Name: Diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por Trasplante de Médula Ósea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Aprende a diferenciar los roles funcionales de la expresión génica en células inmunes y no inmunes durante la colitis inducida por sulfato de dextrano en ratones mediante trasplante de médula ósea.

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Este trabajo fue financiado por el piloto y la subvención Estudio de Viabilidad de la UCLA-CURE Center, la enfermedad de Crohn y Colitis Foundation of America Award de Desarrollo Profesional (# 2691) y el Instituto Nacional de Salud NIDDK K01 (DK084256) la financiación a Hon Wai Koon. La médula ósea operación irradiación fue asistido por Bernard Levin y Cocina Scott de UCLA Center for AIDS Research Mouse / instalaciones Humanos Core Chimera. Operación de citometría de flujo fue asistido por instalaciones UCLA Core Vector.

1. Antes-de-empezar Consideraciones técnicas <ol><li> Le recomendamos que use C57/BL6 ratones de tipo salvaje y ratones knockout para el experimento porque los ratones con moléculas de CD correspondientes pueden adquirirse de los proveedores más importantes del ratón. </li><li> Puesto que es difícil realizar un seguimiento de los ratones de tipo salvaje y de ratones knockout derivados células del donante después del trasplante de médula ósea, es necesario utilizar CD45.1 ratones para representar ratones de tipo salvaje. (CD45.1 C57/SJL PESO ratones Jackson Laboratorios de stock # 002014). </li><li> La mayoría de las colonias de ratones son CD45.2. Nuestros ratones knockout pertenecen a CD45.2 genotipo (o bien una fuente CD45.2 ratones WT: Jackson Laboratories stock # 000664). La determinación de CD45.1 o CD45.2 genotipo se puede realizar mediante citometría de flujo de la médula ósea y la sangre periférica como se ha mencionado en la sección 7 de este protocolo. </li><li> Los ratones después de la irradiación han puesto en peligro la inmunidad. Mantener los ratones en instalación libre de patógenos. </li><li> Funcionamiento del irradiador requiere especial clearanc seguridade y formación. Para ahorrar tiempo en los procesos de formación y aprobación, lo mejor es colaborar con un laboratorio con personal cualificado que sea capaz de manejar el irradiador. </li><li> Muchas instituciones cuentan con laboratorios de citometría de flujo con técnicos experimentados. Para minimizar los problemas de funcionamiento de citometría de flujo, es mejor discutir su plan de citometría de flujo experimentar con el técnico con experiencia antes de empezar. </li><li> Los ratones fueron asignados de esta manera (10 ratones por grupo): </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Grupo </td><td></td><td> Donante de médula ósea para el destinatario </td><td> Tratamiento </td></tr><tr><td> La </td><td> BM intercambio </td><td> CD45.1 WT KO CD45.2 </td><td> DSS colitis </td></tr><tr><td> B </td><td></td><td></td><td> Agua control normal </td></tr><tr><td> C </td><td> BM intercambio </td><td> CD45.2 KO a CD45.1 PESO </td><td> DSS colitis </td></tr><tr><td> D </td><td></td><td></td><td> Agua control normal </td></tr><tr><td> E </td><td> Falso </td><td> CD45.1 WT para CD45.1 PESO </td><td> DSS colitis </td></tr><tr><td> F </td><td></td><td></td><td> Agua control normal </td></tr><tr><td> G </td><td> Falso </td><td> CD45.2 KO KO a CD45.2 </td><td> DSS colitis </td></tr><tr><td> H </td><td></td><td></td><td> Agua control normal </td></tr></tbody></table> * Una breve ilustración del protocolo experimental se muestra en la figura 1. 