Visualización mejorada de metástasis pulmonares en la Resolución sola célula en ratones por Combinada In-situ La perfusión del tejido pulmonar y X-Gal tinción de LacZ-Etiquetados células tumorales

El objetivo general de este procedimiento es mejorar la detección de micrometástasis en el pulmón de ratón ex vivo, preservando al mismo tiempo la arquitectura pulmonar inflada. Esto se logra primero perfundiendo el pulmón in situ con PBS para eliminar la sangre, que es la principal fuente de fondo de color en ese tejido. Los siguientes pasos son inflar el pulmón mediante la inyección de PFA, luego pellizcar para fijar el tejido pulmonar bajo inflado.

A continuación, se extrae el pulmón y se fija aún más en PFA o se incrustan lóbulos pulmonares individuales para la criosección. Los pasos finales son teñir los tejidos en solución de Xal y visualizar las células tumorales LA zag, en última instancia, la metástasis en lóbulos pulmonares completos o en secciones de tejido pulmonar se pueden detectar hasta el nivel de una sola célula con un microscopio binocular o un microscopio óptico. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el cielo por sí solo, es que la detectabilidad de las micrometástasis mejora considerablemente debido a la eliminación del fondo relacionado con la sangre.

Comience el protocolo anestesiando a un ratón con una inyección intraperitoneal de ketamina, xilacina y promazina en aproximadamente 150 microlitros de PBS. Cuando ya no se observen los reflejos de dolor del ratón, fíjelo en la mesa de operaciones. Retroceda y peine el cabello con etanol al 70%.

Abre la piel desde el abdomen hasta el cuello. Tira de la piel hacia los lados o retírala. Abra con cuidado el peritoneo del tórax para evitar la ruptura de vasos grandes como las venas yugulares.

Esto mejorará la eficiencia de la perfusión. Ahora corte la vena cava cardis debajo del hígado con una jeringa de 20 mililitros con una aguja de calibre 21 a 24. Inyecte lentamente de 10 a 15 mililitros de PBS en el ventrículo derecho del corazón latiendo hasta que el pulmón esté completamente blanco y el corazón deje de latir.

A continuación, pellizque los vasos sanguíneos por encima del hígado y el diafragma con una pinza vascular. Cargue una jeringa de 10 mililitros con aldehído paraformado al 3% e inyecte en el ventrículo derecho con una aguja de calibre 21 a 24. Aproximadamente dos mililitros.

Destape la tráquea fuera del tórax e infle el pulmón con una inyección en la tráquea de aproximadamente tres mililitros de aldehído desde el exterior del tórax. Luego, inmediatamente después de retirar la aguja, pellizque la tráquea sujeta a la punción con una pinza vascular y espere 10 minutos para permitir la fijación. A continuación, seccione los vasos sanguíneos por encima de la pinza vascular.

A continuación, retire la pinza e inyecte aproximadamente dos mililitros de PBS en el ventrículo derecho para eliminar el exceso de formaldehído. Punción de las partes inferiores de todos los lóbulos pulmonares con una aguja y retirada de la pinza vascular de la tráquea. Ahora inyecte de tres a cinco mililitros de solución de inclusión diluida en la tráquea mimada a la otra inyección.

Detenga la inyección cuando la piel de paraforma en los lóbulos pulmonares sea reemplazada por la solución. Extirpa el pulmón con cuidado tirando del corazón con una pinza y seccionando los ligamentos del tejido conectivo, los vasos sanguíneos y la tráquea. Asegúrese de mantener el corazón conectado a los pulmones.

Reserve un lóbulo para las secciones criogénicas y use el tejido pulmonar restante para la tinción larga completa. Coloque el pulmón en un recipiente de plástico con tapa de cierre hermético y fíjelo con 2% de formaldehído y PBS. Coloque un trozo de gasa encima del pulmón para mantenerlo en la solución y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Después de media hora, retire la solución de fijación y lave bien el pañuelo con PB S3 veces, prepare frescamente la solución xal lista para usar diluyendo un mililitro de solución madre Xal, de uno a 40 en la solución de tinción básica y agregue al menos 10 mililitros en la taza. Hundir el pulmón con un trozo de gasa. Asegure la tapa sin apretar para permitir el intercambio de aire e incube a 37 grados centígrados durante tres a cinco horas protegido de la luz.

