Name: Visualización mejorada de metástasis pulmonares en la Resolución sola célula en ratones por Combinada In-situ La perfusión del tejido pulmonar y X-Gal tinción de LacZ-Etiquetados células tumorales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Aprende a detectar metástasis pulmonares a nivel de célula única en ratones mediante perfusión in situ y tinción X-Gal de células tumorales LacZ. Este protocolo mejora la visibilidad eliminando el fondo sanguíneo.

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Los autores desean agradecer al Dr. Lubor Borsig (Instituto de Fisiología de la Universidad de Zurich) por sus consejos sobre la técnica de perfusión pulmonar. Este trabajo fue apoyado por becas de la Krebsliga del Cantón de Zurich, el L. Walter y Johanna Wolf Foundation, Zurich, la Fundación Lydia Hochstrasser, Zurich, la Swiss National Science Foundation, SNF, Suiza, el Balgrist Schweizerischer Verein, y la Universidad de Zurich.

1. In-situ de perfusión pulmonar y fijación <ol><li> Anestesiar a ratones por inyección ip de ~ 150 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 112,5 mg / kg (peso corporal) de ketamina, xilazina 16,5 mg / kg, y 15 mg / kg de acepromazina (o por otro que contiene anestesia asesinos apropiadas dolor). </li><li> Cuando los reflejos del ratón ya no se observan, fijarlo a la mesa de operaciones de back-abajo y humedecer la piel con un 70% de etanol a la mancha de los pelos hacia abajo. </li><li> Abra la piel del abdomen hasta el cuello y tirar de ella hacia los lados o eliminarlo. </li><li> Abra el peritoneo y el tórax de un tamaño amplio. Prevenir ruptura de los vasos grandes (por ejemplo, la vena yugular) para evitar la reducción de la eficiencia de la perfusión posterior. </li><li> Cortar el caudalis vena cava por debajo del hígado. </li><li> Use una jeringa de 20 ml equipado con un 21G - 24G aguja para inyectar despacio 10-15 ml de PBS en el ventrículo derecho del corazón batiendo hasta que el pulmón es completamente blanco yel corazón deja de latir (asistolia). </li><li> Pellizque de los vasos sanguíneos por encima del hígado y el diafragma con una pinza vascular. </li><li> Usar una jeringa de 10 ml equipado con un 21G - 24G aguja para inyectar ~ 2 ml de 3% de paraformaldehído (PFA) en PBS en el ventrículo derecho. </li><li> Descubre la tráquea fuera del tórax. Usar la misma jeringa para inyectar ~ 3 ml de 3% de PFA en PBS craneal (fuera de tórax) en la tráquea hasta que el pulmón se infla. Inmediatamente después de la retirada de la aguja, pellizcar el caudal tráquea de la punción con una pinza vascular y esperar 10 minutos para permitir la fijación. </li><li> Transecto los vasos sanguíneos por encima de la pinza vascular, quitar la abrazadera y inyectar ~ 2 ml de PBS en el ventrículo derecho a eliminar el exceso de PFA. </li><li> Perforar las partes más bajas de todos los lóbulos pulmonares con una aguja, retirar la abrazadera vascular de la tráquea y se inyectan 3-5 ml de una solución de PolyFreeze medio de inclusión / PBS 1:1 en la tráquea caudal de la primera punción hasta que el PFA en la pulmónlóbulos se sustituye por la solución. </li><li> Eliminar el pulmón cuidadosamente tirando del corazón con un fórceps y por transección ligamentos de tejido conectivo, vasos sanguíneos y la tráquea. Mantener el corazón conectado a los pulmones. </li><li> Dependiendo de la forma de proceder con el análisis del tejido