2. Los ratones receptores irradiación <ol><li> Los ratones son criados y mantenidos en instalaciones libres de patógenos. Coloque los ratones en pie irradiación autoclave con filtro. Coloque un ratón en cada ranura de pastel de irradiación. Coloque el pastel en el irradiador y asegúrese de que el plato giratorio y el pastel está dando vuelta. </li><li> Encienda la bomba de airepara la ventilación. Cierre la puerta del irradiador y bloquearlo. </li><li> Irradiar a los ratones con 1.000 rad (que es equivalente a 10 Gy) alrededor de 10 min (dependiendo de la fuente de radiación y la vida media-). Desde este punto de tiempo, los ratones irradiados son inmunodeficientes y tienen inmunidad débil contra la infección. Después de la irradiación, tomar la tarta y colocar en un recipiente estéril para transportarlo al gabinete de bioseguridad en las instalaciones de los animales. Evite la exposición de los ratones con el medio ambiente externo para minimizar las posibilidades de infección. </li><li> En gabinete de bioseguridad, la transferencia a las jaulas de los ratones del ratón autoclave autoclave con ropa de cama (4 ratones por jaula Agregue agua estéril nueva suspensión Sulfatrim -. 3,12 ml por 100 ml de agua). </li><li> Envuelva la botella de agua con papel de aluminio, como los antibióticos son sensibles a la luz. Agitar para mezclar la botella de solución Sulfatrim bien antes de cargarlo a la jaula. </li></ol> 3. Donantes de Médula Ósea de extracción <ol><li> Sacrificar los ratones con dióxido de carbono o isoflurmiento y luego sumergir en solución 1:200 Lysol. Rocíe los ratones con 70% de etanol para humedecer la piel y diseccionar huesos abiertos. </li><li> Remojar los instrumentos de disección en 70% de etanol para la esterilización. </li><li> Realizar la disección en un gabinete de bioseguridad. Utilizar los instrumentos de disección estéril para exponer el húmero, el fémur, la tibia y el peroné huesos, libre de fijación de los músculos y ligamentos. </li><li> Cortar abrir ambos extremos de los huesos para mostrar la médula ósea roja. Mantenga los huesos con fórceps. Lavar la médula ósea roja con PBS frío con jeringa de 3 ml y agujas de 25G a una placa de Petri. Enjuague de ambos extremos de los huesos para producir células de la médula ósea más. </li><li> Use 6 ml jeringas y agujas 18G1 / 2 a romper los tapones rojos de médula ósea por aspiración repetida y expulsión. Transferencia de médula ósea con 50 ml tubos Falcon. </li><li> Girar la médula ósea en 1.800 rpm durante 5 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante, resuspender el sedimento por agitación durante 5-10 segundos. </li><li> Diluir el tampón de lisis de RBC 10 veces con agua estéril. Anunciod 1X tampón de lisis RBC (5 ml por ratón donante) y agitar de nuevo durante 5 segundos y mantener exactamente 3 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Después de 3 min, llenar los tubos con 20 ml de PBS frío para detener la lisis y mezclar. Verter el contenido a través de un filtro de células 40 micras directamente en un nuevo tubo Falcon de 50 ml. </li><li> Enjuague los tubos originales con 5 ml de PBS y transferir a filtro de células así. Completar hasta 50 ml con PBS y mezclar. </li></ol> 4. Contando Bone Marrow Donor células <ol><li> Añadir 100 l de azul de tripano a un tubo Eppendorf y 100 l de suspensión de médula ósea a un tubo Eppendorf y se mezcla. Pipetear la mezcla de células teñidas con un hemocitómetro. </li><li> La cantidad de células se calcula por recuento total de células de médula ósea de estar en los tubos Falcon = número de células sin teñir en 16 cuadrados x 2 (debido a la dilución Trypan azul) x 10.000 x 50 ml </li><li> Decantar las células de médula ósea en 50 ml en tubos Falcon de 2.000 rpm durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante. Basadoen el total de células, se resuspende el pellet con PBS a 1 x 10 8 células por ml </li></ol> 5. Infusión a ratones receptores <ol><li> Calentar los ratones receptores sobre una almohadilla de calor y bajo una lámpara de calentamiento. Ponga los ratones receptores de inmovilización. Inyectar 1 x 10 7 células por ratón en 100-200 l por vía intravenosa. </li><li> La inyección de médula ósea de un donante se debe hacer entre 4-24 horas después de la irradiación. </li><li> Manténgase 4 ratones inyectados por jaula. Mantener los ratones receptores inyectados en jaulas autoclave con agua tratada con antibióticos durante las primeras 4 semanas en las instalaciones patógeno animal libre y dejar que los ratones recuperar