Name: Diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por Trasplante de Médula Ósea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Aprende a diferenciar los roles funcionales de la expresión génica en células inmunes y no inmunes durante la colitis inducida por sulfato de dextrano en ratones mediante trasplante de médula ósea.

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Este trabajo fue financiado por el piloto y la subvención Estudio de Viabilidad de la UCLA-CURE Center, la enfermedad de Crohn y Colitis Foundation of America Award de Desarrollo Profesional (# 2691) y el Instituto Nacional de Salud NIDDK K01 (DK084256) la financiación a Hon Wai Koon. La médula ósea operación irradiación fue asistido por Bernard Levin y Cocina Scott de UCLA Center for AIDS Research Mouse / instalaciones Humanos Core Chimera. Operación de citometría de flujo fue asistido por instalaciones UCLA Core Vector.

1. Antes-de-empezar Consideraciones técnicas <ol><li> Le recomendamos que use C57/BL6 ratones de tipo salvaje y ratones knockout para el experimento porque los ratones con moléculas de CD correspondientes pueden adquirirse de los proveedores más importantes del ratón. </li><li> Puesto que es difícil realizar un seguimiento de los ratones de tipo salvaje y de ratones knockout derivados células del donante después del trasplante de médula ósea, es necesario utilizar CD45.1 ratones para representar ratones de tipo salvaje. (CD45.1 C57/SJL PESO ratones Jackson Laboratorios de stock # 002014). </li><li> La mayoría de las colonias de ratones son CD45.2. Nuestros ratones knockout pertenecen a CD45.2 genotipo (o bien una fuente CD45.2 ratones WT: Jackson Laboratories stock # 000664). La determinación de CD45.1 o CD45.2 genotipo se puede realizar mediante citometría de flujo de la médula ósea y la sangre periférica como se ha mencionado en la sección 7 de este protocolo. </li><li> Los ratones después de la irradiación han puesto en peligro la inmunidad. Mantener los ratones en instalación libre de patógenos. </li><li> Funcionamiento del irradiador requiere especial clearanc seguridade y formación. Para ahorrar tiempo en los procesos de formación y aprobación, lo mejor es colaborar con un laboratorio con personal cualificado que sea capaz de manejar el irradiador. </li><li> Muchas instituciones cuentan con laboratorios de citometría de flujo con técnicos experimentados. Para minimizar los problemas de funcionamiento de citometría de flujo, es mejor discutir su plan de citometría de flujo experimentar con el técnico con experiencia antes de empezar. </li><li> Los ratones fueron asignados de esta manera (10 ratones por grupo): </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Grupo </td><td></td><td> Donante de médula ósea para el destinatario </td><td> Tratamiento </td></tr><tr><td> La </td><td> BM intercambio </td><td> CD45.1 WT KO CD45.2 </td><td> DSS colitis </td></tr><tr><td> B </td><td></td><td></td><td> Agua control normal </td></tr><tr><td> C </td><td> BM intercambio </td><td> CD45.2 KO a CD45.1 PESO </td><td> DSS colitis </td></tr><tr><td> D </td><td></td><td></td><td> Agua control normal </td></tr><tr><td> E </td><td> Falso </td><td> CD45.1 WT para CD45.1 PESO </td><td> DSS colitis </td></tr><tr><td> F </td><td></td><td></td><td> Agua control normal </td></tr><tr><td> G </td><td> Falso </td><td> CD45.2 KO KO a CD45.2 </td><td> DSS colitis </td></tr><tr><td> H </td><td></td><td></td><td> Agua control normal </td></tr></tbody></table> * Una breve ilustración del protocolo experimental se muestra en la figura 1. 2. Los ratones receptores irradiación <ol><li> Los ratones son criados y mantenidos en instalaciones libres de patógenos. Coloque los ratones en pie irradiación autoclave con filtro. Coloque un ratón en cada ranura de pastel de irradiación. Coloque el pastel en el irradiador y asegúrese de que el plato giratorio y el pastel está dando vuelta. </li><li> Encienda la bomba de airepara la ventilación. Cierre la puerta del irradiador y bloquearlo. </li><li> Irradiar a los ratones con 1.000 rad (que es equivalente a 10 Gy) alrededor de 10 min (dependiendo de la fuente de radiación y la vida media-). Desde este punto de tiempo, los ratones irradiados son inmunodeficientes y tienen inmunidad débil contra la infección. Después de la irradiación, tomar la tarta y colocar en un recipiente estéril para transportarlo al gabinete de bioseguridad en las instalaciones de los animales. Evite la exposición de los ratones con el medio ambiente externo para minimizar las posibilidades de infección. </li><li> En gabinete de bioseguridad, la transferencia a las jaulas de los ratones del ratón autoclave autoclave con ropa de cama (4 ratones por jaula Agregue agua estéril nueva suspensión Sulfatrim -. 