pulmonar continuar con los protocolos descritos en las secciones 2 o 3. Si usted quiere hacer ambos análisis, extraer un lóbulo pulmonar y siga el procedimiento descrito en el punto 3. Procesar los lóbulos restantes conectados al corazón como se describe en 2. </li></ol> 2. Visualización de lacZ-etiquetados células tumorales metastásicas en los lóbulos de pulmón completo <ol><li> Coloque el pulmón en un vaso de plástico con tapa de cierre hermético y fijarla con 2% de formaldehído en PBS a temperatura ambiente durante 30-60 min. </li><li> Elimine la solución de fijación y lavar a fondo 3 veces con PBS. </li><li> Añadir al menos 10 ml recién preparada de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido (X-Gal) solución de tinción (X-Gal solución madre de [40 mg / ml enDimetilformamida] 1:40 diluido en solución de tinción Basic, pH 7,1 (Tabla 1); proteger de la luz). </li><li> Poner un trozo de gasa en la parte superior del pulmón natación para mantenerlo completamente en la solución y colocar la tapa sólo débilmente en el bote para permitir el intercambio de aire. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 3-5 h protegida de la luz. </li><li> Retire X-Gal solución, se lava una vez con PBS para eliminar los residuos de X-Gal solución (opcional) y añadir un 4% PFA. </li></ol> 3. Visualización de lacZ-etiquetados células tumorales metastásicas en pulmón criosecciones <ol><li> Prefill una incrustación de etiquetado molde a 1/3 con medio sin diluir incrustación PolyFreeze. Ponga el lóbulo pulmonar en la parte superior y se llenan de medio de inclusión hasta el lóbulo está completamente cubierto. Trate de evitar burbujas. </li><li> Incubar los pulmones incrustados a 4 º C durante 20 min. </li><li> Luego congelar los pulmones incrustados lentamente en una mezcla de hielo seco y isopentano y almacenar a -80 ° C. </li><li> Cortar 7-10 micras criosecciones en un criostato y montarlos en portaobjetos de microscopio SuperFrostPlus. </li><li> Incubar las secciones inmediatamente con solución de tinción X-Gal a 37 ° C durante 24 horas en una cámara humidificada. </li><li> Enjuagar los portaobjetos en PBS 2 veces durante 5 min y, a continuación brevemente en agua destilada. </li><li> Contra-tinción con rojo nuclear rápido durante 10-30 segundos, enjuague en agua destilada y montar las diapositivas con Immu-Mount. </li></ol> 4. Los resultados representativos Asai et al. Publicado en el artículo original en el modelo de Dunn-derivado LM8 ratón OS que los tumores sc primarios derivados de las células parentales Dunn, diferentes de los derivados de la altamente metastásico LM8 línea celular sub, no forman espontáneamente metástasis pulmonares detectables en syngeneic ratones C3H 14. Con las técnicas aquí reportados, se volvió a investigar la formación de metástasis en los modelos de ratón Dunn/LM8 OS. Nos aprovechamos de estable-lacZ transduced Dunn y celular LM8s y de un protocolo de perfusión pulmonar in-situ y fijación en ratones. Imágenes representativas de los pulmones perfundidos y no perfundido-de ratones por vía subcutánea inyectados con lacZ-transducidas y no transducidas de control Dunn y células LM8 se muestra en la figura 1. En los ratones inyectados con células de control Dunn, metástasis macroscópicas y microscópicas se mantuvo indetectable en los pulmones no perfundido y perfundido (Figura 1A, i-iv). Pero, curiosamente, en ratones inyectados con células