La reparación de un modelo de defecto crítico del tamaño de calota Uso adiposo derivados de las células del estroma cosechadas desde lipoaspirado

El objetivo general de este procedimiento es obtener células estromales multipotentes del tejido adiposo con el fin de inducir su diferenciación osteogénica, utilizando un modelo in vivo de defecto calvarial en un ratón. Esto se logra primero aislado las células progenitoras de la capa vascular estromal del tejido adiposo, que puede obtenerse tras un procedimiento de liposucción. El siguiente paso consiste en preparar un andamio tridimensional y luego sembrar las células sobre ese soporte.

El paso final consiste en la creación de un defecto calvarial de tamaño crítico en un modelo murino en el que se colocan el andamiaje y las células. En última instancia, los resultados muestran que las células estromales multipotentes aisladas del tejido adiposo tienen potencial para la regeneración esquelética in vivo. Las aplicaciones de esta técnica abarcan un amplio espectro de posibles aplicaciones clínicas debido a la escasez de tejido disponible para la regeneración esquelética.

Aunque los injertos óseos autólogos son el estándar de oro, la falta de sitios donantes y la morbilidad del sitio donante limitan esta opción. Los aloinjertos y materiales extranjeros pueden utilizarse, pero están limitados por el costo, la mala integración y el riesgo de infección.

El posible uso del tejido adiposo o graso para el aislamiento de células progenitoras en la ingeniería de tejidos esqueléticos es emocionante. El procedimiento lo demostraré yo mismo junto con Michael Chung del laboratorio Long Anchor. En primer lugar, obtenga tejido adiposo subcutáneo humano a partir de procedimientos electivos de liposucción por aspiración.

Y observe las dos capas en el aspirado lipídico. El sobrenadante contiene la gran mayoría del material celular del proceso. La capa inferior consiste principalmente en suero salino inyectado.

Las células estromales derivadas del tejido adiposo pueden obtenerse de cualquiera de las capas, pero el rendimiento es mucho mayor a partir del sobrenadante. Para aislar la fracción vascular estromal o lavado de SVF, lave extensamente el aspirado lipídico con volúmenes iguales de solución salina tamponada con fosfato al 1x o PBS que contenga 2,5 % de Betadine; aspire un volumen igual de PBS 1x sin Betadine. Deje que el lavado sedimente.

Asegúrese de mantener una técnica estéril durante todo el proceso para evitar la contaminación con tejido humano procesado. A continuación, aspire la capa inferior y deseche después de cada lavado, luego transfiera 15 mililitros de tejido adiposo a tubos cónicos Falcon de 50 mililitros. A continuación, digiera el tejido adiposo en 15 mililitros filtrados de 0,075 % filtrado.

Incube la colagenasa tipo II en solución salina balanceada de Hank o HBSS a 37 grados Celsius en un baño de agua durante 60 minutos bajo agitación constante; asegúrese de ventilar los tubos cada 15 minutos. Luego, neutralice la actividad enzimática con 15 mililitros de PBS que contenga 10% de suero bovino fetal o FBS y centrifugue. Para obtener un pellet denso de SVF, el pellet será una mezcla de células madre derivadas del tejido adiposo y eritrocitos.

Deseche primero la capa de grasa del sobrenadante y luego deseche la capa líquida del sobrenadante sin perturbar el precipitado. Reuspenda el precipitado en 10 mililitros de medio de crecimiento tradicional. A continuación, combine tres tubos en un tubo cónico limpio de 50 mililitros a través de un filtro de 100 micrones y centrifugue.

Deseche el sobrenadante sin perturbar el precipitado y luego resuspenda el precipitado. En cinco mililitros de medio de crecimiento tradicional, combine dos tubos cónicos de 50 mililitros por cada placa de 10 centímetros, o cinco tubos cónicos de cinco mililitros por cada placa de 15 centímetros. Establezca cultivos primarios durante la noche a 37 grados Celsius con 21% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono.

Después de incubar durante la noche, lave las placas con PBS para eliminar los glóbulos rojos residuales no adheridos. Las poblaciones celulares resultantes son células estromales derivadas del tejido adiposo. Mantenga las células a niveles subconfluentes para prevenir la diferenciación espontánea.

A 37 grados Celsius, 21 % de oxígeno y 5 % de dióxido de carbono. En medio de crecimiento, las células generalmente deben dividirse cada tres o cuatro días en medio de crecimiento habitual. Cuando se siembran al 50 % de confluencia, prepare el andamio como se explica en el manuscrito adjunto.

Cuando las células alcancen niveles de subconfluencia, lave las células dos veces con PBS y tripsine los cultivos. Cuente las células para cuantificarlas. Para la siembra, prepare para sembrar las células sobre andamios precortados de cuatro milímetros de diámetro con 1,5 veces 10 a la quinta células.