3,12 ml por 100 ml de agua). </li><li> Envuelva la botella de agua con papel de aluminio, como los antibióticos son sensibles a la luz. Agitar para mezclar la botella de solución Sulfatrim bien antes de cargarlo a la jaula. </li></ol> 3. Donantes de Médula Ósea de extracción <ol><li> Sacrificar los ratones con dióxido de carbono o isoflurmiento y luego sumergir en solución 1:200 Lysol. Rocíe los ratones con 70% de etanol para humedecer la piel y diseccionar huesos abiertos. </li><li> Remojar los instrumentos de disección en 70% de etanol para la esterilización. </li><li> Realizar la disección en un gabinete de bioseguridad. Utilizar los instrumentos de disección estéril para exponer el húmero, el fémur, la tibia y el peroné huesos, libre de fijación de los músculos y ligamentos. </li><li> Cortar abrir ambos extremos de los huesos para mostrar la médula ósea roja. Mantenga los huesos con fórceps. Lavar la médula ósea roja con PBS frío con jeringa de 3 ml y agujas de 25G a una placa de Petri. Enjuague de ambos extremos de los huesos para producir células de la médula ósea más. </li><li> Use 6 ml jeringas y agujas 18G1 / 2 a romper los tapones rojos de médula ósea por aspiración repetida y expulsión. Transferencia de médula ósea con 50 ml tubos Falcon. </li><li> Girar la médula ósea en 1.800 rpm durante 5 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante, resuspender el sedimento por agitación durante 5-10 segundos. </li><li> Diluir el tampón de lisis de RBC 10 veces con agua estéril. Anunciod 1X tampón de lisis RBC (5 ml por ratón donante) y agitar de nuevo durante 5 segundos y mantener exactamente 3 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Después de 3 min, llenar los tubos con 20 ml de PBS frío para detener la lisis y mezclar. Verter el contenido a través de un filtro de células 40 micras directamente en un nuevo tubo Falcon de 50 ml. </li><li> Enjuague los tubos originales con 5 ml de PBS y transferir a filtro de células así. Completar hasta 50 ml con PBS y mezclar. </li></ol> 4. Contando Bone Marrow Donor células <ol><li> Añadir 100 l de azul de tripano a un tubo Eppendorf y 100 l de suspensión de médula ósea a un tubo Eppendorf y se mezcla. Pipetear la mezcla de células teñidas con un hemocitómetro. </li><li> La cantidad de células se calcula por recuento total de células de médula ósea de estar en los tubos Falcon = número de células sin teñir en 16 cuadrados x 2 (debido a la dilución Trypan azul) x 10.000 x 50 ml </li><li> Decantar las células de médula ósea en 50 ml en tubos Falcon de 2.000 rpm durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante. Basadoen el total de células, se resuspende el pellet con PBS a 1 x 10 8 células por ml </li></ol> 5. Infusión a ratones receptores <ol><li> Calentar los ratones receptores sobre una almohadilla de calor y bajo una lámpara de calentamiento. Ponga los ratones receptores de inmovilización. Inyectar 1 x 10 7 células por ratón en 100-200 l por vía intravenosa. </li><li> La inyección de médula ósea de un donante se debe hacer entre 4-24 horas después de la irradiación. </li><li> Manténgase 4 ratones inyectados por jaula. Mantener los ratones receptores inyectados en jaulas autoclave con agua tratada con antibióticos durante las primeras 4 semanas en las instalaciones patógeno animal libre y dejar que los ratones recuperar la inmunidad. Cambio jaulas, tratado con antibióticos en aguas y alimentos cada 4 días para mantener la higiene. </li></ol> 6. La inducción de la colitis y la evaluación de la colitis <ol><li> 4 semanas después del trasplante de médula ósea y la irradiación, cambiar a agua normal sin antibióticos y mantener los ratones durante 2 semanas más para recuperar su normalidadla microflora intestinal. </li><li> 6 semanas después de la inyección de médula ósea, medir el peso corporal inicial. Algunos ratones se les da 5% de sulfato de dextrano en beber agua ad libitum para inducir la colitis. Algunos ratones se les da agua potable regular sólo como grupos de control normales. </li><li> 5 días después, extraer sangre periférica, traslado a tubos recubiertos de heparina (Vacutainer) y mantener en hielo. Piscina de