Name: Un modelo de tumor vesical ortotópica y la Evaluación de tratamiento intravesical SARNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprende a establecer un modelo ortotópico de tumor vesical en ratones inmunocomprometidos y evaluar tratamientos con ARN bicatenario pequeño mediante ultrasonido e imagen bioluminiscente.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta investigación está financiada por la AACR Henry Shepard cáncer de vejiga beca de investigación (09-60-30-LI).

Los procedimientos que implican temas de los animales han sido aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo (IACUC) de la Universidad de California en San Francisco. 1. Preparación de la célula <ol><li> El cáncer de vejiga humano línea de células KU-7-luc2-GFP (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) se cultiva en medio RPMI-1640 suplementado con suero fetal bovino al 10% y 50 gentamicina g / ml. </li><li> Los cultivos se mantuvieron a 37 ° C, 5% de CO 2 con los medios cambia cada dos o tres días. </li><li> Las células fueron cosechadas por digestión con tripsina y se contaron utilizando un hemocitómetro. Una suspensión de células individuales de 2 x 10 6 células en 50 l se preparó en tampón fosfato salino y se mantuvieron en hielo. </li></ol> 2. Vesical ortotópica modelo de tumor <ol><li> Femeninos desnudos (nu / nu) ratones 8-10 semanas de edad (Simonsen Laboratorio, Gilory, CA) fueron utilizados. </li><li> Coloque un paño estéril sobre una almohadilla térmica para servir a unsa quirúrgica plataforma. Gel lubricante estéril, de 24 idiomáticas catéteres con agujas estilete, solución de nitrato de plata, y el agua estéril, se preparan. </li><li> La anestesia general se induce en los ratones con isoflurano inhalado (3% para la inducción, 2.1% para el mantenimiento) y se mantiene a través de ojiva. Ungüento oftálmico estéril se aplica a los ojos del animal, y una almohadilla de calor se utiliza para mantener el calor del cuerpo. </li><li> Sitúa el cursor en la posición supina. </li><li> Agarre suavemente la vulva del animal con una pinza para la estabilización. </li><li> El uso de un catéter intravenoso calibre 24 con el estilete de la aguja eliminado, la uretra del ratón se sondaje. Lubricación amplio debe ser utilizado. Con el ratón en posición supina, la uretra se encuentra inmediatamente por detrás de los pliegues de la vulva y anterior de la vagina. Un ángulo de 45 grados que se haya determinado inicialmente con el fin de canalizar la uretra y pasar por debajo del hueso púbico. Un ángulo más superficial se lleva luego a pasar a través de la uretra hasta la vejiga. Suave presión pélvicaAsegúrese de enderezar la uretra a menudo puede ayudar. Se debe tener cuidado de no empujar demasiado fuerte contra la resistencia, ya que esto puede conducir a la perforación uretral o vesical. La orina visto dentro del catéter confirma su ubicación dentro de la luz vesical. </li><li> Aspirar la orina desde el lumen del catéter y de la vejiga con la aguja del estilete. La aguja del estilete se utiliza para todas las aspiraciones y las inyecciones posteriores, dejando el catéter en su lugar. Esto permite la inyección de volúmenes precisos, eliminando el espacio muerto-dentro del catéter, y hace que cateterizaciones repetidas innecesarias. </li><li> Para poner en peligro la capa de glucosaminoglucano de la vejiga urotelio, 10 l de nitrato de plata 0,5 M se inyecta y se dejó que habitan durante 10 segundos. Esto puede formar un precipitado blanco con orina restante. </li><li> Aspirar y desechar el contenido de precipitado y de la vejiga usando una aguja de estilete. </li><li> Lave la vejiga mediante la inyección de 100 l de agua estéril. Aspirar y desechar el agua. Repea lavado con agua estéril 3 veces para un total de 4 lavados. </li><li> Colocar una corbata de seda 4-0 alrededor del meato uretral para ocluir la uretra, en preparación para la retirada del catéter. </li><li> Inyectar previamente preparado 2 x 10 6 KU-7-luc2-GFP células en 50 l usando la aguja estilete. </li><li> Simultáneamente retirar el catéter y la aguja estilete, dejando la uretra ocluido por la corbata de seda. </li><li> El ratón se mantendrá bajo anestesia general durante 2 horas antes de la corbata de seda se retira y el animal se despierta. </li></ol> 3. Ultrasonido <ol><li> La anestesia general se indujo con isoflurano vaporizado y se mantiene a través de cono de la nariz. </li><li> Un VisualSonics Vevo 770 in vivo de alta resolución de Micro-Imaging System (VisualSonics Inc., Toronto, Ontario, Canadá) con la RMV-704 de la sonda de 40 MHz se usó. </li><li> Sitúa el cursor en la posición supina sobre la plataforma de