Name: Un nuevo enfoque quirúrgico para la administración intratraqueal de agentes bioactivos en un modelo de ratón fetal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprende una técnica quirúrgica intratraqueal en ratones fetales para administrar agentes bioactivos directamente a los pulmones. Este método evita la dilución en líquido amniótico y mejora la eficiencia de entrega.

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MC y AVDP son becarios de doctorado apoyados por subvenciones del Instituto para el Fomento de la Innovación mediante la Ciencia y la Tecnología en Flandes (IWT-Vlaanderen). JT tiene una beca a tiempo parcial Investigación Clínica (KOOR) de UZ Leuven. DV es un compañero de doctorado con el apoyo de una subvención de KU Leuven, DBOF/10/062. MMDC es un compañero de doctorado con el apoyo de una subvención del Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) y Erasmus Mundus. La investigación fue financiada por IWT-Vlaanderen, por el DIMI CE subvención (LSHB-CT-2005 a 512,146) y por el In vivo Molecular Imaging Research grupo (Imir) de la KU Leuven. Nos gustaría agradecer el Core Vector UPenn fundada por James M. Wilson por su especie de regalo del embalaje AAV6.2 plásmido para la producción de vectores rAAV.

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<li>Senoo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+in+utero+gene+transfer+in+mice+and+guinea+pigs%3A+tissue+distribution+of+recombinant+adenovirus+determined+by+quantitative+TaqMan-polymerase+chain+reaction+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Genet.+Metab%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated in utero gene transfer in mice and guinea pigs: tissue distribution of recombinant adenovirus determined by quantitative TaqMan-polymerase chain reaction assay.</a> Mol. Genet. Metab. 69, 269-276 (2000).</li>
<li>Carlon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+mouse+lung+by+fetal+intratracheal+injection+of+rAAV2%2F6.2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the mouse lung by fetal intratracheal injection of rAAV2/6.2.</a> Mol. Ther. 18, 2130-2138 (2010).</li>
<li>Schmiedl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+injury+is+more+pronounced+in+fetal+transgenic+ErbB4-deleted+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced injury is more pronounced in fetal transgenic ErbB4-deleted lungs.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol Physiol. 301, L490-L499 (2011).</li>
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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Los pasos críticos <ul><li> La cepa de ratón se optó por trabajar con ratones NMRI es porque tienen un abundante número de crías (tamaño medio de la camada 14,4 ± 1,8, datos propios), tolerar intervenciones bien y tienen buenas características maternas. </li><li> Colocación del cordón de bolsa a través de la pared del útero y las membranas fetales es un paso fundamental, ya que sólo quieren exponer la cabeza del feto y no los hombros, de lo contrario es casi imposible reposición sin causar trauma. </li><li> Una posició...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> NMRI ratones </td><td> Janvier, Le St Genest Isle, Francia </td><td></td><td></td></tr><tr><td> El isoflurano </td><td> Isoba, Intervet / Schering-Plough Animal Health, Milton Keynes, Reino Unido </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Prolene 6-0 </td><td> Ethicon, Groot Bijgaarden, Bélgica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vicryl 5-0 </td><td> Ethicon, Groot Bijgaarden, Bélgica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 l Hamilton jeringa de vidrio, Modelo 1710.5 TLLX SYR </td><td> Hamilton, Reno, NV, EE.UU. </td><td> 5495-20 </td><td></td></tr><tr><td> 30G aguja afilada </td><td> Hamilton, Reno, NV, EE.UU. </td><td> 7762-03 </td><td></td></tr><tr><td> Xilocaína al 2% </td><td> AstraZeneca, Zoetermeer, Países Bajos </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un nuevo enfoque quirúrgico para la administración intratraqueal de agentes bioactivos en un modelo de ratón fetal