la sangre de los ratones 4 a 1 metro. Combine 300 l de sangre con 300 l de buffer de tinción celular = 600 l. Divida la sangre a 5 tubos Eppendorf, cada uno con 100 l. </li><li> Sacrificar los ratones con dióxido de carbono o isoflurano. Evaluar resultados macroscópicos daños (por favor refiérase a otra publicación vídeo JOVE para obtener más información 1). Medir el cambio de peso corporal. Medir la longitud del intestino grueso y con calibrador digital. Observe textura heces (dura, blanda o con sangre). Determinar sangre oculta en las heces con Hemooccult. Disecciona tejidos de colon y fijar en formol para H &amp; E tinción. </li><li> Disecciona un fémur bone por ratón, se extrae médula ósea y enjuagar la médula ósea con PBS frío a través de aguja 25G y una jeringa de 1 ml. De 4 estrella médula ósea se conecta a un tubo y mantener en hielo. </li><li> Verter la médula ósea a una placa de Petri, la cizalladura del tapón de médula ósea con aguja 18G y 5 ml jeringa varias veces hasta que no enchufe médula ósea está presente. </li><li> Decantar con 1.500 rpm durante 5 min a 4 ° C. Remover el sobrenadante y resuspender con 600 l tampón de tinción celular. Divida la médula ósea se resuspendieron a 5 tubos Eppendorf, cada uno con 100 l. </li></ol> 7. Inspección de Calidad de Trasplante de Médula Ósea por citometría de flujo <ol><li> Etiquete cada tubo de muestra de sangre o de médula ósea # 1-5: </li><li> Preparar la mezcla de anticuerpos para cada tubo respectivo en la oscuridad. </li></ol> # 1 No anticuerpo # 2 30 l control de isotipo FITC + 30 mu l PE control de isotipo + 15 mu l CD16/32 bloqueo # 3 30 l FITC CD45.1 Ab + 15 mu l CD16/32 bloqueo # 4 30 l PECD45.2 Ab + 15 mu l CD16/32 bloqueo # 5 30 l FITC CD45.1 Ab + 30 l PE CD45.2 Ab + 15 mu l CD16/32 bloqueo <table border="1"><tbody><tr><td> Añadir a nada muestra de sangre o de médula ósea # 1 </td></tr><tr><td> Añadir 5 l de mezcla de anticuerpos # 2 para cada muestra de sangre o de médula ósea # 2 </td></tr><tr><td> Añadir 3 l de mezcla de anticuerpos # 3 para cada muestra de sangre o de médula ósea # 3 </td></tr><tr><td> Añadir 3 l de mezcla de anticuerpos # 4 para cada muestra de sangre o de médula ósea # 4 </td></tr><tr><td> Añadir 5 l de mezcla de anticuerpo n º 5 para cada muestra de sangre o de médula ósea # 5 </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Mantener en la oscuridad en hielo durante 30 min. </li><li> Añadir 2 ml de tampón de lisis 1X RBC a cada tubo. Mantener en la oscuridad en hielo durante 15 min. </li><li> Decantar las células a 1.500 rpm, 5 min a 4 ° C. (GH 3,8 rotor, 1.500 rpm = 350 xg) Remover el sobrenadante. Resuspender el precipitado con 500 l tampón de tinción de las células en la oscuridad brevemente, a continuación, vórtice. </li&gt; <li> Ver el CD45.1 (representando WT) y CD45.2 (representando KO) en la sangre inmunoteñida y muestras de médula ósea por citometría de flujo. Seleccione FITC para representar PESO CD45.1 y PE para representar KO CD45.2. </li><li> Analizar los resultados de la citometría de flujo por software FlowJo. Calcular la relación de FITC: PE o PE relación: relación de FITC para determinar si el genotipo donante es el genotipo predominante en la sangre y la médula ósea. </li></ol>

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<li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+bone+marrow+transplantation+%28BMT%29%3A+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).</li>
<li>Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+dose+correlates+with+the+speed+of+immune+reconstitution+after+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation.</a> Blood. 103, 4344-4352 (2004).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Este enfoque trasplante de médula ósea es adecuado para la investigación de la inmunología colitis, infección, cáncer, obesidad y otras enfermedades. Este experimento de trasplante de médula ósea es necesaria cuando el gen de interés se expresa en tanto derivadas de médula ósea y no células de la médula ósea derivados y el gen de interés se sospecha para mediar la enfermedad por células de cualquiera de la población. Por ejemplo, péptido antimicrobiano de catelicidina está demostrado que modulan la colitis aguda. Pero s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Célula tampón de tinción </td><td> BioLegend </td><td> # 420201 </td></tr><tr><td> 10X tampón de lisis RBC </td><td> BioLegend </td><td> # 420301 </td></tr><tr><td> FITC