Una evaluación cuantitativa de la migración celular mediante el ensayo de la canción Motilidad Phagokinetic
4 de diciembre de 2012
El ensayo de motilidad phagokinetic track es un método usado para evaluar el movimiento de las células. Específicamente, el ensayo mide la quimiocinesis (motilidad celular aleatoria) en el tiempo de una manera cuantitativa. El ensayo se aprovecha de la capacidad de las células para crear una pista medible de su movimiento en coloidales de oro revestido con cubreobjetos.
El objetivo general de este procedimiento es poder medir cuantitativamente la motilidad celular a lo largo del tiempo utilizando un ensayo de motilidad celular basado en nanopartículas de oro. Esto se logra preparando primero los cubreobjetos de vidrio para un recubrimiento de nanopartículas de oro. Específicamente, los cubreobjetos libres de endotoxinas se cubren con gelatina y luego se hornean.
El segundo paso es reducir el ácido clorobórico, que creará nanopartículas de oro, y recubrir los cubreobjetos recubiertos de gelatina de manera uniforme con la solución. A continuación, las células se colocan en los cubreobjetos de recubrimiento de nanopartículas de oro durante el período de tiempo deseado de las células del experimento. A continuación, la gelatina desplazará a las nanopartículas de oro creando huellas.
El paso final es el monitoreo y la cuantificación de la motilidad celular mediante microscopía para obtener imágenes de las huellas creadas por las células en movimiento. En última instancia, las mediciones de área de las pistas se realizan utilizando software disponible gratuitamente. Una de las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes, como las imágenes de lapso de tiempo, es que este ensayo solo requiere un microscopio óptico estándar, una cámara estándar y utiliza un software de imagen disponible gratuitamente.
Además, el ensayo también permite fácilmente el análisis y la comparación de múltiples muestras utilizando un Methodist capaz de realizar un cribado de alto rendimiento. Aunque este método puede proporcionar información sobre la influencia de diferentes factores fisiológicos y el movimiento celular, también se puede aplicar a otros sistemas, como los estudios sobre los efectos que los patógenos tienen sobre la motilidad de las células infectadas. Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque los métodos requieren que uno siga estrictamente los volúmenes y temperaturas indicados en el protocolo.
En este protocolo, se hace hincapié en evaluar el color de la solución final de las nanopartículas de oro precipitadas para garantizar el éxito. La demostración visual de este método es fundamental. Como el ensayo de motilidad de la pista cinética FGO, los pasos son difíciles de aprender.
Contienen varios procedimientos que no se utilizan comúnmente en los laboratorios de biología celular y molecular. Para preparar cubreobjetos recubiertos de gelatina, primero Resus suspende la gelatina y el agua desionizada para hacer la solución con una concentración final de 0,5 gramos por 300 mililitros y luego esteriliza la mezcla en autoclave durante 15 a 30 minutos. Es importante hacer esto dentro de las dos horas posteriores a la adición de la gelatina en una campana de cultivo de tejidos.
Prepare los cubreobjetos para el recubrimiento transfiriendo primero de ocho a nueve cubreobjetos lavados con ácido a un plato de plástico de 100 milímetros. Asegúrese de que los cubreobjetos no se toquen entre sí ni con los lados del plato. Pipetee con cuidado dos o tres gotas de gelatina en cada cubreobjetos, evitando que se desborde en la placa.
A continuación, coloque el plato que contiene los cubrebos recubiertos de gelatina en un horno y hornee a 90 grados centígrados durante 10 minutos. Después de 10 minutos, retire el plato del horno y devuélvalo al pañuelo. Capucha de cultura.
Pipetea suavemente el exceso de gelatina. Regrese el plato al horno y seque los cubreplatos a 70 grados centígrados durante 45 minutos. Una vez que los cubreobjetos estén secos, retire el plato del horno y devuélvalo a la campana de cultivo de tejidos.
Con una aguja estéril con delicadeza, levante un lado del cubreobjetos. Luego use pinzas estériles para quitar los trozos de cubierta recubiertos de gelatina del plato y colóquelos en pozos separados de un plato de 24 pocillos. El siguiente paso es preparar cubreobjetos recubiertos de oro coloidal.
Comience preparando 10 mililitros de solución de citrato de sodio al 0,5% trabajando en una campana de cultivo de tejidos combinada 1,5 mililitros de la solución de ácido cloro ORIC de 14,5 milimolares y 13,5 mililitros de agua desionizada en autoclave en un matraz erlenmeyer estéril libre de endotoxinas Por cada ocho a nueve cubreobjetos, el resultado debería producir una solución amarilla tenue. El ácido cloroORIC es tóxico y debe manipularse con cuidado. También es sensible a la luz, por lo que el paso de ebullición debe llevarse a cabo en un entorno con poca luz.
Cuando la solución haya alcanzado su punto de ebullición, retire el matraz de la placa caliente y transfiéralo a una placa de agitación. Para formar las partículas de oro coloidal en solución, agregue 0,7 mililitros de la solución de citrato de sodio al 0,5% por 15 mililitros de la solución de ácido cloro ORIC mientras agita, continúe revolviendo durante aproximadamente dos minutos. Durante este tiempo, la solución cambiará de un amarillo tenue a claro, a gris, a púrpura y a púrpura intenso.