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Entrega Prenatal pulmonar de células, genes o agentes farmacológicos podrían ser la base de nuevas estrategias terapéuticas para una variedad de enfermedades genéticas y adquiridas. Aparte de las anomalías congénitas o heredadas con el requisito de que a largo plazo la expresión del gen entregado, varias organizaciones no heredadas afecciones perinatales, donde a corto plazo la expresión génica o la intervención farmacológica es suficiente para lograr efectos terapéuticos, son considerados como posibles indicaciones futuras de este tipo de enfoque. Enfermedades candidatas para la aplicación de la terapia a corto plazo prenatal podría ser la deficiencia neonatal transitoria de la proteína surfactante B causando neonatal 1,2 síndrome de dificultad respiratoria o lesiones hyperoxic del pulmón neonatal 3. Enfermedades candidatos para la corrección terapéutica permanente son la fibrosis quística (FQ) 4, 5 variantes genéticas de deficiencia de surfactante y α1-antitripsina 6. &lt;clase p = &quot;jove_content&quot;&gt; En general, una ventaja importante de la terapia génica prenatal es la capacidad de iniciar una intervención terapéutica temprana en el desarrollo, en o incluso antes de que las manifestaciones clínicas en el paciente, evitando así daños irreparables a la persona. Además, los órganos fetales tienen una mayor tasa de proliferación celular en comparación con órganos de adultos, que podrían permitir un gen más eficiente o transferencia de células madre en el feto. Además, en la entrega de genes útero se realiza cuando el sistema inmune del individuo no es completamente maduro. Por lo tanto, el trasplante de células heterólogas o la suplementación de una proteína no funcional o ausente con una versión correcta no debería causar sensibilización inmune a la célula, el vector o producto transgénico, que ha sido recientemente demostrado ser el caso con las terapias celulares y genéticos 7 . En el presente estudio, se investigó el potencial para tratar directamente la tráquea fetal en un ratón modelo. Este procedimiento está en uso en modelos animales más grandes tales como conejos y ovejas 8, e incluso en un entorno clínico 9, pero hasta la fecha no se ha realizado antes en un modelo de ratón. Cuando se estudia el potencial de la terapia génica fetal de enfermedades genéticas tales como la fibrosis quística, el modelo de ratón es muy útil como una primera prueba de concepto a causa de la amplia disponibilidad de diferentes cepas de ratones transgénicos, la embriogénesis bien documentado y el desarrollo fetal, menos estrictos normas éticas, gestación corta y el tamaño de la camada de gran tamaño. Diversas vías de acceso se han descrito para dirigir el pulmón fetal de roedores, incluyendo la inyección intra-amniótico 10-12, (guiada por ultrasonido) intrapulmonar 13,14 inyección y la administración intravenosa en los vasos del saco vitelino 15,16 o vena umbilical 17. Nuestro procedimiento quirúrgico novedoso permite a los investigadores para inyectar el agente de elección directamente en la tráquea fetal de ratón que permitepara una entrega más eficaz de las vías respiratorias que las técnicas existentes 18.

Hemos desarrollado un enfoque quirúrgico novedoso para la administración intratraqueal de agentes bioactivos en el feto de ratón. La ruta de entrega es más eficiente en la orientación de los pulmones fetales de ratón que el comúnmente utilizado intraamniótica inyección. Este procedimiento hasta la fecha no se ha descrito en un modelo de ratón.

Un nuevo enfoque quirúrgico para la administración intratraqueal de agentes bioactivos en un modelo de ratón fetal

