Diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por Trasplante de Médula Ósea

El objetivo general del experimento demostrado en este video es evaluar si el péptido antimicrobiano liaína desempeña un papel en la mejora de la colitis inducida por sulfato de dextrano en ratones. Esto se logra inyectando médula ósea de ratones de tipo salvaje en ratones lícitos y knockout irradiados y médula ósea de ratones knockout en ratones de tipo salvaje irradiados. La médula ósea trasplantada generará nuevas células sanguíneas en el genotipo del receptor del donante.

A continuación, los ratones receptores se exponen al sulfato de dextrano para inducir colitis después de cuatro semanas. El trasplante exitoso se valida mediante citometría de flujo y el daño tisular colónico se evalúa mediante histología. Se obtienen resultados que muestran que la colitis mejora cuando se trasplanta médula ósea de tipo salvaje a ratones knockout.

Por el contrario, la colitis empeora cuando la médula ósea knockout se trasplanta a ratones de tipo salvaje. Este método puede ayudar a responder preguntas clave para determinar las expresiones génicas de células derivadas de la médula ósea o células no derivadas de la médula ósea en la inflamación o la infección. Para este experimento se recomiendan los ratones C 57, Black Six, Wild Type y C Knockout para que sea posible rastrear a los ratones de tipo salvaje y a los ratones knockout.

Células de donantes después de un trasplante de médula ósea. Use ratones CD 45.1 para representar ratones de tipo salvaje y CD 45.2 para los ratones knockout. El gráfico que se muestra aquí describe la configuración experimental: se asignan cinco ratones donantes y 10 ratones receptores para cada grupo.

Para los grupos A y B, la médula ósea se trasplantará de los ratones de tipo salvaje a los ratones knockout. La colitis se inducirá en el grupo A, pero no en el grupo B. Para los grupos C y D. La médula ósea se trasplantará de los ratones knockout al tipo salvaje y la colitis se inducirá en el grupo C solo para E y F. El trasplante será de tipo salvaje a tipo salvaje y para los grupos G y H. El trasplante será de nocaut a nocaut. Para preparar la médula ósea del donante para transferirla a los ratones irradiados, comience por extraer la médula ósea de los huesos de los ratones sacrificados en un gabinete de bioseguridad.

Use instrumentos de disección estériles para exponer los huesos del húmero, fémur, tibia y peroné libres de músculos y ligamentos adheridos y transfiéralos a una placa de Petri. Corta ambos extremos de los huesos para mostrar la médula ósea roja. Luego agarrando uno de los huesos con fórceps.

Enjuague la médula ósea roja con PBS frío con una jeringa de tres mililitros y agujas de calibre 25 en otra placa de Petri. A continuación, enjuague el hueso desde el otro extremo para producir más células de médula ósea. Repite este proceso con cada uno de los huesos.

Agrupa la médula ósea de tipo salvaje y noquea a los ratones por separado. Use una jeringa de seis mililitros con una aguja de calibre 18 de media pulgada para romper los tapones rojos de la médula ósea mediante aspiración y eyección repetidas. A continuación, utilice una pipeta serológica para transferir la médula ósea recogida a un tubo cónico de 50 mililitros.

Una vez que se haya transferido toda la médula ósea, gire la médula ósea a 740 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después del centrifugado, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet mediante vórtice durante cinco a 10 segundos. Al pellet, agregue cinco mililitros de un tampón de lisis XRBC por vórtice de ratón donante nuevamente durante cinco segundos e incube durante exactamente tres minutos a temperatura ambiente.

Después de tres minutos, agregue 20 mililitros de PBS frío a cada tubo y mezcle por inversión para detener la lisis. A continuación, vierta el contenido a través de un colador de células de 40 micras en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Enjuague el tubo original con cinco mililitros de PBS y transfiera la solución al filtro de celdas.

Continuando recogiendo el flujo a través del tubo cónico. A continuación, sube el volumen a 50 mililitros con PBS y mezcla por inversión. A continuación, determine el recuento de células viables por exclusión de azul triano utilizando un hemocímetro.

Una vez que se ha determinado el recuento de células, se centrifugan las células de la médula ósea a 913 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después del centrifugado, retire el sobrenadante en función del recuento total de células. Resus suspende el pellet en PBS a una vez 10 a la octava celdas por mililitro.

Las células de la médula ósea ya están listas para ser transferidas a ratones receptores irradiados. Los ratones receptores de tipo salvaje y knockout para este experimento han sido irradiados con 1000 rad como se describe en el documento adjunto, los ratones se crían y se alojan en una instalación libre de patógenos de cuatro a 24 horas después de que la irradiación calentó a los ratones receptores en una almohadilla térmica debajo de una lámpara de calentamiento para inyectar la médula ósea del donante. Coloque un ratón receptor en el retenedor, limpie la cola con etanol al 70% para esterilizar el sitio de inyección y promover la vasodilatación local para facilitar la inyección.

Usando una jeringa de insulina con una aguja de calibre 28 y medio, inyecte una vez 10 a la séptima célula en uno a 200 microlitros en la vena de la cola de cada ratón después de la inyección. Coloque al ratón en una jaula con hasta otros tres ratones inyectados durante las primeras cuatro semanas después de la inyección. Mantenga a los ratones receptores inyectados en jaulas de autoclave con agua que contenga el antibiótico sulfamida.