la inmunidad. Cambio jaulas, tratado con antibióticos en aguas y alimentos cada 4 días para mantener la higiene. </li></ol> 6. La inducción de la colitis y la evaluación de la colitis <ol><li> 4 semanas después del trasplante de médula ósea y la irradiación, cambiar a agua normal sin antibióticos y mantener los ratones durante 2 semanas más para recuperar su normalidadla microflora intestinal. </li><li> 6 semanas después de la inyección de médula ósea, medir el peso corporal inicial. Algunos ratones se les da 5% de sulfato de dextrano en beber agua ad libitum para inducir la colitis. Algunos ratones se les da agua potable regular sólo como grupos de control normales. </li><li> 5 días después, extraer sangre periférica, traslado a tubos recubiertos de heparina (Vacutainer) y mantener en hielo. Piscina de la sangre de los ratones 4 a 1 metro. Combine 300 l de sangre con 300 l de buffer de tinción celular = 600 l. Divida la sangre a 5 tubos Eppendorf, cada uno con 100 l. </li><li> Sacrificar los ratones con dióxido de carbono o isoflurano. Evaluar resultados macroscópicos daños (por favor refiérase a otra publicación vídeo JOVE para obtener más información 1). Medir el cambio de peso corporal. Medir la longitud del intestino grueso y con calibrador digital. Observe textura heces (dura, blanda o con sangre). Determinar sangre oculta en las heces con Hemooccult. Disecciona tejidos de colon y fijar en formol para H &amp; E tinción. </li><li> Disecciona un fémur bone por ratón, se extrae médula ósea y enjuagar la médula ósea con PBS frío a través de aguja 25G y una jeringa de 1 ml. De 4 estrella médula ósea se conecta a un tubo y mantener en hielo. </li><li> Verter la médula ósea a una placa de Petri, la cizalladura del tapón de médula ósea con aguja 18G y 5 ml jeringa varias veces hasta que no enchufe médula ósea está presente. </li><li> Decantar con 1.500 rpm durante 5 min a 4 ° C. Remover el sobrenadante y resuspender con 600 l tampón de tinción celular. Divida la médula ósea se resuspendieron a 5 tubos Eppendorf, cada uno con 100 l. </li></ol> 7. Inspección de Calidad de Trasplante de Médula Ósea por citometría de flujo <ol><li> Etiquete cada tubo de muestra de sangre o de médula ósea # 1-5: </li><li> Preparar la mezcla de anticuerpos para cada tubo respectivo en la oscuridad. </li></ol> # 1 No anticuerpo # 2 30 l control de isotipo FITC + 30 mu l PE control de isotipo + 15 mu l CD16/32 bloqueo # 3 30 l FITC CD45.1 Ab + 15 mu l CD16/32 bloqueo # 4 30 l PECD45.2 Ab + 15 mu l CD16/32 bloqueo # 5 30 l FITC CD45.1 Ab + 30 l PE CD45.2 Ab + 15 mu l CD16/32 bloqueo <table border="1"><tbody><tr><td> Añadir a nada muestra de sangre o de médula ósea # 1 </td></tr><tr><td> Añadir 5 l de mezcla de anticuerpos # 2 para cada muestra de sangre o de médula ósea # 2 </td></tr><tr><td> Añadir 3 l de mezcla de anticuerpos # 3 para cada muestra de sangre o de médula ósea # 3 </td></tr><tr><td> Añadir 3 l de mezcla de anticuerpos # 4 para cada muestra de sangre o de médula ósea # 4 </td></tr><tr><td> Añadir 5 l de mezcla de anticuerpo n º 5 para cada muestra de sangre o de médula ósea # 5 </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Mantener en la oscuridad en hielo durante 30 min. </li><li> Añadir 2 ml de tampón de lisis 1X RBC a cada tubo. Mantener en la oscuridad en hielo durante 15 min. </li><li> Decantar las células a 1.500 rpm, 5 min a 4 ° C. (GH 3,8 rotor, 1.500 rpm = 350 xg) Remover el sobrenadante. Resuspender el precipitado con 500 l tampón de tinción de las células en la oscuridad brevemente, a continuación, vórtice. </li&gt; <li> Ver el CD45.1 (representando WT) y CD45.2 (representando KO) en la sangre inmunoteñida y muestras de médula ósea por citometría de flujo. Seleccione FITC para representar PESO CD45.1 y PE para representar KO CD45.2. </li><li> Analizar los resultados de la citometría de flujo por software FlowJo. Calcular la relación de FITC: PE o PE relación: relación de FITC para determinar si el genotipo donante es el genotipo predominante en la sangre y la médula ósea. </li></ol>