Después de la incubación, retire la solución xal. Enjuague los pulmones una vez con PBS para eliminar la solución residual de xal y agregue al menos 10 mililitros de aldehído paraformado al 4% en PBS. El tejido ya está listo para la histología y puede almacenarse durante mucho tiempo en el 4% de PFA a cuatro grados centígrados.

Comience llenando un tercio de un molde de inclusión con medio de inclusión poly forze sin diluir. Luego cargue el lóbulo pulmonar en el molde y continúe agregando medio hasta que el lóbulo esté completamente cubierto. Evite cuidadosamente hacer burbujas de aire, ahora incube el lóbulo incrustado a cuatro grados centígrados durante 20 minutos.

A continuación, prepare los pulmones incrustados para seccionarlos congelándolos lentamente en una mezcla de hielo seco e isop pentano. Si es necesario, ahora se pueden transferir a un congelador de menos 80 grados Celsius para almacenarlos en un criostato cortado secciones criogénicas del lóbulo de siete a 10 micras montar las secciones en portaobjetos listos para la sección criogénica disponibles comercialmente Una vez montadas, incubar inmediatamente las secciones en una solución de tinción xal a 37 grados Celsius durante 24 horas en una cámara humidificada. Al día siguiente, enjuague los portaobjetos en PBS dos veces durante cinco minutos por enjuague.

Siga esto con un breve enjuague en agua destilada. Ahora contratiñe los portaobjetos con rojo nuclear rápido durante 10 segundos para obtener una contratinción débil que haga que el xal sea más dominante e inmediatamente enjuague la contramancha con agua destilada. Para una mancha de mostrador más oscura, extienda el tiempo hasta 30 segundos o más.

Monta las correderas con inmuno mount. Se volvió a investigar la formación de metástasis en los modelos de SG de ratón LM ocho realizados. Utilizando las imágenes representativas aquí descritas de pulmones perfundidos y no perfundidos de ratones inyectados simultáneamente con células laxas transducidas y no transducidas controladas y LM ocho en ratones inyectados con células controladas hechas.

Las metástasis macroscópicas y microscópicas permanecieron indetectables en los pulmones no perfundidos y perfundidos. Pero curiosamente en ratones inyectados con células DUN LA Z, la tinción xgl reveló focos micrometastásicos azules de células individuales o grupos de células pequeñas en la superficie de los pulmones no perfundidos in situ La perfusión y fijación de los pulmones mejora aún más la detectabilidad de las micrometástasis dun la z, sin embargo, no se observó crecimiento a focos macroscópicos en ratones inyectados con células control LM ocho translúcidas. Se reconocieron focos macrometastásicos apenas detectables de más de 0,1 milímetros de diámetro en los pulmones no perfundidos. La perfusión pulmonar no mejoró la detección de los focos.

Sin embargo, en ratones inyectados con células Z LAC, se detectaron múltiples macrometástasis con tinción azul X gal en la superficie de órganos no perfundidos. También se detectaron micrometástasis en la superficie de órganos no perfundidos. Además, la perfusión de los pulmones mejoró aún más la detectabilidad de las metástasis macro y micro.

En consecuencia, las micro y macro metástasis se hicieron visibles a una mayor densidad y en mayor número, principalmente debido a la translucidez del tejido perfundido en el que también se hicieron visibles los focos debajo de la superficie del órgano. Un análisis histológico adicional en el que se utilizaron secciones criogénicas de tejido pulmonar confirmó la mejora de la detectabilidad de las metástasis pulmonares en ratones inyectados con células LAX Z transducidas y LM eight en ratones con tumores primarios derivados de células Dun LAX Z. Se reconocieron micrometástasis o incluso focos unicelulares en secciones pulmonares.

Esto no se observó en ratones con tumores primarios de las respectivas células de control. Además, las macrometástasis también fueron más claramente visibles en los ratones inyectados con células LM ocho LA C que en los animales con las células control LM ocho. Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la perfusión pulmonar y la fijación en ZI dos y la posterior tinción exci de la metástasis en los pulmones extirpados.

Esta técnica es un criterio de valoración muy sensible para la distribución de la metástasis en el pulmón en cualquier tipo de estudio oncológico, y también puede servir como punto de referencia para la mejora de las técnicas actuales de imagen in vivo, como la PET con microtomografía computarizada y la resonancia magnética, utilizadas para la detección precoz de lesiones metastásicas.