Dunn-lacZ, X-gal tinción reveló azul micrometastásica focos de células individuales o de pequeños grupos de células (&lt;0,1 mm) en la superficie de la no perfundidos pulmones (Figura 1A, vi). En- perfusión in situ y la fijación de los pulmones mejora aún más la capacidad de detección de micrometástasis Dunn-lacZ (Figura 1A, viii). Sin embargo, a consecuencia macroscópica focos no se observó (Figura 1A, V, VII). &lt;/ P&gt; En los ratones inyectados con células de control LM8, translúcido, apenas detectable macrometastatic focos mayor que 0,1 mm de diámetro fueron reconocidas en no perfundidos pulmones (Figura 1B, i). Perfusión del pulmón (Figura 1B, iii) no mejora la detección de los focos. Sin embargo, en ratones inyectados con células LM8-lacZ múltiples X-Gal manchado azul macro-(Figura 1B, v) y micrometástasis (Figura 1B, vi) se detectaron en la superficie de la no perfundidos órganos. Además, la perfusión de los pulmones mejora aún más la detectabilidad de macro-y micro-metástasis (Figura 1B, vii - viii). Por consiguiente, los micro-y macrometástasis se hizo visible a una densidad mayor y un número mayor, principalmente debido a la translucidez del tejido perfundido en el que los focos debajo de la superficie del órgano se convirtió también visible. Una hora adicionalanálisis istological utilizando criosecciones de tejido pulmonar confirmó la detectabilidad mejorada de metástasis pulmonares en los ratones inyectados con lacZ-transducidas Dunn y células LM8. En los ratones con tumores primarios derivados de Dunn-lacZ o células LM8-lacZ, a diferencia de en los ratones con tumores primarios de las células de control respectivos, micrometástasis o células incluso solo focos fueron reconocidos en secciones de pulmón (Figura 2). Además, macrometástasis eran también más claramente visible en los ratones inyectados con células LM8-lacZ que en los animales inyectados con el control LM8 células (Figura 2C, D). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig1.jpg" /> Figura 1. Detección de metástasis espontáneas de no transducidas (i-iv) y lacZ-transducidas (v-viii) Dunn (A) y LM8 (B) en las células no perfundido (i, ii, v, vi) y perfundido (iii, iv, vii, viii) los pulmones en ratones C3H. Metástasis en representante de X-Gal-staINED pulmones enteros (v, vii en A y B) y los respectivos primeros planos (VI, VIII en A y B) aparecen en azul. Macrometastatic focos (&gt; 0,1 mm) en los órganos de ratones inyectados con los no etiquetados LM8 células (i-iv en B) se indican con asteriscos. Las áreas que se muestran en los primeros planos son representativos de los pulmones enteros. Las barras de escala indican 1 mm en las imágenes de todo el pulmón y 0,1 mm en los primeros planos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4162/4162fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig2.jpg" /> Figura 2. Detección de Dunn y LM8 micrometástasis en criosecciones de pulmón. Las secciones de tejido embebido octubre de pulmón se incubaron en solución de X-Gal tinción a 37 ° C durante 24 horas en una cámara húmeda y luego se contratiñeron con rojo nuclear rápido. Las flechas apuntan a micrometastásica focos reconocida en secciones de pulmón de ratones inyectados con Dunn-lacZ (B) o LM8-lacZ células (D). Micrometastases se mantuvo indetectable en secciones de pulmón de ratones inyectados con no transducidas Dunn (A) o LM8 células (C). Las barras de escala indican 0,1 mm.

