Multi-parámetro de medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad en el corazón del ratón mitocondrias aisladas

El objetivo de este vídeo es describir un procedimiento para caracterizar la transición de la permeabilidad mitocondrial. Mala apertura en las mitocondrias, aisladas del corazón del ratón. En primer lugar, las mitocondrias se aíslan de los corazones de los ratones.

Utilizando el método de centrifugación diferencial, la calidad de las mitocondrias aisladas se evalúa utilizando un electrodo de oxígeno oxitérmico conectado a una computadora para medir la relación de control respiratorio y evaluar la integridad de la membrana mitocondrial. Luego, utilizando instrumentación espectrofluorométrica, se utiliza la medición simultánea del manejo de calcio, el potencial de membrana mitocondrial y el volumen mitocondrial para determinar la transición de permeabilidad. Mala apertura.

Los datos resultantes mostraron diferencias en la capacidad de retención de calcio y la transición de la permeabilidad mitocondrial. Mala sensibilidad de las mitocondrias aisladas, Apertura de la transición de permeabilidad mitocondrial. El poro es un fenómeno complejo que implica cambios en varios niveles en la fisiología y anatomía mitocondrial.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que la medición de múltiples parámetros al mismo tiempo ofrece una imagen más completa del fenómeno que la medición de parámetros individuales solos, como el calcio, la movilización o la hinchazón. Antes de comenzar el procedimiento, descongele el tampón de aislamiento mitocondrial y verifique el pH, que debe ser de 7,4. A continuación, coloque todos los tampones, platos y tubos que se van a utilizar sobre el hielo. Tenga en cuenta que todos los pasos del protocolo de aislamiento de mitocondrias deben realizarse en hielo.

Coloque los corazones de ratones sacrificados en una placa de Petri y enjuague la sangre con mitocondrias frías. Búfer de aislamiento. A continuación, transfiera los corazones a una nueva placa de Petri con una cuchilla, retire la grasa y las aurículas, luego pique los corazones hasta obtener un producto homogéneo.

Transfiera los corazones picados a un tubo cónico de 50 mililitros. Agregue 10 mililitros de tampón de aislamiento de mitocondrias con 0,1 miligramos por mililitro y deje que la muestra se digiera en hielo durante 10 minutos. Tenga en cuenta que el uso de tripsina aumenta el rendimiento de mitocondrias aisladas y debe mantenerse constante entre la preparación mitocondrial.

Sin embargo, recomendamos probar la funcionalidad de las mitocondrias aisladas en preparaciones obtenidas en ausencia de tripsina para garantizar que la enzima no interfiera con sus iones. Después de la incubación, agregue 10 mililitros de tampón de aislamiento de mitocondrias que contenga 0.1% libre de ácidos grasos, BS, a y cinco miligramos de inhibidor de tripsina y mezcle invirtiendo el tubo varias veces Para neutralizar la tripsina, recupere el tejido digerido a velocidad baja a media. Centrifugación durante un minuto de cuatro grados centígrados.

Después del centrifugado Resus, suspenda el tejido en ocho mililitros de tampón de aislamiento de mitocondrias con BSA libre de ácidos grasos al 0,1%, manteniendo la muestra en hielo. Utilice un homogeneizador de baile motorizado con un mortero de teflón para homogeneizar la muestra con cuatro a seis pasadas a 1, 200 a 1, 400 RPM. Transfiera el homogeneizado a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 800 veces G durante 10 minutos de cuatro grados centígrados.

Para pellet los núcleos y restos de tejido. Después del centrifugado, recupere el supinato que contiene las mitocondrias en tubos de microcentrífuga y centrifuérrelos a 8.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Después del centrifugado, la bolita tendrá una capa blanca encima.

Utilice un sistema de vacío para aspirar y eliminar cuidadosamente la capa blanca en la parte superior del gránulo mitocondrial. A continuación, vuelva a suspender el pellet más oscuro restante, que contiene las mitocondrias en un mililitro de mitocondrias. Búfer de aislamiento.