Antes de alcanzar finalmente un color de vino tinto o preferiblemente óxido, extraiga la solución de oro coloidal en una pipeta de 10 mililitros y deje que la solución se enfríe en la pipeta durante uno o dos minutos hasta que alcance la temperatura ambiente. A continuación, añada de 0,5 a un mililitro encima de los cubreobjetos recubiertos de gelatina en la placa de 24 pocillos Coloque la placa de 24 pocillos que contiene los cubreobjetos recubiertos de oro coloidal en una incubadora a 37 grados centígrados e incube durante 30 minutos. Después de que las partículas hayan tenido tiempo de asentarse en los cubreobjetos recubiertos de gelatina, verifique su densidad bajo un microscopio óptico.
La distribución adecuada de las nanopartículas de oro ayuda a distinguir de manera fácil y eficiente los bordes de los camiones solares. La densidad óptima varía con el tamaño de la célula. Una concentración de partículas de oro demasiado alta dificulta la capacidad de las células para moverse, mientras que una concentración de partículas de oro demasiado baja limita la capacidad de delinear una pista precisa de motilidad.
Por esta razón, sólo los cubreobjetos fabricados en el mismo lote o que tengan la misma densidad deben utilizarse juntos en experimentos individuales. Si la concentración de partículas de oro es insuficiente, agregue de 0,5 a un mililitro adicional de la solución de oro coloidal a los cubreobjetos recubiertos de gelatina. Sin embargo, si la concentración de partículas de oro es demasiado alta, como en el caso que se muestra aquí, la única opción efectiva es rehacer la solución de oro coloidal y recubrir nuevos cubreobjetos.
Si la densidad de las partículas es correcta, regrese la placa a la incubadora a 37 grados centígrados e incube durante una hora para enjuagar durante la noche las partículas de oro no unidas sumergiendo los cubreobjetos tres veces en solución salina estéril tamponada con fosfato. Luego, almacene los cubreobjetos recubiertos de oro coloidal en pocillos llenos de PBS de una placa limpia de 12 pocillos a cuatro grados Celsius hasta que estén listos para ser utilizados. No se debe permitir que los cubreobjetos se sequen y deben usarse dentro de los dos o tres meses posteriores a la fecha en que se hicieron.
El siguiente paso es preparar los cubreobjetos recubiertos de oro coloidal para el cultivo celular. Comience colocándolos en pocillos individuales de una placa de 24 pocillos a los que se les hayan agregado aproximadamente 0.3 mililitros de medio de cultivo antes de la adición de los deslizamientos de cubierta. Transfiera aproximadamente de 5,000 a 50,000 celdas en cada cubreobjetos recubiertos de oro coloidal. El número de celda variará según el tipo de celda, pero la densidad de celda debe ser lo suficientemente baja como para evitar la superposición de pistas de celdas de varias celdas en la misma área.
Cubra la placa y colóquela en una incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante seis a 24 horas Sobre la base de la motilidad del tipo de célula, el marco de tiempo óptimo debe determinarse experimentalmente para cada tipo de célula después de la incubación, fije los cubreobjetos que no se analizarán inmediatamente sumergiéndolos primero dos veces en PBS seguido de una incubación en formaldehído al 3% durante 15 minutos a temperatura ambiente utilizando un Captura de imágenes de luz de las pistas creadas por una sola célula móvil en cubreobjetos fijos o no fijos. El aumento utilizado para tomar imágenes de las huellas celulares varía según el tipo de célula. Sin embargo, se debe utilizar el mismo aumento para cada estudio con el fin de poder comparar los resultados.
Para los monocitos, el aumento de 40x funciona bien utilizando el software disponible gratuitamente, como la imagen, la imagen JNIH o la herramienta de imagen, determine el área promedio de oro coloidal despejada por 10 a 20 o más celdas para cada muestra de las imágenes capturadas, aquí se muestra el camino despejado de las partículas de oro coloidal por un solo monocito no estimulado tomado con un objetivo de 40x. Las células inmóviles crean pequeñas huellas características en forma de óvalo o círculo a su alrededor, lo que indica un bajo nivel de movimiento de vasallo. Por el contrario, las células altamente móviles se caracterizan por un movimiento direccional como tractos alargados y áreas totales más grandes debido a sus formas irregulares.
Las pistas de celda se analizan mejor utilizando la herramienta a mano alzada del software Image J para delinear su volumen. Las mediciones cuantitativas del área se pueden realizar utilizando la herramienta de medición en el menú de análisis de la Imagen J. Al intentar este procedimiento, es importante recordar seguir estrictamente los volúmenes y temperaturas indicados en el protocolo, ya que las desviaciones pueden influir fuertemente en los resultados finales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear cubreobjetos recubiertos de gelatina, cómo preparar nanopartículas de oro y cubreobjetos recubiertos de nanopartículas de oro, y cómo monitorear y evaluar cuantitativamente el movimiento celular usando una microscopía óptica.