ratón isotipo de control </td><td> BioLegend </td><td> # 400207 </td></tr><tr><td> PE ratón isotipo de control </td><td> BioLegend </td><td> # 400211 </td></tr><tr><td> PE anti-ratón CD45.2 </td><td> BioLegend </td><td> # 109807 </td></tr><tr><td> FITC anti-ratón de CD45.1 </td><td> BioLegend </td><td> # 110705 </td></tr><tr><td> Anti-ratón CD16/32 bloqueo </td><td> BioLegend </td><td> # 101301 </td></tr><tr><td> 40 filtro de células micras </td><td> Fisherbrand </td><td> # 22363547 </td></tr><tr><td> PBS 1X </td><td&gt; MP Biomedicals </td><td> # 1860454 </td></tr><tr><td> La heparina </td><td> Fisherbrand </td><td> # BP2425 </td></tr><tr><td> Sulfatrim (SMZ) </td><td> Qualitest </td><td> NC9242720 (pescador) </td></tr><tr><td> Lysol IC </td><td> Andwin Científico </td><td> NC9745686 (pescador) </td></tr><tr><td> Vaccutainer </td><td> BD </td><td> # 8000813 </td></tr><tr><td> Ratón restrainer </td><td> Braintree Scientific </td><td> # TV-150 </td></tr><tr><td> Irradiador </td><td> JL Pastor y Asociados </td><td> Mark I 68A </td></tr><tr><td> Citómetro de flujo </td><td> BD </td><td> BD FACSCanto II </td></tr><tr><td> Citómetro de flujo de tubo de ensayo </td><td> Halcón </td><td> # 352052 </td></tr><tr><td> Calibre digital </td><td> Fisherbrand </td><td> 14-648-17 </td></tr><tr><td> Hemoccult TIC </td><td> Beckman Coulter </td><td> G0328QW </td></tr&gt; </tbody></table>

diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por trasplante de médula Ósea

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Para entender el papel de un gen en el desarrollo de colitis, se compararon las respuestas de los ratones de tipo salvaje y el gen de interés ratones knockout deficientes a colitis. Si el gen de interés se expresa tanto en las células derivadas de la médula ósea y no células de médula ósea derivadas del huésped, sin embargo, es posible diferenciar el papel de un gen de interés en células de médula ósea derivadas de médula y no óseo células derivadas mediante la técnica de trasplante de médula ósea. Para cambiar la médula ósea procedentes de células genotipo de los ratones, la médula ósea original de los ratones receptores fueron destruidas por irradiación y luego se sustituye por la nueva médula ósea del donante de genotipo diferente. Cuando de tipo salvaje ratones donantes de médula ósea se trasplantan a ratones knockout, se podría generar ratones knockout con la expresión del gen de tipo salvaje en células de médula ósea derivadas. Por otra parte, cuando los donantes ratones knockout médula ósea trasplantadas a ratones receptores de tipo salvaje, de tipo salvaje ratones sin el gen de interés expresarde la médula ósea células derivadas fueron producidos. Sin embargo, el trasplante de médula ósea puede no ser 100% completo. Por lo tanto, hemos utilizado cúmulo de diferenciación (CD) moléculas (CD45.1 y CD45.2) como marcadores de las células del donante y del receptor para realizar un seguimiento de la proporción de células de la médula ósea de un donante derivados en los ratones receptores y el éxito de los trasplantes de médula ósea. De tipo salvaje ratones con genotipo CD45.1 ratones knockout y con CD45.2 genotipo fueron utilizados. Después de la irradiación de ratones receptores, las células donantes de médula ósea de diferentes genotipos fueron infundidas en los ratones receptores. Cuando la nueva médula ósea regenerada para hacerse cargo de su inmunidad, los ratones se expusieron por agentes químicos (sulfato de dextrano sódico, DSS al 5%) para inducir la colitis. Aquí también mostró el método para inducir la colitis en ratones y evaluar la función del gen de interés expresado a partir de células de médula ósea derivadas. Si el gen de interés a partir de las células óseas derivadas juega un papel importante en el desarrollo de la enfermedad (tal como Escherichiatis), el fenotipo de los ratones receptores con trasplante de médula ósea puede ser alterado de manera significativa. Al final de los experimentos de colitis, la médula ósea derivada células en la sangre y la médula ósea se marcaron con anticuerpos contra CD45.1 y CD45.2 y su proporción cuantitativa de la existencia podría ser usado para evaluar el éxito del transplante de médula ósea por citometría de flujo. Éxito del trasplante de médula ósea debe mostrar una gran mayoría de genotipo donante (en término de marcador molécula de CD) a lo largo genotipo receptor tanto en la médula ósea y la sangre de los ratones receptores.

