizado con diferentes fluoróforos (por ejemplo, AF488) </td></tr><tr><td> Anti-CD45-APC-Cy7 mAbs </td><td> BioLegend </td><td> 103116 </td><td> Puede ser utilizado con diferentes fluoróforos (por ejemplo APC) </td></tr><tr><td> Paraformalformaldehído (16%) </td><td> EMS Inc. </td><td> 15710 </td><td> Diluir 1:15 en PBS 1X </td></tr><tr><td> 15% de TBE-gel de urea </td><td> Life Technologies Inc. </td><td> EC68855BOX </td><td></td></tr><tr><td> Micro RNA TaqMan transcripción inversa Kit </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4366596 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Universal PCR Master Mix </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4304437 </td><td></td></tr><tr><td> Los ensayos TaqMan mmu microARN miR-124a- </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4427975 ID 001182 </td><td></td></tr><tr><td> Los ensayos TaqMan microARN snoRNA-55 </td><td> Life Technologies Inc </td><td> 4427975 ID 001228 </td><td></td></tr><tr><td> Agua libre de nucleasa </td><td> Life Technologies Inc </td><td> AM9937 </td><td> Agua libre de nucleasa </td></tr><tr><td> 384 y placa de reacción clara óptica </td&gt; <td> Life Technologies Inc. </td><td> 4309849 </td><td> Puede ser sustituido con otras placas (por ejemplo, placa de 96 pocillos) en diferentes instrumentos en tiempo real de PCR </td></tr><tr><td> Homogeneizador Dounce (15 ml) </td><td> Wheaton Science Products. </td><td> 358044 </td><td> Teflón / vidrio </td></tr><tr><td> 40 μ de células colador de nylon </td><td> Halcón </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga grande </td><td> Sorval </td><td> RT 6000B </td><td> Diámetro del rotor 18,5 cm </td></tr><tr><td> Centrífuga pequeña </td><td> Eppendorf </td><td> 5415 R </td><td> Diámetro del rotor 6,5 cm </td></tr><tr><td> PCR en tiempo real del instrumento </td><td> Life Technologies Inc. </td><td> AB 7900 HT </td><td> Puede ser sustituido con otros instrumentos </td></tr><tr><td> Citómetro de flujo </td><td> BD Biosciencess </td><td> LSR II </td><td> Puede ser sustituido con otros instrumentos </td&gt; </tr><tr><td> FACS </td><td> BD Biosciences </td><td> FACSAria </td><td> Puede ser sustituido con otros instrumentos </td></tr><tr><td> Espectrofotómetro Nanodrop </td><td> Thermo Scientific </td><td> Nanodrop 1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

la detección de microarns en la microglía por pcr en tiempo real en el snc normal y durante la neuroinflamación

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia son las células del linaje mieloide que residen en el sistema nervioso central (SNC) 1. Estas células juegan un papel importante en patologías de muchas enfermedades asociadas con neuroinflamación tales como la esclerosis múltiple (MS) 2. Microglia en un SNC normales expresan los macrófagos CD11b marcador y exhiben un fenotipo de descanso por los bajos niveles de expresión de marcadores de activación como CD45. Durante los eventos patológicos en el SNC, la microglia se activan según lo determinado por la regulación positiva de CD45 y otros marcadores 3. Los factores que afectan el fenotipo microglia y funciones en el SNC no se ha estudiado bien. Los microARN (miRNA) son una familia creciente de moléculas conservadas (~ 22 nucleótidos de largo) que están involucradas en muchos procesos fisiológicos normales, como el crecimiento y la diferenciación celular 4 y patologías como la inflamación 5. MiRNAs downregulate la expresión de ciertos genes diana por unión secuencias complementarias de laARNm de ir a jugar un papel importante en la activación de las células inmunes, incluyendo los macrófagos y microglia 6 7. Con el fin de investigar las mediadas por miRNA-las vías que definen el fenotipo microglial función biológica, y para distinguir la microglía de otros tipos de macrófagos, es importante para evaluar cuantitativamente la expresión de microARN en particular en distintos subconjuntos de SNC-residente microglia. Los métodos comunes para medir la expresión de miRNAs en el SNC incluyen la PCR cuantitativa a partir de tejido neuronal conjunto y la hibridación in situ. Sin embargo, la PCR cuantitativa a partir de homogeneizado todo el tejido no permite la evaluación de la expresión de miRNA en la microglía, que representan sólo el 15.5% de las células del tejido neuronal. La hibridación in situ permite la evaluación de la expresión de microARN en tipos celulares específicos en las secciones de tejido, pero este método no es completamente cuantitativo. En este informe se describe un análisis cuantitativo y sensitive método para la detección de miRNA por PCR en tiempo real en la microglía aislada de SNC normales o durante la neuroinflamación con encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), un modelo de ratón para la EM. El método descrito será útil para medir el nivel de expresión de microRNAs en la microglía en el SNC normal o durante la neuroinflamación asociada a diversas patologías como esclerosis múltiple, derrame cerebral, lesión traumática, la enfermedad de Alzheimer y tumores cerebrales.