<ol><li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Intestinal+Inflammation+in+DSS-induced+Model+of+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD.</a> J. Vis. Exp. (60), e3678(2012).</li>
<li>Ungaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Toll-like+receptor+4+antagonist+antibody+ameliorates+inflammation+but+impairs+mucosal+healing+in+murine+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).</li>
<li>Castagliuolo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+neurokinin-1+receptor+during+colitis+in+mice%3A+role+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor.</a> Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).</li>
<li>Koon, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathelicidin+signaling+via+the+Toll-like+receptor+protects+against+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Cathelicidin signaling via the Toll-like receptor protects against colitis in mice.</a> Gastroenterology. 141, 1852-1863 (2011).</li>
<li>Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+cells+in+murine+colitis%3A+multi-signal+analysis+confirms+pericryptal+myofibroblast+engraftment+without+epithelial+involvement%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">marrow cells in murine colitis: multi-signal analysis confirms pericryptal myofibroblast engraftment without epithelial involvement.</a> PLoS One. 6, e11(2011).</li>
<li>Deng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+cell+therapy+using+bone+marrow-derived+stem+cells%2Fendothelial+progenitor+cells+to+accelerate+neovascularization+in+healing+of+experimental+ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">New cell therapy using bone marrow-derived stem cells/endothelial progenitor cells to accelerate neovascularization in healing of experimental ulcerative colitis.</a> Curr. Pharm. Des. 17, 1643-1651 (2011).</li>
<li>Valcz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+aggregates+may+contribute+to+the+migration+and+epithelial+commitment+of+bone+marrow-derived+cells+in+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Lymphoid aggregates may contribute to the migration and epithelial commitment of bone marrow-derived cells in colonic mucosa.</a> J. Clin. Pathol. 64, 771-775 (2011).</li>
<li>Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+bone+marrow-derived+monocytes%2Fmacrophages+in+the+repair+of+mucosal+damage+caused+by+irradiation+and%2For+anticancer+drugs+in+colitis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model.</a> Mediators Inflamm. 2010, 634145(2010).</li>
<li>Bakhautdin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+of+macrophage-derived+ceruloplasmin+in+inflammatory+bowel+disease.+%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in inflammatory bowel disease. </a> Gut. , (2012).</li>
<li>Seta, N., Kuwana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+multipotent+progenitors+from+human+circulating+CD14%2B+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes.</a> Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).</li>
<li>Crain, B. J., Tran, S. D., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+human+bone+marrow+cells+generate+new+brain+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells.</a> J. Neurol. Sci. 233, 121-123 (2005).</li>
<li>Finnberg, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+and+antitumor+effects+of+GFP%28%2B%29+bone+marrow-derived+cells+homing+to+syngeneic+mouse+colon+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors.</a> Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).</li>
<li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+bone+marrow+transplantation+%28BMT%29%3A+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).</li>
<li>Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+dose+correlates+with+the+speed+of+immune+reconstitution+after+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation.</a> Blood. 103, 4344-4352 (2004).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Este enfoque trasplante de médula ósea es adecuado para la investigación de la inmunología colitis, infección, cáncer, obesidad y otras enfermedades. Este experimento de trasplante de médula ósea es necesaria cuando el gen de interés se expresa en tanto derivadas de médula ósea y no células de la médula ósea derivados y el gen de interés se sospecha para mediar la enfermedad por células de cualquiera de la población. Por ejemplo, péptido antimicrobiano de catelicidina está demostrado que modulan la colitis aguda. Pero s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Célula tampón de tinción </td><td> BioLegend </td><td> # 420201 </td></tr><tr><td> 10X tampón de lisis RBC </td><td> BioLegend </td><td> # 420301 </td></tr><tr><td> FITC ratón isotipo de control </td><td> BioLegend </td><td> # 400207 </td></tr><tr><td> PE ratón isotipo de control </td><td> BioLegend </td><td> # 400211 </td></tr><tr><td> PE anti-ratón CD45.2 </td><td> BioLegend </td><td> # 109807 </td></tr><tr><td> FITC anti-ratón de CD45.1 </td><td> BioLegend </td><td> # 110705 </td></tr><tr><td> Anti-ratón CD16/32 bloqueo </td><td> BioLegend </td><td> # 101301 </td></tr><tr><td> 40 filtro de células micras </td><td> Fisherbrand </td><td> # 22363547 </td></tr><tr><td> PBS 1X </td><td&gt; MP Biomedicals </td><td> # 1860454 </td></tr><tr><td> La heparina </td><td> Fisherbrand </td><td> # BP2425 </td></tr><tr><td> Sulfatrim (SMZ) </td><td> Qualitest </td><td> NC9242720 (pescador) </td></tr><tr><td> Lysol IC </td><td> Andwin Científico </td><td> NC9745686 (pescador) </td></tr><tr><td> Vaccutainer </td><td> BD </td><td> # 8000813 </td></tr><tr><td> Ratón restrainer </td><td> Braintree Scientific </td><td> # TV-150 </td></tr><tr><td> Irradiador </td><td> JL Pastor y Asociados </td><td> Mark I 68A </td></tr><tr><td> Citómetro de flujo </td><td> BD </td><td> BD FACSCanto II </td></tr><tr><td> Citómetro de flujo de tubo de ensayo </td><td> Halcón </td><td> # 352052 </td></tr><tr><td> Calibre digital </td><td> Fisherbrand </td><td> 14-648-17 </td></tr><tr><td> Hemoccult TIC </td><td> Beckman Coulter </td><td> G0328QW </td></tr&gt; </tbody></table>

diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por trasplante de médula Ósea

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Para entender el papel de un gen en el desarrollo de colitis, se compararon las respuestas de los ratones de tipo salvaje y el gen de interés ratones knockout deficientes a colitis. Si el gen de interés se expresa tanto en las células derivadas de la médula ósea y no células de médula ósea derivadas del huésped, sin embargo, es posible diferenciar el papel de un gen de interés en células de médula ósea derivadas de médula y no óseo células derivadas mediante la técnica de trasplante de médula ósea. Para cambiar la médula ósea procedentes de células genotipo de los ratones, la médula ósea original de los ratones receptores fueron destruidas por irradiación y luego se sustituye por la nueva médula ósea del donante de genotipo diferente. Cuando de tipo salvaje ratones donantes de médula ósea se trasplantan a ratones knockout, se podría generar ratones knockout con la expresión del gen de tipo salvaje en células de médula ósea derivadas. Por otra parte, cuando los donantes ratones knockout médula ósea trasplantadas a ratones receptores de tipo salvaje, de tipo salvaje ratones sin el gen de interés expresarde la médula ósea células derivadas fueron producidos. Sin embargo, el trasplante de médula ósea puede no ser 100% completo. Por lo tanto, hemos utilizado cúmulo de diferenciación (CD) moléculas (CD45.1 y CD45.2) como marcadores de las células del donante y del receptor para realizar un seguimiento de la proporción de células de la médula ósea de un donante derivados en los ratones receptores y el éxito de los trasplantes de médula ósea. De tipo salvaje ratones con genotipo CD45.1 ratones knockout y con CD45.2 genotipo fueron utilizados. Después de la irradiación de ratones receptores, las células donantes de médula ósea de diferentes genotipos fueron infundidas en los ratones receptores. Cuando la nueva médula ósea regenerada para hacerse cargo de su inmunidad, los ratones se expusieron por agentes químicos (sulfato de dextrano sódico, DSS al 5%) para inducir la colitis. Aquí también mostró el método para inducir la colitis en ratones y evaluar la función del gen de interés expresado a partir de células de médula ósea derivadas. Si el gen de interés a partir de las células óseas derivadas juega un papel importante en el desarrollo de la enfermedad (tal como Escherichiatis), el fenotipo de los ratones receptores con trasplante de médula ósea puede ser alterado de manera significativa. Al final de los experimentos de colitis, la médula ósea derivada células en la sangre y la médula ósea se marcaron con anticuerpos contra CD45.1 y CD45.2 y su proporción cuantitativa de la existencia podría ser usado para evaluar el éxito del transplante de médula ósea por citometría de flujo. Éxito del trasplante de médula ósea debe mostrar una gran mayoría de genotipo donante (en término de marcador molécula de CD) a lo largo genotipo receptor tanto en la médula ósea y la sangre de los ratones receptores.