ultrasonido. </li><li> Asegure las patas traseras del animalcon cinta para evitar un movimiento excesivo durante la manipulación de la sonda de ultrasonidos. </li><li> Aplicar gel de ultrasonido de la pelvis del ratón. </li><li> Baje un RMV-704 (40 MHz) sonda de ultrasonido en la pelvis del ratón para obtener imágenes transversales o longitudinales. </li><li> Si se encuentra un tumor, las imágenes se pueden guardar para la medición de las dimensiones del tumor. </li></ol> 4. Bioluminiscente de imágenes <ol><li> Realizar la inyección intraperitoneal de 200 l (150 mg / kg) sustrato luciferina. </li><li> Inducir la anestesia general con isoflurano vaporizado y mantener a través de cono de la nariz. </li><li> Coloque los ratones en posición de decúbito supino en el reproductor de imágenes de bioluminiscencia. </li><li> Cinco minutos después de la inyección luciferina, medir la bioluminiscencia del animal en fotones por segundo. </li></ol> 5. SARNA Preparación <ol><li> Sintetizar ARN oligonucleótidos a una escala de 50 a 100 mmol. </li><li> Recocido complementarias oligonucleótidos de cadena sencilla into dúplex saRNAs. </li><li> Lípidos nanopartículas (LNP)-SARNA se preparan con el lípido ionizable 1,2-dilinoleyl-4-(2 - dimetilaminoetil) - [1,3]-dioxolano (DLinKC2-DMA), disteroylphosphatidyl colina, colesterol, y PEG-DMG utilizando una formación espontánea de vesículas procedimiento de formulación que se describió anteriormente. 1 </li></ol> 6. Administración intravesical de SARNA Formulado <ol><li> Después de establecer el modelo de tumor de vejiga ortotópica, los ratones son tratados con activador intravesical pequeño ARN (Sarna) formulado en nanopartículas lipídicas (LNPs) (Tabla 1). </li><li> La anestesia general se establece y mantiene con isoflurano vaporizado, y lubricante oftálmico estéril se aplica. </li><li> Colocar el animal en decúbito supino. </li><li> Realizar un cateterismo uretral como se describió anteriormente. </li><li> Coloque una corbata de seda 4-0 alrededor de la uretra y el catéter. </li><li> Aspirar toda la orina desde el catéter yvejiga mediante una jeringa vacía y la aguja del estilete. </li><li> Inyectar LNP-SARNA intravesicalmente para una dosis total de 50 l (3 mg / kg). Simultáneamente retirar el catéter y la aguja estilete, dejando la uretra ocluido por la corbata de seda. </li><li> El ratón seguirá siendo anestesiados con la uretra ocluido durante 2 horas. </li><li> El tratamiento con intravesical LNP-SARNA se inició el día 4 después de la implantación del tumor. Los ratones fueron tratados en serie, cada 3 días, para un total de 14 tratamientos. </li></ol> 7. Los resultados representativos Los tumores de vejiga derivados de KU-7-luc2-GFP células pueden ser controlados por la luciferasa de imagen bioluminiscente (Figura 1A y C) y el ultrasonido vesical (Figura 1B y D). Los tumores suelen ser detectables dentro de 3-5 días después de la inoculación de células. Hemos encontrado éxito de la implantación del tumor de vejiga en más del 90% de los ratones. Como el tratamiento con dsRNA intravesical se produce, la progresión del tumor se puede controlar wiª de estas modalidades. Después de que el animal es sacrificado, el crecimiento del tumor también puede ser confirmado mediante la fluorescencia de GFP. En general, la media de bioluminiscencia correlacionada con dimensiones medias de ultrasonido tumores de vejiga, como se ve visualmente en las figuras 1C y 1D. Sin embargo, después los animales fueron sacrificados y el tumor fue confirmada por GFP, hemos encontrado que la bioluminiscencia correlaciona más estrechamente con la presencia de tumor viable que hizo mediciones de ultrasonido. Esto era especialmente evidente entre los ratones tratados con Sarna (en oposición a los controles) porque el tejido cicatricial residual en los ratones tratados fue visualizado por ultrasonido a menudo, pero no pudo ser diferenciada de tumor en vivo. <img src="/files/ftp_upload/4207/4207fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. La cinética de crecimiento del tumor de los tumores de vejiga. (A) imágenes de bioluminiscencia mide la actividad de la luciferasa en los tumores de la vejiga para confirmar su ubicación y el crecimiento. (B) En ultrasoun vejiga in vivod utilizando una sonda de 40 MHz produce las imágenes del tumor cuyas dimensiones pueden ser medidos con precisión. (C) gráficos que ilustran aumento progresivo del tumor en las dimensiones de bioluminiscencia y el ultrasonido. Los valores representan la media (+ / - desviación estándar) de medición de 6 animales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4207/4207fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> .