A continuación, centrifugar las mitocondrias a 8.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el supinato y vuelva a suspender el pellet mitocondrial. En 150 microlitros de mitocondrias, tampón de aislamiento, mantiene las mitocondrias en hielo.

La respiración de las mitocondrias aisladas se mide con un electrodo de oxígeno oxitérmico conectado a una computadora y controlado por oxi. El software plus, el electrodo de oxígeno, debe calibrarse el día del experimento. Agregue dos mililitros de tampón de respiración mitocondrial que contenga una concentración final de un micromolar de rotenona a la cámara, selle la cámara y comience a registrar la señal de oxígeno.

La señal registrada por el sistema y mostrada en la pantalla de la computadora es proporcional a la concentración de oxígeno en la cámara oxitérmica. Una vez que la señal de oxígeno esté estable, agregue 250 microgramos de mitocondrias y registre la respiración basal durante un minuto. La respiración en este punto debe ser muy baja ya que las mitocondrias aspiran a sustratos endógenos.

Este es el estado uno de la respiración. Agregue succinato a una concentración final de cinco milimolares para iniciar la respiración mitocondrial en el complejo dos y registrar la señal durante un minuto. El consumo de oxígeno debe aumentar durante el estado dos de la respiración.

Para inducir el estado de respiración, agregue un DP a una concentración final de 150 micromolares. En este punto, el consumo de oxígeno debería aumentar debido a una síntesis de TP a través de la fosforilación oxidativa. Registre la señal hasta que la respiración se ralentice, lo que indica un consumo de DP y la transición al registro de respiración de estado cuatro.

Estado cuatro, respiración durante al menos un minuto. Añada CCCP a una concentración final de un micromolar y registre la señal durante un minuto. En este punto, la respiración desacoplada debe ser máxima.

Calcule la relación de control respiratorio dividiendo la tasa de consumo de oxígeno durante el estado tres. Respiración por la tasa de consumo de oxígeno durante el estado cuatro, la respiración un RCR objetivo debe ser mayor que cuatro. A continuación, para evaluar la integridad de la membrana mitocondrial, induzca la respiración en el estado tres en una nueva muestra de mitocondrias añadiendo un DP a una concentración final de un milimolar.

A continuación, registre el consumo de oxígeno durante un minuto, añada 10 micromolares de citocromo C y registre el consumo de oxígeno durante dos o tres minutos. Dado que el citocromo C es impermeable a las membranas mitocondriales intactas en una buena preparación mitocondrial, no habrá aumento o habrá un aumento muy pequeño en la respiración. Un aumento en la respiración indica membranas mitocondriales rotas o dañadas.

La instrumentación para la medición multiparamétrica de la apertura del puerto de transición de permeabilidad mitocondrial consiste en un fluorímetro de espectrometría de doble emisión maestro cuántico controlado por el programa Felix GX. Utilizando el programa Felix GX, cree un protocolo de adquisición multidi e introduzca los parámetros para la medición del potencial de membrana mitocondrial de calcio y el hinchamiento para la proporción de colorantes métricos, Forer y JC uno generan las trazas derivadas para una proporción y JC una proporción en una mezcla de metanfetamina desechable de cuatro lados ACRL vete un tampón de ensayo de mitocondrias de un mililitro con una concentración final de un rotenona micromolar, cinco milimolares de succinato y 800 nanomolares. Para un FF, agregue 250 microgramos de mitocondrias y coloque la muestra en el compartimiento de muestras del espectrofluorímetro.

Comience a registrar las señales fluorescentes después de un minuto, pause la adquisición, agregue 500 nanomolares JC uno y luego reinicie la adquisición. La señal de relación JC uno debe aumentar, lo que indica la absorción de la muerte por parte de las mitocondrias activas. Continúe grabando hasta que la señal JC uno haya alcanzado una meseta.