La microglía se macrófagos residentes que proporcionan la primera línea de defensa y de vigilancia inmune del sistema nervioso central. Los microARN son moléculas reguladoras que juegan un papel importante en muchos procesos fisiológicos, incluida la activación y diferenciación de los macrófagos. En este artículo se describe el método para la medición de los microRNAs en la microglía.

La detección de microARNs en la microglía por PCR en tiempo real en el SNC normal y durante la neuroinflamación

La microglía son células del linaje mieloide que residen en el sistema nervioso central (SNC)1. Estas células desempeñan un papel importante en las patologías de muchos...

El objetivo general de este procedimiento es analizar la expresión de microARN en microglía. Esto se logra primero mediante la disección del cerebro y la médula espinal, y luego homogenizando el tejido del sistema nervioso central o SNC. En el segundo paso, se aíslan las células mononucleares del SNC mediante un gradiente por capa, y posteriormente se identifica la población de microglía mediante citometría de flujo.A continuación, se aísla el ARN de los microglías y se analiza la calidad de la muestra. Finalmente, se realiza una PCR en tiempo real para el microARN de interés específico. En última instancia, el método delta delta CT puede utilizarse para mostrar el nivel relativo de expresión de un microARN específico en microglías.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no logran aislar un número suficiente de células mononucleares del SNC o porque la muestra está contaminada con mielina y restos celulares. Ambos casos dan como resultado una preparación de baja calidad, ya sea por una baja concentración de ARN o por contaminación con proteínas, respectivamente. El procedimiento será demostrado por mí y por vir.Después de la perfusión de todos

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Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Una clave para el éxito de la investigación de la biología microglial es la preservación de immunofunction microglial ex vivo durante el aislamiento del tejido del SNC. Aislar microglia mediante agitación rotatoria resultados en cultivos de células de alta pureza y inmunofuncional según la evaluación de imágenes fluorescentes, inmunocitoquímica y ELISA después de la activación microglia con el lipopolisacárido estímulos proinflamatorias (LPS) y Pam 3 CSK 4 (Pam).

Aislamiento de cortical Microglia con Inmunofenotipo Conservas y funcionalidad de murinos Neonatos

Se describe un protocolo de PCR en tiempo real para perfilar microRNAs en el líquido cefalorraquídeo (LCR). Con la excepción de los protocolos de extracción de ARN, el procedimiento se puede extender a ARN extraído de otros fluidos corporales, células cultivadas o muestras de tejido.

Líquido cefalorraquídeo MicroRNA perfiles utilizando cuantitativa en tiempo real PCR

La activación de la microglia y microgliosis son respuestas clave a la neurodegeneración crónica. A continuación, presentamos los métodos para in vivo, visualización a largo plazo de la retina células microgliales CX3CR1-GFP + por oftalmoscopía confocal y de umbral y los análisis morfométricos para identificar y cuantificar su activación. Hacemos un seguimiento de los cambios microgliales durante las primeras etapas del glaucoma relacionada con la edad.