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Los resultados presentados aquí en el modelo de ratón Dunn/LM8 OS demostrar el poder del método recién establecido que combina la tinción X-Gal de lacZ-etiquetados células tumorales con la perfusión in situ / fijación de tejido pulmonar. Esta combinación de las dos técnicas permite la detección de alta sensibilidad de las lesiones micrometastásicas a nivel de células individuales y también mejora la visualización de macrometástasis sobre la superficie del pulmón (Figura 1), así como en secciones de pulmón (Figura 2). Mientras que la tinción con X-Gal permite también la detección de (micro) metástasis en otros órganos, la perfusión in situ / fijación mejora la detectabilidad de los focos metastásicos en otros tejidos de los pulmones sólo ligeramente por el color natural de la sangre y de los tejidos relacionada de estos 13 órganos. Incluso si la perfusión se dirige a otro órgano, por ejemplo, el hígado, la eliminación de la sangre sería sólo parcialmente mejorar la apuesta contrasteween X-Gal tinción y el color natural del órgano. Sin embargo, el método es aplicable a cualquier tipo de lacZ-etiquetados células tumorales, dramáticamente mejorar la detectabilidad de las metástasis de pulmón hasta el nivel de una sola célula latentes micrometástasis y permite una cuantificación sencilla y fiable de macro y micrometástasis. Una limitación de este método y todas las otras técnicas que se basan en los genes indicadores, que incluyen proteínas de luciferasa y fluorescentes, es la estabilidad de la expresión del transgén. Como se muestra en la Figura 2d, no todas las células del tumor dentro de los focos macrometastatic se tiñen de azul, lo que indica una falta de actividad de beta-galactosidasa. Esto podría estar relacionado con la necrosis, pero es más probable debido a la pérdida de la expresión del transgen. Hemos observado que el Dunn y células LM8 son muy eficaces en la regulación a la baja de lacZ y otros transgenes, incluso bajo selección continua para la expresión. Por lo tanto, conmutada en estudios recientes para el murino K12y K7M2 y los HOS humanos 143B, y SAOS-2 líneas celulares de osteosarcoma, todos los cuales mantienen estable la expresión de lacZ in vitro así como in vivo hasta el 100% en el tiempo. Una vez estable-lacZ expresión está garantizada, esta técnica se puede aplicar en estudios con manipuladas gen de las células tumorales, por ejemplo, para investigar mecánicamente el proceso de colonización del tejido 13, así como para el desarrollo y la prueba de nuevas terapias destinadas a la erradicación de las lesiones metastásicas 15 , 16. Además, puede servir como punto de referencia para la mejora de las actuales técnicas de imagen radiológicas, como el PET, CT (micro) y la resonancia magnética, que se utiliza para la detección precoz de las lesiones metastásicas. En un estudio reciente de PET (sin publicar) con diferentes trazadores se verificó en el pulmón in vivo detectó metástasis in vivo posteriormente ex con el protocolo descrito. En un estudio en curso con un nuevo animal pequeño micro-CT (SkyScan) estamos tan lejos abLe para detectar metástasis pulmonares in vivo a un tamaño de 0,5 mm y ex vivo a 0,3 mm, pero apuntamos a una resolución de 0,1 mm. Curiosamente, este es el límite de tamaño que establecerse para distinguir los macro-de micrometástasis con el método combinado de perfusión in situ y tinción con X-Gal. Esto subraya de nuevo la sensibilidad y la utilidad de esta técnica fácil y rentable.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Narketan10 (ketamina) </td><td> Vétoquinol AG </td><td></td><td> 100 mg / ml de solución </td></tr><tr><td> Xylazin (xilazina) </td><td> Streuli Pharma AG </td><td></td><td> 20 mg / ml de solución </td></tr><tr><td> Prequilan (acepromacina) </td><td> Fatro SpA </td><td></td><td> 10 mg / ml de solución </td></tr><tr><td> Bulldog Tipo Serrefine clamp vascular </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 18051-35 </td><td> mm curvada, 35 </td></tr><tr><td> Taza de plástico con tapa </td><td> Semadeni </td><td> 2988 </td><td> 25 tazas ml con tapa </td></tr><tr><td> 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido (X-gal); polvo </td><td> Axxora </td><td> ALX-582-002-G005 </td><td> se disuelven en N, N-di-metilformamida a 40 mg / ml, tienda protegido de la luz a -20 º C </td></tr><tr><td> Solución de tinción de base, se equilibró a pH 7,1, almacenado protegido de la luz a 4 º C durante max. 1 mes </td><td> hecho a sí mismo </td><td></td><td> 100 ml / l 10xPBS, 1,64 g / L K3Fe (CN) 6, 2,1 g / L K4Fe (CN) 6, 2 ml / L MgCl2 1 M, 2 ml / L 10% NP40, 1 ml / L 10% Sodio-desoxicolato </td></tr><tr><td> PolyFreeze medio de inclusión </td><td> Polysciences; suizo distribuidor: Brunschwig </td><td> 19636-1 </td><td></td></tr><tr><td> Incrustación de molde </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato Leica CM1850 </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost diapositivas </td><td> Menzel </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Nuclear-Fast Red - solución de sulfato de aluminio </td><td> División Chroma Waldeck GmbH &amp; Co KG distributor: Medite </td><td> 84-0241-00 </td><td></td></tr><tr><td> Immu-Mount </td><td> Thermo Electron, distribuidor suizo: Histocom </td><td> 9990412 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Reactivos y Equipos.