<ol><li>Semple, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+cationic+lipids+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rational design of cationic lipids for siRNA delivery.</a> Nature. 28, 172-176 (2010).</li>
<li>Li, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+dsRNAs+induce+transcriptional+activation+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 17337-17342 (2006).</li>
<li>Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+effect+of+dsRNA-induced+p21%28WAF1%2FCIP1%29+gene+activation+in+human+bladder+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Antitumor effect of dsRNA-induced p21(WAF1/CIP1) gene activation in human bladder cancer cells.</a> Molecular cancer therapeutics. 7, 698-703 (2008).</li>
<li>Chancellor, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+results+of+myoblast+injection+into+the+urethra+and+bladder+wall%3A+a+possible+method+for+the+treatment+of+stress+urinary+incontinence+and+impaired+detrusor+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourology+and+urodynamics%22%5BJournal%5D)">Preliminary results of myoblast injection into the urethra and bladder wall: a possible method for the treatment of stress urinary incontinence and impaired detrusor contractility.</a> Neurourology and urodynamics. 19, 279-287 (2000).</li>
<li>Hadaschik, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+validated+mouse+model+for+orthotopic+bladder+cancer+using+transurethral+tumour+inoculation+and+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+international%22%5BJournal%5D)">A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging.</a> BJU international. 100, 1377-1384 (2007).</li>
<li>Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Bladder+Wall+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse Bladder Wall Injection.</a> J. Vis. Exp. (53), e2523(2011).</li>
<li>Dobek, G. L., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Orthotopic+Model+of+Murine+Bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An Orthotopic Model of Murine Bladder.</a> Cancer. J. Vis. Exp. (48), 2535(2011).</li>
<li>Dinney, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+metastatic+variants+from+human+transitional+cell+carcinoma+passaged+by+orthotopic+implantation+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+urology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice.</a> The Journal of urology. 154, 1532-1538 (1995).</li>
</ol>

LCL es un inventor llamado de solicitudes de patentes pendientes relacionadas con SARNA que han sido presentadas por la Universidad de California en San Francisco y con licencia para Alnylam Pharmaceuticals.