Si el gen de interés desempeña un papel significativo en las células inmunes durante el desarrollo de la colitis, los ratones que recibieron médula ósea de genotipo diferente a través de trasplante de médula ósea (WT a KO o KO a WT) debería tener una respuesta alterada a la colitis DSS. Uno de los parámetros más importantes para la determinación de la gravedad de la colitis es la tinción H &amp; E de los tejidos de colon. Colon cambios en la estructura de tejido y los signos de la inflamación pueden evaluar cuantitativa...

Trasplante de médula ósea proporciona una manera de cambiar el genotipo de las células de médula ósea derivadas. Si el gen de interés se expresa tanto en las células derivadas de la médula ósea y no células de médula ósea derivadas, transplante de médula ósea puede cambiar las células de médula ósea derivadas de un genotipo diferente sin cambiar la no de la médula ósea derivada genotipo celular.

Diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por Trasplante de Médula Ósea

Para comprender el papel de un gen en el desarrollo de la colitis, comparamos las respuestas de ratones silvestres y ratones knockout deficientes en el gen de interés...

El objetivo general del experimento mostrado en este video es evaluar si el péptido antimicrobiano lyin desempeña un papel en la mejora de la colitis inducida por sulfato de dextrano en ratones. Esto se logra inyectando médula ósea de ratones de tipo silvestre en ratones licit y knockout irradiados, y médula ósea de ratones knockout en ratones de tipo silvestre irradiados. La médula ósea trasplantada generará nuevas células sanguíneas en el receptor con el genotipo del donante.A los ratones receptores se les expone a sulfato de dextrano para inducir colitis después de cuatro semanas. El trasplante exitoso se valida mediante citometría de flujo y el daño del tejido colónico se evalúa mediante histología. Se obtienen resultados que muestran que la colitis se mitiga cuando se trasplanta médula ósea de tipo silvestre a ratones knockout.Por el contrario, la colitis empeora cuando se trasplanta médula ósea knockout a ratones de tipo salvaje. Este método puede ayudar a responder preguntas clave para determinar las expresiones génicas de células derivadas de la médula ósea o de células no derivadas de la médula ósea en procesos inflamatorios o infecciosos. Se recomiendan ratones C 57, black six, de tipo salvaje y ratones knockout C elicited para este experimento, con el fin de poder rastrear los ratones de tipo salvaje y los ratones knockout.Células donantes tras el trasplante de médula ósea. Utilice ratones CD45.1 para representar ratones de tipo salvaje y CD45.2 para los ratones knockout. El gráfico mostrado aquí describe el diseño experimental: cinco ratones donantes y diez ratones receptores se asignan a cada grupo.Para los grupos A y B, se trasplantará médula ósea de ratones de tipo salvaje a ratones knockout. Se inducirá colitis en el grupo A, pero no en el grupo B. Para los grupos C y D, se trasplantará médula ósea de ratones knockout a ratones de tipo salvaje, y se inducirá colitis únicamente en el grupo C. Para los grupos E y F, el trasplante será de tipo salvaje a tipo salvaje, y para los grupos G y H, el trasplante será de knockout a knockout. Para preparar la médula ósea donante para su transferencia a ratones irradiados, comience por extraer la médula ósea de los huesos de ratones sacrificados en una cabina de seguridad biológica.Utilice instrumentos de disección estériles para exponer los huesos del húmero, fémur, tibia y peroné, libres de músculos y ligamentos adyacentes, y transfiéralos a una placa de Petri. Corte ambos extremos de los huesos para mostrar la médula ósea roja. Luego, sujete uno de los huesos con pinzas.Extraiga la médula ósea roja con PBS frío utilizando una jeringa de tres mililitros y agujas de calibre 25 hacia otro recipiente de Petri. Luego, lave el hueso desde el otro extremo para obtener más células de la médula ósea. Repita este proceso con cada uno de los huesos.Reúna por separado la médula ósea de ratones de tipo silvestre y ratones knock out. Utilice una jeringa de seis mililitros con una aguja de 18 gauge y media pulgada