Si el gen de interés desempeña un papel significativo en las células inmunes durante el desarrollo de la colitis, los ratones que recibieron médula ósea de genotipo diferente a través de trasplante de médula ósea (WT a KO o KO a WT) debería tener una respuesta alterada a la colitis DSS. Uno de los parámetros más importantes para la determinación de la gravedad de la colitis es la tinción H &amp; E de los tejidos de colon. Colon cambios en la estructura de tejido y los signos de la inflamación pueden evaluar cuantitativa...

Trasplante de médula ósea proporciona una manera de cambiar el genotipo de las células de médula ósea derivadas. Si el gen de interés se expresa tanto en las células derivadas de la médula ósea y no células de médula ósea derivadas, transplante de médula ósea puede cambiar las células de médula ósea derivadas de un genotipo diferente sin cambiar la no de la médula ósea derivada genotipo celular.

Diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por Trasplante de Médula Ósea

Para comprender el papel de un gen en el desarrollo de la colitis, comparamos las respuestas de ratones silvestres y ratones knockout deficientes en el gen de interés...

El objetivo general del experimento mostrado en este video es evaluar si el péptido antimicrobiano lyin desempeña un papel en la mejora de la colitis inducida por sulfato de dextrano en ratones. Esto se logra inyectando médula ósea de ratones de tipo silvestre en ratones licit y knockout irradiados, y médula ósea de ratones knockout en ratones de tipo silvestre irradiados. La médula ósea trasplantada generará nuevas células sanguíneas en el receptor con el genotipo del donante.A los ratones receptores se les expone a sulfato de dextrano para inducir colitis después de cuatro semanas. El trasplante exitoso se valida mediante citometría de flujo y el daño del tejido colónico se evalúa mediante histología. Se obtienen resultados que muestran que la colitis se mitiga cuando se trasplanta médula ósea de tipo silvestre a ratones knockout.Por el contrario, la colitis empeora cuando se trasplanta médula ósea knockout a ratones de tipo salvaje. Este método puede ayudar a responder preguntas clave para determinar las expresiones génicas de células derivadas de la médula ósea o de células no derivadas de la médula ósea en procesos inflamatorios o infecciosos. Se recomiendan ratones C 57, blac

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Inmunología e Infección

Trasplante de médula ósea murina es una técnica ampliamente utilizada para estudiar los mecanismos inmunológicos que regulan injerto contra huésped enfermedad en los seres humanos. La capacidad para monitorear los patrones de tráfico de células...