visualización mejorada de metástasis pulmonares en la resolución sola célula en ratones por combinada<em&gt; in-situ</em&gt; la perfusión del tejido pulmonar y x-gal tinción de<em&gt; lacz</em&gt;-etiquetados células tumorales

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

La metástasis es la principal causa de muerte en la mayoría de tipos de cáncer y, en consecuencia un enfoque principal en la investigación del cáncer. Sin embargo, la detección de micrometástasis por las imágenes radiológicas y el éxito en su erradicación terapéutico siguen siendo limitados. Mientras que los modelos animales han demostrado ser herramientas invaluables para la investigación del cáncer 1, el monitoreo / visualización de micrometástasis sigue siendo un reto y evaluación inexacta de la diseminación metastásica en estudios preclínicos potencialmente conduce a resultados decepcionantes en ensayos clínicos 2. Por consiguiente, existe un gran interés en el perfeccionamiento de los métodos para permitir finalmente la detección reproducible y fiable de las metástasis hasta el nivel de células individuales en el tejido normal. El objetivo principal es por lo tanto en las técnicas, que permiten la detección de células tumorales in vivo, como micro-tomografía computarizada (micro-CT), tomografía por emisión de positrones (PET), bioluminiscencia o imágenes de fluorescencia &lt;sup&gt; 3,4. Actualmente estamos optimizando estas técnicas para monitorización in vivo de crecimiento de tumores primarios y metástasis en modelos diferentes de osteosarcoma. Algunas de estas técnicas también se pueden utilizar para el análisis ex vivo de metástasis a los métodos clásicos como qPCR 5, 6 FACS o diferentes tipos de tinción histológica. Como punto de referencia, se han establecido en el presente estudio de la transfección o transducción estable de células tumorales con el gen lacZ que codifica la enzima bacteriana β-galactosidasa que metaboliza el sustrato cromogénico 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D -galactopiranósido (X-Gal) con un tinte de índigo azul insoluble 7 y permite altamente sensible y selectiva tinción histoquímica azul de las células tumorales in vivo ex ratón tejido hasta el nivel de célula única, como se muestra aquí. Se trata de una herramienta de bajo costo y no al equipo de obra, que permite la validación precisa de metástasis en 8 estudios que evalúan un nuevoterapias ticancer 9-11. Un factor limitante de X-gal tinción es el bajo contraste con, por ejemplo relacionados con la sangre, así tinción roja de los tejidos vascularizados. En tejido pulmonar este problema puede ser resuelto por perfusión pulmonar in-situ, una técnica que se ha establecido recientemente por Borsig et al. 12 que perfundieron los pulmones de los ratones bajo anestesia para borrar de la sangre y para fijar e incrustarlos en-situ, en virtud inflación a través de la tráquea. Este método evita también el colapso del pulmón y por lo tanto mantiene la morfología funcional de los alvéolos pulmonares, lo que mejora la calidad del tejido para el análisis histológico. En el presente estudio, se describe un nuevo protocolo, que se aprovecha de una combinación de X-gal tinción de lacZ células tumorales que expresan e in-situ la perfusión y la fijación del tejido pulmonar. Este protocolo permite refinado de alta sensibilidad de detección de células metastásicas individuales en el pulmón y nos ha permitido, en un estudio reciente para detect &quot;latentes&quot; micrometástasis pulmonares en un modelo de ratón 13, que se describió originalmente para ser no metastásico 14.

El nuevo protocolo reportados en el presente estudio permite la detección selectiva de metástasis pulmonares en la celda de resolución única en ratones por combinada<em&gt; In situ</em&gt; Perfusión pulmonar y la tinción de fijación y X-Gal de<em&gt; LacZ</em&gt;-Etiquetados células tumorales.

Visualización mejorada de metástasis pulmonares en la Resolución sola célula en ratones por Combinada<em&gt; In-situ</em&gt; La perfusión del tejido pulmonar y X-Gal tinción de<em&gt; LacZ</em&gt;-Etiquetados células tumorales

La metástasis es la principal causa de muerte en la mayoría de los tipos de cáncer y, en consecuencia, un objetivo central en la investigación oncológica. Sin embargo, la detección de...

