Multi-parámetro de medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad en el corazón del ratón mitocondrias aisladas

El objetivo de este video es describir un procedimiento para caracterizar la transición de permeabilidad mitocondrial. Apertura deficiente en mitocondrias aisladas del corazón de ratón. Primero, se aíslan mitocondrias de corazones de ratón.

Mediante el método de centrifugación diferencial, se evalúa luego la calidad de las mitocondrias aisladas utilizando un electrodo de oxígeno térmico conectado a un ordenador para medir la relación de control respiratorio y evaluar la integridad de la membrana mitocondrial. A continuación, mediante el uso de instrumentación espectrofluorométrica, se realizan mediciones simultáneas del manejo de calcio, del potencial de la membrana mitocondrial y del volumen mitocondrial para determinar la transición de permeabilidad. Apertura deficiente.

Los datos obtenidos mostraron diferencias en la capacidad de retención de calcio y en la transición de permeabilidad mitocondrial. Baja sensibilidad de las mitocondrias aisladas, apertura de la transición de permeabilidad mitocondrial. La formación del poro es un fenómeno complejo que implica cambios a varios niveles en la fisiología y la anatomía mitocondrial.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que la medición simultánea de múltiples parámetros ofrece una imagen más completa del fenómeno que la medición individual de parámetros aislados, como el calcio, la movilización o la hinchazón. Antes de comenzar el procedimiento, descongele el tampón de aislamiento mitocondrial y verifique el pH, que debe ser 7,4. Luego, coloque todos los tampones, placas y tubos que se utilizarán sobre hielo. Tenga en cuenta que todos los pasos del protocolo de aislamiento de mitocondrias deben realizarse sobre hielo.

Coloque los corazones de los ratones sacrificados en una placa de Petri y enjuague toda la sangre con tampón frío de aislamiento de mitocondrias. A continuación, transfiera los corazones a una nueva placa de Petri utilizando una hoja, retire la grasa y las aurículas, y luego pique los corazones hasta obtener un producto homogéneo.

Transfiera los corazones picados a un tubo cónico de 50 mililitros. Añada 10 mililitros de tampón de aislamiento de mitocondrias con tripsina al 0,1 miligramo por mililitro y deje que la muestra se digiera en hielo durante 10 minutos. Tenga en cuenta que el uso de tripsina aumenta el rendimiento de mitocondrias aisladas y debe mantenerse constante entre los diferentes preparados mitocondriales.

Sin embargo, recomendamos probar la funcionalidad de las mitocondrias aisladas en preparaciones obtenidas en ausencia de tripsina para asegurarse de que la enzima no interfiera con sus iones. Después de la incubación, agregue 10 mililitros de tampón de aislamiento de mitocondrias que contenga 0,1% de albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos y cinco miligramos de inhibidor de tripsina, y mezcle invirtiendo el tubo varias veces para neutralizar la tripsina. Recupere el tejido digerido mediante centrifugación a baja o velocidad media durante un minuto a cuatro grados Celsius.

Después de la centrifugación, suspenda el tejido en ocho mililitros de tampón de aislamiento de mitocondrias con BSA libre de ácidos grasos al 0,1 %, manteniendo la muestra en hielo. Utilice un homogenizador motorizado con un pistilo de teflón para homogenizar la muestra con cuatro a seis pasadas a 1.200-1.400 rpm. Transfiera el homogenato a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 800 ×g durante 10 minutos a 4 grados Celsius.

Para obtener el sedimento de núcleos y restos de tejido. Tras la centrifugación, recupere el sobrenadante que contiene las mitocondrias en tubos de microcentrífuga y centrifúgelos a 8.000 × g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Después de la centrifugación, el sedimento presentará una capa blanca en su superficie.

Utilice un sistema de vacío para aspirar y eliminar cuidadosamente la capa blanca situada encima del pellet mitocondrial. A continuación, vuelva a suspender el pellet más oscuro restante, que contiene las mitocondrias, en un mililitro de tampón de aislamiento de mitocondrias.