Se presenta un protocolo para el establecimiento de un modelo de ratón del tumor vesical ortotópico xenoinjertos seguido por el tratamiento intravesical de los tumores con SARNA LNP formulado que se dirige el promotor de p21 CIP1/WAF1 (p21) para la activación transcripcional. 2, 3 Los tumores resultantes pueden ser confirmación y seguimiento con imágenes bioluminiscentes y la ecografía de vejiga. Modelos ortotópico puede ser superior a intraperitoneal, subcutánea, intravenosa o modelos, proporciona...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> KU-7-luc-GFP células </td><td> Caliper </td><td> 128091 </td><td></td></tr><tr><td> tímicas ratones desnudos (nu / nu) </td><td> Simonsen Laboratorios </td><td> 6-7 semanas de edad </td><td> Sim: (NCR) nu / nu FISOL </td></tr><tr><td> Ultrasonido unidad </td><td> Visualsonics </td><td> Vevo 770 </td><td> RMV-704 de la sonda </td></tr><tr><td> La bioluminiscencia unidad </td><td> Caliper </td><td> IVIS Spectrum </td><td></td></tr><tr><td> Exel safelet catéter </td><td> Pescador </td><td> 14-841-21 </td><td> 24G x ¾ &quot; </td></tr><tr><td> Nitrato de plata </td><td> Sigma </td><td> S8157 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton jeringa </td><td> Hamilton company </td><td> 80301 </td><td></td></tr><tr><td> LNP-SARNA </td><td> Alnylam Pharmaceuticals </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Reactivos específicos y equipos.

un modelo de tumor vesical ortotópica y la evaluación de tratamiento intravesical sarna

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

Se presenta un nuevo método para el tratamiento de cáncer de vejiga con intravesical entregado activación pequeño ARN (Sarna) en un modelo de xenoinjerto de tumor vesical ortotópico del ratón. El modelo de ratón se establece mediante cateterismo uretral por debajo inhalado anestesia general. Quemadura química se introduce entonces a la mucosa de la vejiga utilizando solución intravesical nitrato de plata para perturbar la capa de glicosaminoglicano vejiga y permite a las células para unir. Tras varios lavados con agua estéril, cáncer de vejiga humano KU-7-luc2-GFP células son inculcados a través del catéter en la vejiga para vivir durante 2 horas. Posterior crecimiento de los tumores de vejiga se confirma y monitoreado por ultrasonido de vejiga en vivo e imágenes bioluminiscentes. Los tumores se tratan a continuación intravesical con SARNA formulado en nanopartículas lipídicas (LNPs). El crecimiento del tumor se controla con el ultrasonido y la bioluminiscencia. Todos los pasos de este procedimiento se demuestra en el vídeo adjunto.

El establecimiento de un modelo de tumor de vejiga ortotópica para evaluar los efectos antitumorales de SARNA intravesical entrega y el control del crecimiento tumoral mediante ecografía y bioluminiscente.

Un modelo de tumor vesical ortotópica y la Evaluación de tratamiento intravesical SARNA

Presentamos un nuevo método para tratar el cáncer de vejiga mediante la administración intravesical de ARN activador pequeño (saRNA) en un modelo de xenoinjerto ortotópico de vejiga de ratón...

Presentamos un método para establecer un modelo de tumor ortotópico de vejiga en ratones inmunodeprimidos. Tratamos estos tumores con ARN bicatenario pequeño administrado por vía intravascular y monitoreamos los tumores mediante ecografía de vejiga e imagen de bioluminiscencia. Se induce anestesia general con isofluorano vaporizado y se aplica una pomada oftálmica estéril.A continuación, se coloca al ratón en posición supina y se mantiene la anestesia con isoflurano mediante cono nasal. Luego, debe cateterizarse al ratón. Utilizamos un catéter intravenoso de calibre 24 del cual se ha retirado la aguja guía.La cateterización suele ser el paso más difícil e impredecible del protocolo. Una lubricación abundante con gel KY y una técnica correcta son fundamentales para una cateterización exitosa. Aquí se muestra la zona de la vulva del ratón.La uretra se encuentra justo debajo de los pliegues vulvares. Después de la lubricación, se utilizan fórceps para catéter para sujetar y estabilizar suavemente la vulva y la uretra. Inicialmente, se utilizó un ángulo más pronunciado de 45 grados para canular la uretra, pero una vez dentro de ella, se adopta un ángulo más bajo para avanzar suavemente

an-orthotopic-bladder-tumor-model-evaluation-intravesical-sarna

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Los tumores de vejiga se establecen en las hembras de una forma mínimamente invasiva a través de cateterismo, la cauterización local, y posterior adhesión de las células cancerosas a los sitios de quema.