Por lo general, dentro de los cinco minutos, agregue cloruro de calcio hasta una concentración final de 20 micromolares. Se debe observar un aumento instantáneo en la señal de la relación FF de flúor que representa una mayor presencia de calcio en el tampón del ensayo, seguido de una disminución gradual debido a la absorción de calcio mitocondrial. La señal de relación JC uno debe exhibir una breve disminución transitoria indicativa de una ligera despolarización de la membrana mitocondrial.

Cuando la señal de la relación FF del RE vuelve al nivel basal, generalmente dentro de uno a 1,5 minutos en otros 20 micromolares de cloruro de calcio, continúe pulsando a intervalos fijos hasta que las mitocondrias no puedan acumular calcio y comiencen a liberar calcio en el tampón del ensayo. La apertura del puerto de transición de permeabilidad mitocondrial se visualiza mediante el aumento simultáneo de la señal de la relación URA FF debido a la liberación de calcio. Una disminución en la relación de señal JC uno debido al colapso del potencial de membrana y una disminución en la dispersión de la luz debido a la hinchazón mitocondrial mientras se aísla de ratones C 56 black six J.

Como se muestra en este video, el consumo de oxígeno se midió durante la respiración del estado tres en presencia de succinato y un DP y durante la respiración del estado cuatro después de un consumo de DP como se muestra aquí, una adición de DP aumenta el consumo de oxígeno debido a la fosforilación oxidativa y el consumo de oxígeno se ralentiza. Una vez que se ha consumido toda una DP, la respuesta de las mitocondrias aisladas al desacoplamiento se mide mediante la adición de CCCP en presencia de CCCP. La tasa de consumo de oxígeno es mayor que durante la respiración en el estado tres para evaluar la integridad de la membrana de las mitocondrias aisladas.

El consumo de oxígeno se midió en presencia de succinato y un DP y después de la adición de citocromo C.As se observa aquí, la adición de citocromo C no aumenta significativamente el consumo de oxígeno con respecto a un DP y succinato indica que las membranas mitocondriales intactas no son permeables al citocromo C para evaluar la transición de la permeabilidad mitocondrial, mala apertura en mitocondrias cardíacas aisladas como indicador de la capacidad de retención de calcio mitocondrial. Transición de permeabilidad mitocondrial. La mala apertura fue provocada por adiciones secuenciales de 20 micromolares.

El cloruro de calcio, el calcio extra mitocondrial y el potencial de membrana se midieron con los indicadores métricos de relación. URA FF se muestra como la traza verde y JC se muestra como la traza roja, la hinchazón de las mitocondrias se midió registrando la dispersión de la luz a 525 nanómetros mostrada por la traza negra. La especificidad de JC uno y las señales de hinchazón se probaron con un micromolar, CCCP y cinco microgramos por mililitro de la toxina microbiana etina como se puede ver aquí, la absorción de calcio por las mitocondrias se acompaña de una ligera despolarización de la membrana mitocondrial.

Después de cuatro pulsos de calcio, la apertura de la piscina de transición de permeabilidad mitocondrial se observa como un aumento en URA FF, lo que indica liberación de calcio. Una disminución en JC uno que indica un colapso del potencial de membrana y un aumento en el volumen de la matriz mitocondrial, que se observa como una reducción en la dispersión de la luz como marcador de hinchazón para verificar la especificidad de la permeabilidad mitocondrial, apertura del puerto de transición. Las mismas mediciones se realizaron en presencia de ciclosporina A, que se une al componente de transición de permeabilidad mitocondrial PO ciclofillina D.As se muestra en esta figura, la presencia de un ciclista micromolar perforando A aumenta el número de pulsos de cloruro de calcio necesarios para abrir la transición de permeabilidad mitocondrial PO en comparación con la muestra de control.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la apertura del puerto de transición de permeabilidad mitocondrial en mitocondrias cardíacas aisladas. El aspecto más difícil de este procedimiento es la obtención de mitocondrias aisladas de buena calidad. Por lo tanto, es importante realizar mediciones de control de calidad antes de usar mitocondrias para experimentos posteriores.