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El agotamiento y la reconstitución de los macrófagos en ratones

Determinación de quimerismo de células donantes presenta un reto en modelos de ratón trasplante de médula ósea que carecen bien definidos marcadores fenotípicos. Se presenta una metodología para cuantificar injerto macho donante de células en ratones hembras receptoras de trasplante. Este método se puede utilizar en todas las cepas de ratón para el estudio de funciones HSC.

Usando cuantitativa en tiempo real PCR para determinar quimerismo de células donantes en un modelo competitivo Trasplante de médula ósea murina

Aquí, presentamos un protocolo para inducir inflamación colónica en ratones mediante la transferencia adoptiva de células Taltas CD4 + CD45RB singénicas a receptores deficientes de células T y B. Las características clínicas e histopatológicas imitan las enfermedades inflamatorias intestinales humanas. Este método permite estudiar el inicio de la inflamación colónica y la progresión de la enfermedad.

La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; T células en ratones inmunodeficientes

Microscopía de fluorescencia intravital (IVFM) de la bóveda craneal se aplica en combinación con la genéticos modelos animales para estudiar el autoguiado hacia el blanco y el engraftment de células hematopoyéticas en la médula (BM) nichos.

Combina la microscopia Intravital fluorescente (IVFM) con modelos genéticos para estudiar dinámica del Engraftment de células hematopoyéticas a nichos de la médula ósea

El objetivo de este protocolo es aislar las células mononucleares que residen en la lámina propria del colon mediante la digestión enzimática del tejido utilizando la colagenasa. Este protocolo permite el aislamiento eficiente de las células mononucleares, lo que resulta en una suspensión de una sola célula que, a su vez, se puede utilizar para un inmunofenotipado robusto.

Aislamiento de células mononucleares lamina Propria de Colon Murino usando colagenasa E

La enfermedad de injerto contra huésped es una complicación importante después del trasplante alogénico de médula ósea. Las células dendríticas desempeñan un papel crítico en la patogénesis de la enfermedad del injerto contra el huésped. El artículo actual describe una nueva plataforma de trasplante de médula ósea para investigar el papel de las células dendríticas en el desarrollo de la enfermedad de injerto contra huésped y el efecto injerto-contra-leucemia.

Plataforma de trasplante de médula ósea para investigar el papel de las células dendríticas en la enfermedad de injerto contra huésped

Describimos tres métodos de trasplante de la médula (BMT): BMT con la irradiación de cuerpo entero, BMT con la irradiación blindada, y método de BMT sin el pre-condicionamiento (BMT adoptivo) para el estudio de la hematopoyesis clónica en modelos del ratón.

Procedimientos de trasplante de médula ósea en ratones para estudiar la hematopoyesis clonal

En este protocolo, se describe un modelo de colitis por transferencia adoptiva de células T específicas de antígeno de la microbiota intestinal. Las células T CD4+ se aíslan de ratones transgénicos CBir1 TCR. Estos son específicos para un antígeno inmunodominante de la microbiota intestinal CBir1 flagelina, que se transfiere a los ratones Rag1-/- receptores, lo que lleva a la inflamación intestinal.

Inducción de la inflamación intestinal por transferencia adoptiva de células T CD4+ transgénicas CBir1 TCR a ratones inmunodeficientes

Este artículo detallará el protocolo para la medición de la actividad de la calpaína en células fijadas y la vida mediante citometría de flujo.

Medición de la actividad calpaína en células fijadas y vivir por citometría de flujo

Aprende a diferenciar los roles funcionales de la expresión génica en células inmunes y no inmunes durante la colitis inducida por sulfato de dextrano en ratones mediante trasplante de médula ósea.

Diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por Trasplante de Médula Ósea (Video) | JoVE Journal

Diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por Trasplante de Médula Ósea

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