A continuación, centrifugue las mitocondrias a 8.000 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Descarte el sobrenadante y resuspenda el sedimento mitocondrial en 150 microlitros de tampón de aislamiento de mitocondrias. Mantenga las mitocondrias en hielo.

La respiración de mitocondrias aisladas se mide con un electrodo térmico de oxígeno conectado a una computadora y controlado por el software Oxy. El electrodo de oxígeno debe calibrarse el día del experimento. Añada dos mililitros de tampón de respiración mitocondrial que contenga una concentración final de un micromolar de rotenona a la cámara del aparato, selle la cámara e inicie el registro de la señal de oxígeno.

La señal registrada por el sistema y mostrada en la pantalla del ordenador es proporcional a la concentración de oxígeno en la cámara de oxitermia. Una vez que la señal de oxígeno sea estable, añada 250 microgramos de mitocondrias y registre la respiración basal durante un minuto. En este punto, la respiración debe ser muy baja, ya que las mitocondrias están respirando sobre sustratos endógenos.

Esta es la respiración en estado uno. Añada succinato hasta una concentración final de cinco milimolares para iniciar la respiración mitocondrial en el complejo dos y registre la señal durante un minuto. El consumo de oxígeno debe aumentar durante la respiración en estado dos.

Para inducir la respiración en estado activo, añada un DP hasta una concentración final de 150 micromolar. En este punto, el consumo de oxígeno debería aumentar debido a la síntesis de TP mediante fosforilación oxidativa. Registre la señal hasta que la respiración disminuya, lo que indica el consumo de DP y la transición a la respiración en estado cuatro; registre este estado.

Estado cuatro, respiración durante al menos un minuto. Añada CCCP hasta una concentración final de un micromolar y registre la señal durante un minuto. En este punto, la respiración desacoplada debe ser máxima.

Calcule la relación de control respiratorio dividiendo la tasa de consumo de oxígeno durante la respiración en estado tres por la tasa de consumo de oxígeno durante la respiración en estado cuatro; una relación de control respiratorio (RCR) objetivo debe ser mayor que cuatro. A continuación, para evaluar la integridad de la membrana mitocondrial, induzca la respiración en estado tres en una nueva muestra de mitocondrias añadiendo ADP hasta una concentración final de un milimolar.

Luego registre el consumo de oxígeno durante un minuto, agregue citocromo C de 10 micromolar y registre el consumo de oxígeno durante dos a tres minutos. Dado que el citocromo C es impermeable a las membranas mitocondriales intactas en una preparación mitocondrial adecuada, no habrá un aumento o solo un aumento muy pequeño en la respiración. Un incremento en la respiración indica membranas mitocondriales rotas o dañadas.

El instrumental para la medición multiparamétrica de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial consiste en un espectrofluorímetro dual de emisión Quantum Master controlado por computadora mediante el programa Felix GX. Utilizando el programa Felix GX, cree un protocolo de adquisición multidi e introduzca los parámetros para la medición del potencial de membrana mitocondrial, hinchazón y calcio para los colorantes ratiométricos, Forer y JC-1; genere las trazas derivadas para la relación Forer y la relación JC-1 en una cubeta desechable de cuatro caras de metacrilato. Mezcle un mililitro de tampón de ensayo de mitocondrias con una concentración final de un micromolar de rotenona, cinco milimolares de succinato y 800 nanomolares de Fora FF, agregue 250 microgramos de mitocondrias y coloque la muestra en el compartimento de muestra del espectrofluorímetro.

Comience a registrar las señales fluorescentes después de un minuto, detenga la adquisición, agregue 500 nanomolar de JC uno y luego reanude la adquisición. La señal de la relación JC uno debe aumentar, lo que indica la incorporación por mitocondrias activas. Continúe registrando hasta que la señal de JC uno haya alcanzado una meseta.