El objetivo general de este procedimiento es mejorar la detección de micro metástasis en pulmón de ratón ex vivo, mientras se conserva la arquitectura de los pulmones inflados. Esto se logra primero mediante la perfusión del pulmón in situ con PBS para eliminar la sangre, que es la principal fuente de fondo de color en ese tejido. Los siguientes pasos consisten en inflar el pulmón mediante inyección de PFA y luego ocluirlo para fijar el tejido pulmonar bajo inflación.A continuación, se extrae el pulmón y se fija adicionalmente en PFA, o bien se incluyen lóbulos pulmonares individuales para su inclusión en criosección. Los pasos finales consisten en teñir los tejidos con solución Xal y visualizar las células tumorales LA zag; finalmente, las metástasis pueden detectarse en lóbulos pulmonares completos o en secciones de tejido pulmonar, hasta el nivel de célula individual, mediante un microscopio binocular o un microscopio óptico. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la técnica de sky standing por sí sola, es que la detectabilidad de las micrometástasis mejora considerablemente debido a la eliminación del fondo relacionado con la sangre.Comience el protocolo anestesiando un ratón mediante una inyección intraperitoneal de ketamina, xilazina y acepromazina en aproximadamente 150 microlitros de PBS. Cuando ya no se observen los reflejos de dolor del ratón, fíjelo sobre la mesa de operaciones. Retire el vello y limpie con etanol al 70 %.Abrir la piel desde el abdomen hasta el cuello. Tirar de la piel hacia los lados o retirarla. Abrir cuidadosamente el peritoneo en el tórax para evitar la ruptura de grandes vasos como las venas yugulares.Esto mejorará la eficiencia de la perfusión. Ahora corte la vena cava cardis debajo del hígado utilizando una jeringa de 20 mililitros con una aguja de calibre 21 a 24. Inyecte lentamente 10 a 15 mililitros de PBS en el ventrículo derecho del corazón en movimiento hasta que el pulmón quede completamente blanco y el corazón deje de latir.Luego, ocluya los vasos sanguíneos por encima del hígado y el diafragma con un clamp vascular. Cargue una jeringa de 10 mililitros con paraformaldehído al 3% y, utilizando una aguja de calibre 21 a 24, inyecte en el ventrículo derecho. Aproximadamente dos mililitros.Descubra la tráquea fuera de la cavidad torácica e infle el pulmón mediante una inyección en la tráquea de aproximadamente tres mililitros de aldehído desde fuera de la cavidad torácica. Luego, inmediatamente después de retirar la aguja, ocluya la tráquea en el sitio de la punción con una pinza vascular y espere 10 minutos para permitir la fijación. A continuación, seccione los vasos sanguíneos por encima de la pinza vascular.Luego retire la pinza e inyecte aproximadamente dos mililitros de PBS en el ventrículo derecho para eliminar el formaldehído en exceso. Perfore con una aguja las partes inferiores de todos los lóbulos pulmonares y retire la pinza vascular de la tráquea. Ahora inyecte de tres a cinco mililitros de solución de inclusión diluida en la tráquea, administrada de forma similar a la otra inyección.Detenga la inyección cuando el paraformo que se encuentra en los lóbulos pulmonares sea reemplazado por la solución. Retire cuidadosamente el pulmón tirando del corazón con una pinza y seccionando los ligamentos de tejido conectivo, los vasos sanguíneos y la tráquea. Asegúrese de mantener el corazón conectado a los pulmones.Reserve un lóbulo para cortes en criosección y utilice el tejido pulmonar restante para la tinción completa del pulmón. Coloque el pulmón en un vaso de plástico con tapa hermética y fíjelo con formaldehído al 2 % en PBS. Coloque un trozo de gasa encima del pulmón para mantenerlo sumergido en la solución y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos.Después de media hora, retire la solución de fijación y lave el tejido exhaustivamente con PBS tres veces. Prepare frescamente la solución de Xal lista para usar diluyendo un mililitro de la solución stock de Xal, uno a 40, en la solución básica de tinción y agregue al menos 10 mililitros de esta solución al recipiente. Sumerja el pulmón con un trozo de gasa. Coloque la tapa flojamente para permitir el intercambio de aire e incube a 37 grados Celsius durante tres a cinco horas protegido de la luz.Después de la incubación, elimine la solución de xal. Enjuague los pulmones una vez con PBS para eliminar la solución de xal residual y agregue al menos 10 mililitros de paraformaldehído al 4 % en PBS. El tejido ya está listo para histología y puede almacenarse durante