Esto da tiempo para que los animales recuperen la inmunidad, cambien las jaulas, el agua tratada con antibióticos y la comida cada cuatro días para mantener la higiene. Cuatro semanas después de la irradiación y el trasplante de médula ósea, cambie a agua regular sin antibióticos y mantenga a los ratones durante dos semanas más para que recuperen su microflora intestinal normal. Seis semanas después de la inyección de médula ósea, mida el peso corporal inicial para inducir la colitis.

Administre a los ratones del grupo experimental de colitis sulfato de dextrano al 5% en el agua potable. Cinco días después, reúna la sangre periférica de cuatro ratones en tubos recubiertos de heparina y colóquela en hielo. Luego, en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, combine 300 microlitros de sangre con 300 microlitros de tinción celular, tampón y alícuota la sangre en cinco tubos de ensayo de citometría de flujo marcados del uno al cinco cada uno con 100 microlitros en hielo.

Después de sacrificar a los ratones, vuelva a medir el peso corporal y calcule el cambio. Diseccionar los tejidos del colon y marcarlos en formol para la tinción h y d. A continuación, obtenga células de médula ósea como antes.

Divida la médula ósea resuspendida en cinco tubos de microcentrífuga etiquetados del uno al cinco con 100 mililitros cada uno. En preparación para el análisis por citometría de flujo, prepare la mezcla de anticuerpos para cada tubo respectivo en la oscuridad como se describe en el documento adjunto, las muestras de sangre y médula ósea etiquetadas con el número uno servirán como controles y no serán muestras de sangre y médula ósea teñidas. El número dos marcado se teñirá con control de isotipo fitzy, control de isotipo PE y solución de bloqueo CD 16 slash 32.

Estos controles de isotipo se utilizan para confirmar la especificidad de las muestras primarias de unión a anticuerpos. La etiqueta número tres se teñirá con FZ CD 45.1 y CD 16 slash 32. Las muestras de solución de bloqueo etiquetadas como número cuatro se teñirán con CD 45.2 y CD 16 barra 32.

Solución de bloqueo. El etiquetado de un solo color puede revelar la presencia de células donantes o receptoras en la sangre o la médula ósea. Claramente, las muestras etiquetadas como número cinco se teñirán para CD 45.1, CD 45.2 y CD 16 barra 32.

Bloqueando aquí el etiquetado de doble color muestra la proporción relativa de células donantes y receptoras en la sangre o la médula ósea. Agregue cinco microlitros de la mezcla de anticuerpos dos y cinco a sus respectivos tubos de muestra. A continuación, añada tres microlitros de la mezcla de anticuerpos tres y cuatro a sus respectivos tubos de muestra.

Incuba todos los tubos en hielo durante 30 minutos. Después de la incubación, agregue dos mililitros, un tampón de lisis XRBC a cada tubo. A continuación, incubar las muestras durante otros 15 minutos en hielo en la oscuridad.

Gire las celdas a 350 veces G, cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después del centrifugado, retire el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet con tampón de tinción celular de 500 microlitros en la oscuridad. Luego vórtice brevemente.

A continuación, realice la citometría de flujo en las muestras de sangre y médula ósea de la tinción inmunológica. Seleccione FZ para representar el CD 45.1 de tipo salvaje y PE para representar el CD 45.2 de knockout. Analice los resultados de la citometría de flujo utilizando el software de Flo Joe.

Calcule la relación entre la relación entre la E y la EP o la relación entre la EP y la E ajustada para determinar si el genotipo del donante es el genotipo dominante en la sangre y la médula ósea. Esta imagen muestra muestras de imágenes h y e de colones con histología normal y colitis DSS. Las imágenes histológicas se puntúan en función del daño del tejido mucoso y la infiltración de neutrófilos en los tejidos mucosos y submucosos.

Por lo tanto, una puntuación histológica más alta indica una colitis más grave para probar si la lisína desempeña un papel en la prevención de la colitis. Se intercambió médula ósea entre ratones de tipo salvaje y ratones knockout, como se describe en este video. A continuación, se evaluó la histología y se puntuó como se muestra aquí.

Las puntuaciones histológicas aumentaron significativamente cuando se introdujo médula ósea de ratón knockout en ratones de tipo salvaje irradiados. Por el contrario, las puntuaciones disminuyeron significativamente cuando se introdujo médula ósea de tipo salvaje a ratones knockout. Estos datos indican que el C endógeno de las células derivadas de la médula ósea tiene efectos antiinflamatorios y mejora la colitis para verificar que el trasplante fue exitoso en estos ratones.

También se realizó citometría de flujo en médula ósea y sangre de los ratones después del trasplante. La médula ósea de tipo salvaje se tiñe fuertemente para Fitz CD 45.1 pero no para PE, CD 45.2 como se muestra aquí, la médula ósea knockout se tiñe fuertemente para EP pero no para Fitz como se muestra aquí. Sin embargo, después del trasplante, tanto la médula ósea como la sangre de ratones de tipo salvaje que recibieron médula ósea knockout se tiñeron fuertemente para EP pero no para Fitz, lo que indica que la población predominante de células teñidas era del donante.

Del mismo modo, la médula ósea y la sangre de ratones knockout que recibieron médula ósea de tipo salvaje se tiñeron fuertemente para fitzy, pero no para pe, lo que confirma que las poblaciones teñidas predominantes eran de origen donante. Después de ver este video, debería poder realizar un experimento de trasplante de médula ósea y debería poder modificar la colitis a través de células derivadas de la médula ósea.