Generalmente dentro de los cinco minutos, añada cloruro de calcio hasta una concentración final de 20 micromolares. Se debería observar un aumento instantáneo en la señal de la relación de Fluor FF, que representa un incremento en la presencia de calcio en el tampón de ensayo, seguido por una disminución gradual debida a la captación mitocondrial de calcio. La señal de la relación JC uno debería mostrar una breve disminución transitoria, indicativa de una ligera desolarización de la membrana mitocondrial.

Cuando la señal de la relación ER FF regresa al nivel basal, generalmente dentro de uno a 1,5 minutos con otros 20 micromoles de cloruro de calcio, continúe aplicando pulsos a intervalos fijos hasta que las mitocondrias no puedan acumular calcio y comiencen a liberarlo al tampón del ensayo. La apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial se visualiza mediante un aumento concurrente en la señal de la relación URA FF debido a la liberación de calcio. Una disminución en la relación de señal JC uno causada por el colapso del potencial de membrana y una reducción en la dispersión de luz debida a la hinchazón mitocondrial mientras se aíslan de ratones C 56 negro seis J.

Como se muestra en este video, el consumo de oxígeno se midió entonces durante la respiración en estado tres en presencia de succinato y ADP, y durante la respiración en estado cuatro después del consumo de ADP. Como se indica aquí, la adición de ADP aumenta el consumo de oxígeno debido a la fosforilación oxidativa, y el consumo de oxígeno disminuye. Una vez que todo el ADP ha sido consumido, se mide la respuesta de las mitocondrias aisladas al desacoplamiento mediante la adición de CCCP en presencia de CCCP. La velocidad de consumo de oxígeno es mayor que durante la respiración en estado tres, para evaluar la integridad de la membrana de las mitocondrias aisladas.

El consumo de oxígeno se midió en presencia de succinato y un DP, y tras la adición de citocromo C. Como se observa aquí, la adición de citocromo C no aumenta significativamente el consumo de oxígeno con respecto al DP y el succinato, lo que indica que las membranas mitocondriales intactas no son permeables al citocromo C. Para evaluar la transición de permeabilidad mitocondrial, la apertura de la pore de permeabilidad mitocondrial en mitocondrias cardíacas aisladas se utilizó como indicador de la capacidad de retención de calcio mitocondrial. La apertura de la pore de permeabilidad mitocondrial se indujo mediante adiciones secuenciales de 20 micromoles.

El cloruro de calcio, el calcio extramitocondrial y el potencial de membrana se midieron con indicadores ratiométricos. URA FF se muestra como la traza verde y JC uno se muestra como la traza roja. La hinchazón de las mitocondrias se midió registrando la dispersión de la luz a 525 nanómetros, mostrada por la traza negra. La especificidad de las señales de JC uno y de hinchazón se probó con un micromolar de CCCP y cinco microgramos por mililitro de la toxina microbiana etin, como puede observarse aquí. La captación de calcio por las mitocondrias va acompañada de una ligera despolarización de la membrana mitocondrial.

Después de cuatro pulsos de calcio, la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial se observa como un aumento en la FF de URA, lo que indica la liberación de calcio. Una disminución en JC-1 indica el colapso del potencial de membrana y un aumento en el volumen de la matriz mitocondrial, lo cual se observa como una reducción en la dispersión de la luz como marcador de hinchazón, para verificar la especificidad de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial. Las mismas mediciones se realizaron en presencia de ciclosporina A, que se une al componente ciclofilina D del poro de transición de permeabilidad mitocondrial. Como se muestra en esta figura, la presencia de un micromolar de ciclosporina A aumenta el número de pulsos de cloruro de calcio necesarios para abrir el poro de transición de permeabilidad mitocondrial en comparación con la muestra control.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial en mitocondrias cardíacas aisladas. El aspecto más difícil de este procedimiento consiste en obtener mitocondrias aisladas de buena calidad. Por lo tanto, es importante realizar mediciones de control de calidad antes de utilizar las mitocondrias en experimentos posteriores.