mucho tiempo en PFA al 4 % a cuatro grados Celsius.Comience llenando un tercio de un molde de inclusión con medio de inclusión poly forze sin diluir. Luego, coloque el lóbulo pulmonar en el molde y continúe agregando medio hasta que el lóbulo quede completamente cubierto. Evite cuidadosamente la formación de burbujas de aire y, a continuación, incube el lóbulo incluido a cuatro grados Celsius durante 20 minutos.A continuación, prepare los pulmones incluidos para su corte mediante congelación lenta en una mezcla de hielo seco y isopentano. Si es necesario, ahora pueden transferirse a un congelador de menos 80 grados Celsius para su almacenamiento. En un criostato, corte secciones criogénicas de siete a 10 micrómetros del lóbulo. Monte las secciones en portaobjetos disponibles comercialmente, listos para secciones criogénicas. Una vez montadas, incube inmediatamente las secciones en solución de tinción Xal a 37 grados Celsius durante 24 horas en una cámara humedecida. Al día siguiente, enjuague los portaobjetos con PBS dos veces, cinco minutos por cada enjuague.A continuación, realice un breve enjuague con agua destilada. Ahora contratiña los portaobjetos con rojo nuclear rápido durante 10 segundos para obtener una contratincción débil que haga que la xal sea más dominante, y enjuague inmediatamente la contratincción con agua destilada. Para una contratincción más intensa, prolongue el tiempo hasta 30 segundos o más.Monte las laminillas con inmuno montaje. Se volvió a investigar la formación de metástasis en los modelos de OS murinos con LM ocho. Utilizando las imágenes representativas descritas aquí de pulmones perfundidos y no perfundidos de ratones inyectados simultáneamente con células de LM ocho transducidas con laxy y no transducidas con control, y células inyectadas con células de control.Las metástasis macroscópicas y microscópicas permanecieron indetectables en los pulmones no perfundidos y perfundidos. Pero, de forma interesante, en los ratones inyectados con células dun LA Z, la tinción xgl reveló focos azules micrometastásicos de células individuales o pequeños grupos celulares en la superficie de los pulmones no perfundidos. La perfusión y fijación in situ de los pulmones mejoraron aún más la detectabilidad de las micrometástasis dun la z; sin embargo, no se observó crecimiento hacia focos macroscópicos en los ratones inyectados con células control LM ocho. En los pulmones no perfundidos, se reconocieron focos macrometásticos translúcidos, apenas detectables, mayores de 0,1 milímetros de diámetro. La perfusión del pulmón no mejoró la detección de estos focos.Sin embargo, en ratones inyectados con células LAC Z, se detectaron múltiples metástasis macroscópicas azules por tinción con X-gal en la superficie de órganos no perfundidos. También se detectaron metástasis microscópicas en la superficie de órganos no perfundidos. Además, la perfusión de los pulmones mejoró aún más la detección de metástasis macroscópicas y microscópicas.En consecuencia, las metástasis micro y macro se volvieron visibles con una densidad mayor y un tamaño más amplio, principalmente debido a la transparencia del tejido perfundido, en el cual también se hicieron visibles los focos situados debajo de la superficie del órgano. Un análisis histológico adicional mediante secciones criostáticas de tejido pulmonar confirmó la mayor detectabilidad de las metástasis pulmonares en ratones inyectados con células LAX Z transducidas y células LM ocho en ratones con tumores primarios derivados de células Dun LAX Z. Se identificaron metástasis microscópicas o incluso focos de células individuales en secciones pulmonares.Esto no se observó en ratones con tumores primarios de las células de control respectivas. Además, las metástasis macroscópicas también fueron más claramente visibles en ratones inyectados con células LM ocho LA C que en los animales con las células de control LM ocho. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la perfusión y fijación pulmonar en ZI dos y la posterior tinción de la metástasis en los pulmones extirpados.Esta técnica es un método altamente sensible para evaluar la distribución de metástasis en el pulmón en cualquier tipo de estudio de cáncer, y también puede servir como referencia para mejorar las técnicas actuales de imagen in vivo, como la micro-TC, la PET y la RMN utilizadas en la detección temprana de lesiones metastásicas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Se describe un método para la formación de imágenes respuesta a tratamiento contra el...