La administración pulmonar prenatal de células, genes o agentes farmacológicos podría sentar las bases de nuevas estrategias terapéuticas para una variedad de enfermedades genéticas y...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en poder inyectar un agente de elección directamente en la tráquea fetal del ratón, lo que permite una administración más eficiente a las vías respiratorias que las técnicas existentes. Esto se logra exteriorizando la cabeza fetal mediante una histerotomía y accediendo a la tráquea fetal. A continuación, se realiza una incisión cervical vertical para visualizar la tráquea y se inserta una aguja bajo guía visual. Luego, se inyectan microesferas fluorescentes o un vector viral en la tráquea para entregar eficazmente la sustancia elegida a las vías respiratorias fetales. El análisis microscópico de secciones de tejido de pulmones tratados muestra que la inyección intratraqueal produce una entrega más eficiente de moléculas fluorescentes o vectores virales a las vías respiratorias fetales en comparación con la vía de administración intraamniótica más comúnmente utilizada. La principal ventaja de esta técnica en comparación con métodos existentes como la inyección fetal intraamniótica es que se evita la dilución de la sustancia inyectada en el líquido amniótico.Esto maximiza el efecto de la cantidad de partículas presentes en el pulmón fetal de ratón. En general, las personas nuevas en esta tecnología encontrarán extremadamente difícil realizar una inyección endotraqueal perfecta. Esto se debe a que la tráquea fetal es extremadamente frágil y, como tal, puede perforarse muy fácilmente.Cuando haga esto, realizará una inyección por vía traqueal y, por lo tanto, no logrará dirigirse al pulmón fetal. Pero, como siempre, la práctica hace al maestro. Para prepararse para la inyección intratraqueal o inyección it, use ratones hembra preñados y sometidos a resonancia magnética. Deben tener 18 días de gestación en el momento de la cirugía, tanto antes como después de esta.Se mantienen en jaulas con tapa filtrante a temperatura ambiente normal y luz diurna normal, con acceso libre a agua y alimento. Después de anestesiar el ratón con isoflurano, colóquelo sobre una almohadilla calefactora a 37 grados Celsius para mantener la temperatura corporal y verifique el nivel de anestesia realizando una compresión del dedo del pie. Desinfecte el abdomen con yodo de povidona y realice una laparotomía media para exponer el útero gestante, exteriorice los dos cuernos uterinos y cuente el número de sacos gestacionales.Se opera un feto por cuerno según la posición óptima para la exteriorización de la cabeza fetal. Para fijar el feto dentro del útero desde los hombros, se pasan seis puntos de sutura de prolina 6-0 por hilo, de aproximadamente un centímetro de diámetro, a través de la pared uterina y las membranas fetales sobre la zona donde se expondrá la cabeza fetal. A continuación, se realiza una incisión en la pared uterina dentro del punto de sutura en bolsa de aproximadamente 0,8 centímetros utilizando tijeras pequeñas con punta afilada.A continuación, exprima suavemente la cabeza y el cuello del feto a través de la histerotomía. Luego, tire suavemente del cordón, sutúre firmemente alrededor del cuello y utilice dos pinzas micro mosquito. Para fijarlo en su posición, use cinco o poliactina.Coloque nueve puntos de sutura 10 en dos pinzas introducidas en la boca alrededor de la mandíbula superior para mantener la cabeza fetal en hiperextensión bajo un microscopio estereoscópico. Visualice la tráquea mediante disección fina y roma, realice una incisión vertical en el cuello y continúe disecando el tejido subyacente hasta alcanzar la tráquea. Utilizando una jeringa de vidrio Hamilton de 50 microlitros con una aguja fina de calibre 30, inyecte un volumen total de 30 microlitros de la sustancia.El ingreso mínimo del líquido inyectado al retirar la aguja asegura que la inyección se realizó correctamente. Para reposicionar la cabeza en el útero, aplique una presión suave sobre la nariz. Primero el cuello vuelve al útero, seguido luego por la cabeza.Y finalmente, la nariz. Introduzca una aguja que contiene solución salina en la incisión dentro del punto de sutura en bolsa de tabaco. Cierre la histerotomía apretando el punto de sutura en bolsa de tabaco e inyecte un volumen total de aproximadamente 500 microlitros de solución salina en la cavidad amniótica para prevenir la oligohidramnios.Después