No olvide que trabajar con las soluciones hirviendo en una placa caliente, especialmente los vapores de la solución hirviendo de fluoro, ácido AIC y citrato de sodio pueden ser peligrosas, precauciones como trabajar en la campana y siempre se debe usar el sentido común al realizar este procedimiento.
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Panorama General
El ensayo de rastreo de motilidad fagocinética mide cuantitativamente el movimiento de las células a lo largo del tiempo. Este método utiliza portaobjetos recubiertos de nanopartículas de oro para visualizar la motilidad celular a través de la formación de rastros.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Motilidad celular
- Desarrollo de ensayos
- Aplicaciones de nanopartículas
Antecedentes
- El ensayo evalúa la quimiocinesis, o movimiento aleatorio de las células.
- Las nanopartículas de oro proporcionan un rastro visual del movimiento celular.
- Los portaobjetos libres de endotoxinas son esenciales para obtener resultados precisos.
- El recubrimiento de gelatina ayuda a la adhesión de las nanopartículas de oro.
Propósito del Estudio
- Desarrollar un método para medir cuantitativamente la motilidad celular.
- Utilizar nanopartículas de oro para visualizar el movimiento celular.
- Mejorar la comprensión del comportamiento celular en diversas condiciones.
Métodos Utilizados
- Preparación de portaobjetos de vidrio recubiertos con gelatina.
- Creación de nanopartículas de oro mediante la reducción de ácido cloroáurico.
- Recubrimiento de portaobjetos con solución de nanopartículas de oro.
- Colocación de células en portaobjetos recubiertos para observar el movimiento.
Resultados Principales
- Las células crean rastros medibles en superficies recubiertas de oro.
- El ensayo permite la observación de la motilidad celular aleatoria.
- Se pueden recopilar datos cuantitativos a lo largo del tiempo.
- Las nanopartículas de oro visualizan eficazmente el movimiento celular.
Conclusiones
- El ensayo de rastreo de motilidad fagocinética es un método confiable para estudiar la motilidad celular.
- Las nanopartículas de oro mejoran la visualización de los rastros celulares.
- Este ensayo se puede aplicar a diversas áreas de investigación que involucran el movimiento celular.
Preguntas Frecuentes
Executive Industry Relevance
The phagokinetic track motility assay provides a cost-effective, quantitative method for evaluating cellular motility using standard laboratory equipment, addressing a key bottleneck in early discovery workflows. By enabling high-throughput analysis of cell movement without expensive imaging systems, it supports rapid screening of compounds or genetic perturbations affecting motility. This capability enhances predictive confidence in target validation and lead identification stages by delivering reproducible, mechanistically relevant phenotypic data.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to cell migration pathways in cancer metastasis, immune cell trafficking, and wound healing models.
- Operational Value: Supports functional target validation by quantifying motility changes upon gene knockdown or pharmacological inhibition, reducing mechanistic ambiguity.
- Predictive Value: Generates quantitative, statistically robust motility metrics that aid in portfolio triage and go/no-go decisions based on phenotypic de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, reproducible track area measurements that serve as quantitative readouts for assay development and compound screening campaigns.
- Operational Value: Utilizes freely available image analysis software and standard light microscopy, enabling scalable, low-cost implementation across discovery teams.
- Assay Readiness: Compatible with diverse cell types including cancer cells, fibroblasts, neutrophils, and monocytes, broadening applicability across therapeutic areas.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase motility observations to preclinical validation by providing disease-relevant, quantitative phenotypic data.
- Mechanistic De-risking: Clarifies the role of cytoskeletal regulators and receptor signaling in cell movement, informing target selection and biomarker alignment.
- Predictive Confidence: Enables risk-adjusted advancement decisions by linking in vitro motility phenotypes to pathophysiological processes such as tumor invasion or immune cell infiltration.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical evaluation, offering a reusable phenotypic platform for motility-dependent processes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying cellular motility as a functional readout of genetic or pharmacological perturbations.
- Screening: Enables assay standardization and high-throughput compatibility through quantifiable track analysis and minimal equipment requirements.
- Analytics: Delivers quantitative area measurements via freeware tools, facilitating statistical comparison across conditions and replicates.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing motility data relevant to tissue development, immune surveillance, and metastatic potential.
- Enterprise Reuse: Functions as a scalable, cross-project capability rather than a single-use technique, maximizing ROI on reagent and training investments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cell migration pathways.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability through simple chemistry, standardized protocols, and accessible image analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making, capital efficiency, and reduces late-stage biological risk by identifying motility-related liabilities early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative, phenotype-driven motility profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in colloidal nanoparticle preparation and sterile tissue culture techniques to ensure consistent gold nanoparticle coating.
- Depends on access to standard light microscopy, incubators, and freely available image analysis software (e.g., ImageJ) for track quantification.
- Necessitates cross-team standardization of cover slip preparation, cell seeding density, and incubation times to ensure reproducibility across laboratories.
- Requires adaptation of gold nanoparticle density and incubation duration based on cell size and motility characteristics to avoid confounding effects from over- or under-coating.
- Limited to assessing chemokinesis (random motility); directed migration assays may require complementary methods such as microfluidic or gradient-based systems.