Imágenes en directo de las respuestas de drogas en el microambiente tumoral en modelos de ratón de cáncer de mama

Se describe un método relativamente simple para ex vivo de imágenes en vivo de las interacciones célula-estroma tumoral dentro de la metástasis de pulmón, utilizando reporteros fluorescentes en ratones. Uso de hilado de disco microscopía confocal, esta técnica permite la visualización de células vivas durante al menos 4 horas y podría adaptarse para estudiar otras condiciones inflamatorias pulmonares.

Ex vivo de imágenes en vivo de metástasis pulmonar y su microambiente

Este protocolo describe el uso de la microscopía multifotónica para realizar extendida time-lapse de las interacciones multicelulares en tiempo real, en vivo a una resolución de una sola célula.

Prolongado lapso de tiempo intravital de imágenes de tiempo real multicelular Dinámica en el microambiente tumoral

Este protocolo describe el uso de la microscopía multifotónica para realizar imágenes unicelulares de alta resolución a largo plazo del pulmón intacto en tiempo real utilizando una ventana de imagen estabilizada por vacío.

A largo plazo de alta resolución Microscopia intravital en el pulmón con una ventana de imagen vacío Estabilizado

Un modelo animal es necesario para descifrar el papel de las células del tumor (CTC) en la promoción de la colonización durante la metástasis del cáncer de pulmón en circulación. Aquí, hemos establecido y realizado con éxito un en vivo ensayo a prueba específicamente el requisito de fibronectina poliméricos (polyFN) Asamblea CTC para la colonización del pulmón.

El establecimiento de un ensayo de colonización pulmonar para la visualización de células tumorales en tejidos pulmonares de la circulación

El enfoque descrito combina ensayos experimentales de metástasis de la vena de cola con imágenes animales vivos in vivo para permitir el monitoreo en tiempo real de la formación y el crecimiento de metástasis de cáncer de mama, además de la cuantificación del número y tamaño de metástasis en los pulmones.

Uso combinado de ensayos de metástasis de vena de cola e imágenes en tiempo real en vivo en vivo para cuantificar la colonización metastásica del cáncer de mama y la carga en los pulmones

La inyección intravenosa de células cancerosas se usa a menudo en la investigación de metástasis, pero la carga tumoral metastásica puede ser difícil de analizar. Aquí, demostramos un modelo de metástasis de inyección en la vena de la cola e incluimos un enfoque novedoso para analizar la carga tumoral de pulmón metastásica resultante.

Análisis patológico de metástasis pulmonares después de la inyección lateral de células tumorales en la vena de la cola

Describimos un modelo de xenoinjerto de ratón de metástasis cerebral de cáncer de mama generado mediante inyección en la vena de cola de una línea celular de cáncer de mama inflamatorio amplificada endógenamente por HER2.

Modelado de metástasis cerebral mediante inyección en la vena de cola de células inflamatorias de cáncer de mama

Aquí, presentamos un protocolo para la implantación quirúrgica de una ventana óptica permanentemente permanente para el tórax murino, que permite obtener imágenes intravitales de alta resolución del pulmón. La permanencia de la ventana la hace muy adecuada para el estudio de los procesos celulares dinámicos en el pulmón, especialmente aquellos que evolucionan lentamente, como la progresión metastásica de las células tumorales diseminadas.

Una ventana permanente para investigar la metástasis del cáncer en el pulmón

El manuscrito describe una metodología para el establecimiento y seguimiento longitudinal del crecimiento de las metástasis pulmonares espontáneas de tumores de mama inyectados ortotópicamente, susceptibles de intervención en todas las etapas de la cascada metastásica.

In vivo Diagnóstico por imágenes para medir la metástasis pulmonar espontánea de células tumorales de mama inyectadas ortotópicamente

Un desafío importante del desarrollo de nuevas terapias para el cáncer de pulmón incluye el modelado del microambiente tumoral a medida que la enfermedad regional progresa a la enfermedad metastásica. Aquí, describimos un método simple para establecer un modelo singénico ortotópico de cáncer de pulmón que permite el seguimiento in vivo de la enfermedad a lo largo del tiempo.

Un método mínimamente invasivo para generar un modelo de ratón ortotópico singénico de cáncer de pulmón

Aprende a detectar metástasis pulmonares a nivel de célula única en ratones mediante perfusión in situ y tinción X-Gal de células tumorales LacZ. Este protocolo mejora la visibilidad eliminando el fondo sanguíneo.

Visualización mejorada de metástasis pulmonares en la Resolución sola célula en ratones por Combinada In-situ La perfusión del tejido pulmonar y X-Gal tinción de LacZ-Etiquetados células tumorales (Video) | JoVE Journal

Visualización mejorada de metástasis pulmonares en la Resolución sola célula en ratones por Combinada

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