de reinsertar el útero en el abdomen, utilice una sutura continua de Vicryl 5-0 en dos capas separadas. Para cerrar la pared abdominal materna, infiltre la incisión con Xilocaína al 0,2 % para aliviar el dolor postoperatorio. Mantenga al ratón sobre una almohadilla calefactora hasta que se recupere completamente para realizar una inyección intraamniótica o IA fetal.Después de anestesiar al ratón preñado, use yodo-povidona para desinfectar el abdomen y realice una laparotomía media para exponer el útero gestante, exteriorice los dos cuernos uterinos y cuente el número de sacos gestacionales. Utilizando una jeringa de vidrio Hamilton de 50 microlitros con una aguja fina de calibre 30, inserte la aguja en el saco, cerca de la boca del feto sin tocarlo, y site 30 microlitros de solución en el líquido amniótico.Después de haber inyectado todos los fetos, reposicionar el útero en el abdomen y utilizar sutura de Vicryl 5-0 en la pared abdominal y la piel. Después de la eutanasia de la hembra, 36 horas tras la intervención fetal, extraer los fetos mediante cesárea y evaluar su viabilidad comprobando la presencia de latido cardíaco, color de piel rosado y movimientos espontáneos. Colocar las crías cerca de una fuente de oxígeno para estimular la respiración y la captación de oxígeno.Luego marque las crías en la base de la cola. Mediante el uso de tinta china, se puede evaluar una inyección exitosa mediante la eutanasia de un feto operado y la disección de los pulmones para evaluar macroscópicamente la presencia del colorante visible en los pulmones en comparación con los pulmones de control no inyectados. A continuación, cubra al resto de las crías que cumplan con los criterios de viabilidad.Coloque material de cama que contenga heces y orina de una madre de cría con crías de un día de nacidas, y coloque las crías junto con la camada de la madre de cría. No deje más de 10 crías en total en la camada de la madre de cría. Luego, coloque la jaula en un ambiente tranquilo y sin disturbios durante 12 horas y evalúe la tasa de supervivencia del alojamiento para determinar el volumen óptimo para este procedimiento.Se eligieron empíricamente volúmenes de inyección de 10, 20 y 30 microlitros de moléculas rojas fluorescentes de 100 nanómetros. Aquí se muestran imágenes confocales de secciones fijadas de pulmón con tinción de núcleos. Aunque al momento de la cirugía fetal se detectó un reflujo solo tras la inyección de 30 microlitros, indicando un exceso de líquido inyectado, los 30 microlitros produjeron la mayor cantidad de señal fluorescente en el parénquima pulmonar, según se cuantificó midiendo la fluorescencia relativa como se muestra aquí; esta inyección resultó en una entrega significativamente mayor de esferas fluoradas al pulmón fetal en comparación con la raíz IA.El tracto gastrointestinal también fue positivo tanto en los animales inyectados por vía IT como en los inyectados por vía IA. No se observó fluorescencia roja en otros tejidos de los fetos tratados ni en los animales de control negativo. Para evaluar la eficacia de la transducción viral tras la inyección, se realizaron inyecciones IT e IA con vectores RAAV que codifican la luciferasa de luciérnaga bajo el control del promotor del beta-actina de pollo a la edad de una semana. El flujo total de fotones para el grupo IT fue significativamente mayor que para los cachorros IA y el control negativo.Para distinguir entre una inyección IT correcta e incorrecta, se realizó una combinación de imágenes por resonancia magnética o MRI e imágenes por bioluminiscencia o BLI para obtener una imagen superpuesta que combine la señal de BLI de la superficie con una visualización de las estructuras anatómicas más profundas provenientes de la imagen por RM, como se muestra aquí. A la edad de una semana, el análisis de BL reveló una señal procedente de la región cervical y torácica.La co-registro de RM con BLI localizó la expresión del gen luciferasa en la región pulmonar tras una inyección correcta, pero en la zona del cuello y abdominal tras una inyección incorrecta. El análisis histológico mediante tinción ex gal confirmó la co-registro in vivo. Una vez dominado todo el procedimiento de inyección intra, este puede realizarse en media hora, desde la incisión hasta el cierre en el animal madre.Un tiempo de operación corto dará como resultado una mejor supervivencia fetal y un mayor número de animales que pueden estudiarse después del nacimiento.