Coloque un andamio individual en un pocillo de una placa de 96 pocillos y luego suspenda las células en medio de crecimiento regular con una concentración de aproximadamente 1,5 × 10⁵ células por 20 microlitros de medio. Siembre el andamio pipeteando 20 microlitros de la solución directamente sobre el andamio y coloque esto en el incubador de cultivo celular durante 30 minutos.

Después de 30 minutos, agregue 200 microlitros de medio y permita que las células se incuben sobre el andamio durante la noche. Antes de la cirugía, no es necesario asegurar la adhesión de las células al andamio como si fuera siembra. Un número suficiente de células garantizará que la mayoría se adhiera al andamio.

Después de anestesiar un ratón CD1 hembra adulto de 60 días de edad, esterilice el sitio quirúrgico con Betadine y alcohol tres veces y coloque lubricante sobre los ojos de los ratones. A continuación, realice una incisión sagital media en el cuero cabelludo del ratón para exponer el hueso parietal derecho. Retire el pericráneo del hueso parietal derecho mediante raspado romo.

A continuación, cree un defecto unilateral de cuatro milímetros de espesor total en el hueso parietal derecho no asociado a sutura. Utilizando una broca de fresa recubierta de diamante, tenga extremo cuidado de no perturbar la duramadre subyacente, ya que el grosor del cráneo del ratón es inferior a 0,3 milímetros antes del implante. Enjuague los andamios con PBS estéril para evitar la transferencia de factores de crecimiento derivados del medio.

Coloque el andamio en el defecto. Finalmente, sutúre la piel y supervise al animal según los protocolos postoperatorios establecidos. Realice una tomografía computarizada micro para obtener una imagen tridimensional reconstruida utilizando el software microview.

Utilice Adobe Photoshop para ajustar las imágenes a una altura estándar. Normalmente, medimos la regeneración craneal cada dos semanas. Los ratones están anestesiados durante la exploración para el seguimiento a largo plazo y, finalmente, son sacrificados.

Para el análisis histológico, utilice la función de varita mágica para medir los píxeles del defecto craneal. Determine el porcentaje de curación del defecto mediante escáneres de TC posteriores. Mida el área del defecto craneal, determine el número de píxeles y divídalo por el número de píxeles del defecto original; tiña múltiples secciones a lo largo del defecto utilizando coloraciones histológicas como azul de anilina y rojo de ponceau para indicar la formación ósea.

Utilice Adobe Photoshop para recortar todas las áreas que no estén en el defecto calvario y use la herramienta de selección mágica para determinar el número de píxeles correspondientes a la formación ósea de novo en el área del defecto, y compare esto con los controles u otras variables. Se muestra aquí una visión general de la obtención y aplicación del aspirado de grasa, desde el aislamiento de células estromales derivadas del tejido adiposo hasta su expansión, diferenciación y uso in vitro e in vivo. Aquí se presenta una microtomografía computarizada que muestra la cicatrización in vivo del defecto calvario de tamaño crítico mediante la aplicación de células estromales derivadas del tejido adiposo (ASC) a través de un andamio de hidroxiapatita, observado en la fila inferior.

Los controles, que se observan en la fila superior, incluyen ausencia de andamio y defecto. La fila media muestra el defecto con la colocación del andamio sin células. LS, mostrado aquí, es la cuantificación de la cicatrización ósea a partir de la micro-TC, que muestra una cicatrización significativamente mayor en el grupo A SC.

Esta es una imagen histológica que muestra un aumento en la formación ósea del grupo A SC mediante andal. En azul y con tinción AROM de pen para al. En azul, el osteoide se tiñe de azul oscuro con pen arom.

Las tinciones amarillas de osteoide mostradas aquí corresponden a ASC humanas marcadas con GFP, que fueron sembradas sobre un andamio y sacrificadas a las dos semanas. La tinción se realizó con un anticuerpo marcado con GFP para mostrar la contribución de las células humanas a la regeneración en el área del defecto. Se muestra aquí inmunohistoquímica para antígeno nuclear humano, que evidencia la presencia de células humanas en el área del defecto a las dos semanas.

Una vez dominado, el procesamiento del tejido adiposo puede realizarse en menos de cuatro horas, y el procedimiento quirúrgico puede tomar unos 10 minutos por ratón. Es importante recordar que el hueso parietal es redondeado mientras que la fresa es plana, por lo que se debe tener cuidado para atravesar toda la circunferencia del defecto de cuatro milímetros. Recuerde proceder lentamente para evitar lesionar la duramadre del cerebro.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar las capas progenitoras del tejido adiposo. Siembre estas células en un andamio y colóquelas en el ratón.