para romper los coágulos de médula ósea roja mediante aspiraciones y expulsiones repetidas. Luego, use una pipeta serológica para transferir la médula ósea recolectada a un tubo cónico de 50 mililitros.Una vez que se haya transferido toda la médula ósea, centrifugar la médula ósea a 740 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado mediante vortex durante cinco a 10 segundos. Al precipitado, agregar cinco mililitros de tampón de lisis de ERX por ratón donador, volver a vortex durante cinco segundos e incubar exactamente durante tres minutos a temperatura ambiente.Después de tres minutos, agregue 20 mililitros de PBS frío a cada tubo y mezcle por inversión para detener la lisis. Luego, vierta el contenido a través de un filtro celular de 40 micrones en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Enjuague el tubo original con cinco mililitros de PBS y transfiera la solución al filtro celular.Continúe recolectando el flujo que atraviesa en el tubo cónico. Luego, aforar el volumen hasta 50 mililitros con PBS y mezclar por inversión. A continuación, determinar el recuento de células viables mediante exclusión con azul de tripan utilizando un hemocitómetro.Una vez determinado el recuento celular, centrifugar las células de médula ósea a 913 ×g durante cinco minutos a cuatro grados celsius. Tras la centrifugación, eliminar el sobrenadante según el recuento total de células. Suspender nuevamente el precipitado en PBS a una concentración de 1 × 10⁸ células por mililitro.Las células de médula ósea ya están listas para ser transferidas a ratones receptores irradiados. Los ratones receptores de tipo silvestre y knockout para este experimento han sido irradiados con 1000 rad como se describe en el documento adjunto; los ratones se crían y mantienen en una instalación libre de patógenos. De cuatro a 24 horas después de la irradiación, caliente los ratones receptores sobre una almohadilla térmica bajo una lámpara de calor para inyectarles la médula ósea donante. Coloque un ratón receptor en un dispositivo de inmovilización, limpie la cola con etanol al 70 % para esterilizar el sitio de inyección y promover la vasodilatación local que facilite la inyección.Utilizando una jeringa de insulina con una aguja de calibre 28 y medio, inyecte una vez 10 a la séptima células en uno a 200 microlitros en la vena de la cola de cada ratón tras la inyección. Coloque el ratón en una jaula con hasta otros tres ratones inyectados durante las primeras cuatro semanas tras la inyección. Mantenga a los ratones receptores inyectados en jaulas autoclavadas con agua que contenga el antibiótico sulfa trim.Esto permite tiempo para que los animales recuperen la inmunidad, cambien las jaulas y se administren agua y alimento tratados con antibióticos cada cuatro días para mantener la higiene. Cuatro semanas después de la irradiación y el trasplante de médula ósea, cambie al agua normal sin antibióticos y mantenga a los ratones durante otras dos semanas para que recuperen su microbiota intestinal normal. Seis semanas después de la inyección de médula ósea, mida el peso corporal inicial para inducir la colitis.Administre a los ratones del grupo experimental de colitis 5 % de dextrano sulfato en el agua de bebida. Cinco días después, reúna la sangre periférica de cuatro ratones en tubos vacutainer recubiertos con heparina y colóquelos en hielo. Luego, en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros, combine 300 microlitros de sangre con 300 microlitros de tampón para tinción celular y alícuote la sangre en cinco tubos de citometría de flujo etiquetados del uno al cinco, cada uno con 100 microlitros sobre hielo.Después de sacrificar los ratones, mida nuevamente el peso corporal y calcule el cambio. Diseque los tejidos del colon y colóquelos en formalina para tinción con H y E. Luego obtenga las células de la médula ósea como antes.Divida la médula ósea resuspendida en cinco tubos de microcentrífuga etiquetados del uno al cinco, cada uno con 100 mililitros. En preparación para el análisis mediante citometría de flujo, prepare la mezcla de anticuerpos para cada tubo respectivo en la oscuridad, como se describe en el documento adjunto; las