En Vivo Dinámica de Retina Microglial Activación Durante Neurodegeneración: Confocal oftalmoscópico Imaging y Morfometría celular en el ratón Glaucoma

Microglia (células inmunitarias del cerebro), se utilizan como biosensor sustituto para determinar cómo influyen las nanopartículas en la neurotoxicidad. Describimos una serie de experimentos diseñados para analizar la respuesta de la microglía a las nanopartículas y la exposición de las neuronas hipotalámicas al sobrenadante de la microglía activada para determinar la neurotoxicidad.

Microglia como una biosensor sustituto para determinar la neurotoxicidad de nanopartículas

Aquí, se presenta un protocolo para aislar microglia de crías de ratón postnatal (día 1) para la experimentación in vitro. Este método improvisada de aislamiento genera tanto alto rendimiento y pureza, una ventaja significativa sobre métodos alternativos que permite amplia experimentación gama para los fines de elucidar la biología microglial.

El aislamiento magnético rápida y refinado CD11b de la microglia primaria con mayor pureza y versatilidad

Proporcionamos un protocolo para el aislamiento de la microglia de diferentes regiones diseccionadas de un hemisferio cerebral de ratón adulto, seguido de la preparación de la biblioteca semiautomática para la secuenciación profunda de ARN de una sola célula de transcriptomes de longitud completa. Este método ayudará a dilucidar la heterogeneidad funcional de la microglia en salud y enfermedad.

Aislamiento de microglia específica de la región del hemisferio cerebral de un ratón adulto para la secuenciación profunda del ARN de una sola célula

Los cultivos primarios de microglía se utilizan comúnmente para evaluar nuevas moléculas antiinflamatorias. El presente protocolo describe un método reproducible y relevante para aislar magnéticamente la microglía de cachorros neonatos.

Aislamiento magnético de células microgliales de ratones neonatos para cultivos celulares primarios

Este artículo describe un método para la observación crónica in vivo de la microglía en reposo en el hipocampo de ratón CA1 utilizando cirugía controlada con precisión y microscopía de dos fotones.

In vivo Imágenes crónicas de dos fotones de microglia en el hipocampo del ratón

Describimos un protocolo para aislar células microgliales del hipotálamo del ratón (o pequeñas estructuras cerebrales equivalentes) utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS), en un tiempo relativamente corto. La microglía hipotalámica clasificada por MACS se puede utilizar para análisis ex vivo y se puede sembrar para realizar ensayos in vitro .

Aislamiento de microglía hipotalámica a partir de cerebro de ratón adulto recién perfundido mediante clasificación de células activadas magnéticamente  

Este artículo demuestra un método para visualizar y cuantificar la motilidad y el contacto de la microglía con puntos postsinápticos en la retina mediante microscopía confocal de disco giratorio.

Imágenes en vivo y caracterización de la dinámica de la microglía e interacciones con sinapsis en retina murina enferma

El Software de Parámetros Microgliales de Mapeo (MMPS) es una cadena de análisis fácil de usar que no requiere conocimientos de codificación y que semiautomatiza el análisis de morfología microglial de células individuales a partir de imágenes de inmunofluorescencia. Validado en un modelo de neuroinflamación inducido por lipopolisacáridos en roedores, MMPS detecta de forma reproducible los cambios morfológicos asociados a la activación y permite un fenotipado microglial estandarizado y...

Software de Mapeo de Parámetros Microgliales (MMPS): Una herramienta de código abierto y fácil de usar para el análisis cuantitativo de la morfología de la microglía

Aprende a detectar microARNs en microglía mediante PCR en tiempo real en el SNC normal y durante neuroinflamación. Este método permite analizar la expresión génica en células inmunes del sistema nervioso central.

La detección de microARNs en la microglía por PCR en tiempo real en el SNC normal y durante la neuroinflamación

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