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Investigación

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Este video describe un enfoque intrabronquial para administrar un agente experimental de forma selectiva en el pulmón distal derecho e izquierdo. En el protocolo presentado, administraremos bleomicina por vía intrabronquial en un ratón para obtener un mejor modelo de fibrosis pulmonar.

Administración intrabronquial: técnica para administrar un agente experimental de forma selectiva en un pulmón de ratón

Fuente: Venuprasad, K., et al. Administración intratraqueal de Haemophilus influenzae en modelos de ratón para estudiar la inflamación de las vías respiratorias. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra la administración intratraqueal de un inóculo bacteriano patógeno pulmonar en un ratón anestesiado para modelar la infección del tracto respiratorio inferior.

Realización de la administración bacteriana intratraqueal en un modelo de ratón

Este video muestra el procedimiento de oclusión traqueal transuterina de un feto de ratón en una rata embarazada. Este modelo se puede utilizar para estudiar el impacto de la tráquea ocluida en el desarrollo pulmonar.

Modelado de la oclusión traqueal fetal transuterina en modelo murino: un procedimiento quirúrgico para la ligadura de la tráquea fetal en una ratón embarazada

Hemos desarrollado un método simple, fiable, y relativamente barato para la intubación endotraqueal en ratones a través de la laringoscopia directa utilizando un otoscopio con un espéculo 2,0 mm. Esta técnica es atraumática y se puede utilizar para mediciones repetidas en experimentos crónicos. Nos resulta superior a la traqueotomía o previamente informó técnicas no quirúrgicas.

Intubación endotraqueal en ratones<em&gt; Vía</em&gt; La laringoscopia directa utilizando un otoscopio

El uso de un modelo que imita el estado de las enfermedades pulmonares en los seres humanos es crítico para el estudio de la fisiopatología y / o la etiología de una enfermedad en particular y para el desarrollo de la intervención terapéutica. Aquí un método intubación endotraqueal no invasivo que puede entregar directamente materiales exógenos a los pulmones del ratón se presenta.

No Invasiva Intratraqueal Intubación para Estudiar la Patología y Fisiología de pulmón de ratón

En este artículo se presenta un método rápido y sencillo para la administración de bleomicina directamente en la tráquea ratón a través de la intubación. Las principales ventajas de este método son que es altamente reproducible, fácil de dominar, y no requiere equipo especializado ni largos tiempos de recuperación.

Un método mejorado para la rápida intubación de la tráquea en ratones

La administración intratraal (IT) de agentes experimentales en ratones a menudo resulta en un parto asimétrico a los pulmones distales.  En este informe, describimos un enfoque intrabronquial directo (IB) para canalizar cada pulmón en ratones vivos de forma no operativa.  Este enfoque se puede utilizar para administrar selectivamente agentes a un pulmón o puede adaptarse para mejorar el suministro de agentes simétricos a ambos pulmones.

Administración intrabronquial directa para mejorar la deposición selectiva del agente dentro del pulmón del ratón

Esta técnica de inculcar medicamentos directamente en la tráquea de roedores neonatales es importante para estudiar el impacto de los medicamentos o biológicos administrados localmente en las enfermedades pulmonares neonatales. Además, este método también se puede utilizar para inducir lesiones pulmonares en modelos animales.

Un método mínimamente invasivo para la instilación intratraqueal de medicamentos en roedores neonatales para tratar la enfermedad pulmonar

Varios modelos animales de hernia diafragmática congénita y oclusión traqueal fetal presentan ventajas y desventajas con respecto a cuestiones éticas, costo, dificultad quirúrgica, tamaño, tasas de supervivencia y disponibilidad de herramientas genéticas. Este modelo proporciona una nueva herramienta para estudiar el impacto de la oclusión traqueal y el aumento de la presión luminal en el desarrollo pulmonar.

Modelo de oclusión traqueal fetal transuterina en ratones

Aquí, proponemos un protocolo para la administración de lipopolisacáridos intratraqueales (LPS) a través de la intubación endotraqueal orofaríngea no invasiva. Este método minimiza el trauma del procedimiento quirúrgico para el animal y administra LPS con precisión a la tráquea y luego a los pulmones.

Instilación intratraqueal no invasiva de lipopolisacáridos en ratones

Este protocolo presenta cómo la posición óptima de un ratón y la inserción de un otoscopio basado en una cámara por vía transoral permite la visualización de la glotis, una intubación rápida con un traumatismo tisular mínimo y un suministro constante de líquido a los pulmones.

Metodología mejorada para la administración de líquido al pulmón de ratón: intubación mediante un otoscopio de consumo

Aprende una técnica quirúrgica intratraqueal en ratones fetales para administrar agentes bioactivos directamente a los pulmones. Este método evita la dilución en líquido amniótico y mejora la eficiencia de entrega.

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