Un modelo ortotópico de cáncer de vejiga murino

En este video, describimos el trasplante ortotópico de organoides de tumores de vejiga cultivados a la vejiga murina para estudiar el papel del entorno de los órganos en el desarrollo de tumores.

Modelo de organoide tumoral vesical: un método para el trasplante ortotópico de organoides vesicales en vejiga murina receptora

En este video, describimos el procedimiento intravesical de administrar células cancerosas en la vejiga de un modelo de ratón. Este procedimiento ayuda a generar un modelo ortotópico de tumor vesical que se puede utilizar para desarrollar estrategias terapéuticas.

Modelado de tumor ortotópico de vejiga en modelo de ratón: un procedimiento para la administración intravesical de células cancerosas en la vejiga murina

Implantación de células de cáncer en el órgano de origen puede servir como un modelo preclínico útil para evaluar nuevas terapias. Células de carcinoma de vejiga MB49 se pueden cultivar dentro de la vejiga después de la instilación intravesical. Este protocolo demuestra la cateterización de la vejiga de ratón para el propósito de la implantación del tumor y la entrega adenoviral.

Un modelo ortotópico de cáncer de vejiga de Estudios de liberación de genes

La técnica establecida para inocular ortotópico xenoinjertos de cáncer de vejiga invasivos primarios requiere laparotomía y la movilización de la vejiga. Este procedimiento inflige una morbilidad significativa en los ratones, es técnicamente difícil y consume mucho tiempo. Lo tanto, desarrolló una alta precisión, abordaje percutáneo utilizando la guía del ultrasonido.

Mínimamente Invasiva Establecimiento de murino ortotópico xenoinjertos vejiga

Aquí se describe el método para establecer un modelo de ratón singénico de tumor ortotópico de vejiga para evaluar la eficacia antitumoral de la proteína bacteriana HP-NAP.

Evaluación de la eficacia de la<em&gt; H. pylori</em&gt; Proteína HP-PAN como herramienta terapéutica para el tratamiento de cáncer de vejiga en un modelo murino ortotópico

Este protocolo describe la generación de tumores de vejiga ortotópico murino en ratones C57BL / 6J hembra y el seguimiento del crecimiento del tumor.

Un Modelo de tumor y el tumor murino ortotópico de vejiga Sistema de Detección

Los tumores de vejiga murino son inducidos con el carcinógeno nitrosaminas de N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) (BBN). Generación de tumor de vejiga es heterogénea; por lo tanto, es necesaria una evaluación precisa de la carga tumoral antes de la aleatorización al tratamiento experimental. Aquí presentamos un protocolo MRI rápido y confiable para evaluar el escenario y tamaño del tumor.

Evaluación de la proyección de imagen de resonancia magnética de los tumores vesicales murina inducida por carcinógenos

Este protocolo describe la generación de modelos de xenoinjerto ortotópico derivados del paciente inculcando intravesicamente células carcinoma de células uroteliales de alto grado o inyectando intrarectalmente células cancerosas colorrectales en combinación diabética/grave no obesa ratones de inmunodeficiencia (NOD/SCID) para el crecimiento tumoral primario y metástasis espontáneas bajo la influencia de células estromales de ganglios linfáticos, lo que imita la progresión de las enfermedades...

Modelos de xenoinjerto ortotópico derivados del paciente para el carcinoma de células uroteliales humanas y el crecimiento tumoral del cáncer colorrectal y la metástasis espontánea

Una visión global de las técnicas involucradas en la generación de un modelo de ratón de cáncer oral y el control cuantitativo de la invasión del tumor dentro de la lengua a través de multi-fotón microscopio de las células marcadas se presenta. Este sistema puede servir como una plataforma útil para la evaluación molecular y la eficacia de los medicamentos de compuestos anti-invasiva.

Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

Aprende a establecer un modelo ortotópico de tumor vesical en ratones inmunocomprometidos y evaluar tratamientos con ARN bicatenario pequeño mediante ultrasonido e imagen bioluminiscente.

Un modelo de tumor vesical ortotópica y la Evaluación de tratamiento intravesical SARNA

Explorar más videos