muestras de sangre y médula ósea etiquetadas con el número uno servirán como controles y no serán teñidas. Las muestras de sangre y médula ósea etiquetadas con el número dos serán teñidas con el control de isotipo FITC, el control de isotipo PE y la solución bloqueadora CD16/32.Estos controles de isotipo se utilizan para confirmar la especificidad de la unión del anticuerpo primario a las muestras. La muestra etiquetada con el número tres será teñida con FZ CD 45.1 y CD 16/32. Las muestras con solución bloqueante etiquetadas con el número cuatro serán teñidas con CD 45.2 y CD 16/32.Solución de bloqueo. La marcación con un solo color puede revelar la presencia de células donantes o receptoras en la sangre o en la médula ósea. Evidentemente, las muestras etiquetadas con el número cinco se tiñen para CD 45.1, CD 45.2 y CD 16/32.El bloqueo aquí permite que la marcación bicolor muestre la proporción relativa de células donantes y receptoras en sangre o médula ósea. Añada cinco microlitros de la mezcla de anticuerpos dos y cinco a sus respectivos tubos de muestra. Luego, añada tres microlitros de la mezcla de anticuerpos tres y cuatro a sus respectivos tubos de muestra.Incube todos los tubos en hielo durante 30 minutos. Tras la incubación, agregue dos mililitros de tampón de lisis XRBC a cada tubo. Luego, incube las muestras durante otros 15 minutos en hielo y en la oscuridad.Centrifugar las células a 350 ×g durante cinco minutos a cuatro grados celsius. Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento con 500 µL de tampón de tinción celular en la oscuridad. Luego, vortexear brevemente.A continuación, realice citometría de flujo en las muestras de sangre y médula ósea inmunomarcadas. Seleccione FZ para representar el tipo salvaje CD 45.1 y PE para representar el CD 45.2 nulo. Analice los resultados de la citometría de flujo utilizando el software de Flo Joe.Calcule la relación de ajuste de E a relación PE o relación de PE a ajuste de e para determinar si el genotipo del donante es un genotipo dominante en sangre y médula ósea. Esta imagen muestra imágenes de muestra de h y e de colon con histología normal y colitis por DSS. Las imágenes de histología se puntúan según el daño del tejido mucoso y la infiltración de neutrófilos en los tejidos mucosos y submucosos.Por lo tanto, un puntaje histológico más alto indica una colitis más severa para evaluar si la lisina desempeña un papel en la prevención de la colitis. Se intercambió la médula ósea entre ratones de tipo silvestre y ratones knockout como se describe en este video. Luego, se evaluó y puntuó la histología como se muestra aquí.Los puntajes de histología aumentaron significativamente cuando se introdujo médula ósea de ratones knockout en ratones salvajes irradiados. Por el contrario, los puntajes disminuyeron significativamente cuando se introdujo médula ósea de ratones salvajes en ratones knockout. Estos datos indican que la proteína C endógena procedente de células derivadas de la médula ósea tiene efectos antiinflamatorios y mejora la colitis, lo que verifica que el trasplante fue exitoso en estos ratones.Se realizó citometría de flujo también en médula ósea y sangre de los ratones tras el trasplante. La médula ósea de tipo salvaje se tiñe intensamente para Fitz CD 45.1, pero no para pe, CD 45.2 como se muestra aquí; la médula ósea knockout se tiñe intensamente para PE, pero no para Fitz, como se muestra aquí. Sin embargo, tras el trasplante, tanto la médula ósea como la sangre de ratones de tipo salvaje que recibieron médula ósea knockout mostraron tinción intensa para PE, pero no para Fitz, lo que indica que la población predominante de células teñidas provenía del donante.Asimismo, la médula ósea y la sangre de ratones knockout que recibieron médula ósea de tipo silvestre se tiñeron intensamente para fitzy pero no para pe, confirmando nuevamente que las poblaciones predominantemente teñidas eran de origen donante. Después de ver este video, usted debería ser capaz de realizar un experimento de trasplante de médula ósea y debería ser capaz de modificar la colitis mediante células derivadas de la médula ósea.

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