Name: La reparación de un modelo de defecto crítico del tamaño de calota Uso adiposo derivados de las células del estroma cosechadas desde lipoaspirado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T10:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprenda a aislar células estromales derivadas del tejido adiposo y evaluar su potencial osteogénico en un modelo de defecto craneal crítico en ratón. Este método ofrece una alternativa prometedora para la regeneración ósea.

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Nos gustaría dar las gracias al Dr. Commons George y el Dr. Dean Vistnes por su apoyo y colaboración de nuestra investigación. Este trabajo es apoyado por el Instituto Nacional de las subvenciones Investigación Dental y Craneofacial 1 DE019274 R21-01, R01EB009689 y DE020771 RC2-02, la Fundación Oak y Laboratorio de Medicina Pediátrica Hagey Regenerativa con MTL Dr. Hyun es apoyado por el Saint Joseph Mercy Hospital GME .

1. Celda de aislamiento y Expansión <ol><li> Todo el consentimiento del paciente y de los protocolos experimentales fueron revisados ​​y aprobados por la Universidad de Stanford Institutional Review Board (Protocolo # 2188 y # 9999). </li><li> Obtención de tejido adiposo subcutáneo humano de los procedimientos electivos bajo lipoaspiración local / anestesia general. </li><li> Habrá dos capas en el lipoaspirado (Figura 1A). El sobrenadante contiene la gran mayoría del material celular procesada. La capa inferior se inyecta solución salina en su mayoría. Adiposo derivado de células estromales se pueden cosechar a partir de cualquiera de las capas, pero el rendimiento es mucho mayor a partir del sobrenadante. </li><li> Para aislar la fracción del estroma vascular (SVF), lavar el lipoaspirado extensamente con volúmenes iguales de 1X tampón fosfato salino (PBS) que contenía 2,5% betadine (x2), seguido por un volumen igual de PBS 1X (x1) sin betadine. Permitir que el lavado a precipitar. </li><li> Tenga cuidado de mantener estéril technique durante todo el proceso ya que la contaminación con el tejido humano procesada puede suceder. </li><li> Aspirar la capa inferior y desechar después de cada lavado. </li><li> Alícuota de 15 ml de tejido adiposo en 50 ml tubos cónicos BD Falcon. </li><li> Se digiere el tejido adiposo con un volumen igual (15 ml) de filtrado 0,075% de colagenasa tipo II en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a 37 ° C en un baño de agua durante 60 min con agitación constante (aprox. 180 sacudidas / min) - ventilar cada tubo cada 15 min. </li><li> Neutralizar la actividad de la enzima con 15 ml de PBS que contenía 10% (suero bovino fetal) FBS, y se centrifuga a 1.000 rpm durante 5 min a 4 ° C para obtener una alta densidad SVF pellet. El sedimento será una mezcla de adiposas derivadas de las células del estroma y eritrocitos. </li><li> Descartar el sobrenadante sin perturbar el sedimento. </li><li> Resuspender el precipitado en 10 ml de medio de crecimiento tradicionales (Eagle modificado de Dulbecco Medium [DMEM] / 10% FBS / 1% de penicilina-estreptomicina solución). </li><li> Filtro de suspensión<html> sión a través de un filtro de células de nylon 100 micras para eliminar los restos celulares. </li><li> Combina 3 tubos a uno limpio cónico de 50 ml. Centrifugar a 1.000 rpm durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Descartar el sobrenadante sin perturbar el sedimento. </li><li> Resuspender el sedimento en 5 ml de medio de crecimiento tradicionales </li><li> Combina dos cónicas 50 ml por placa de 10 cm o cinco cónicas 50 ml para una placa de 15 cm. </li><li> Establecer cultivos primarios durante la noche a 37 ° C/21% de O 2, 5% de CO 2. </li><li> Después de la incubación durante la noche, se lavan las placas exhaustivamente con PBS para retirar los residuos de las células no adherentes de sangre rojas. Las poblaciones celulares resultantes son adiposas derivadas de las células del estroma. </li><li> Mantener las células a niveles sub-confluentes para prevenir la diferenciación espontánea a 37 ° C/21% de O 2, 5% de CO 2 en un medio de crecimiento. Las células generalmente se deben dividir cada tres a cuatro días en medios de crecimiento regulares cuando se siembran al 50% de confluencia. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. Preparación Andamio <ol><li> Los andamios fueron realizadas por el Dr. Min Lee en la Universidad de California, Los Angeles - Escuela de Odontología. </li><li> Andamios de PLGA fueron fabricados de 85/15 poli (láctico-co-glicólico) (viscosidad inherente = 0,61 dl / g, Birmingham Polymers) por moldeo con disolvente y un proceso de lavado de partículas. </li><li> PLGA / cloroformo soluciones se mezclaron con sacarosa 200-300 m de diámetro para obtener 92% de porosidad (fracción de volumen), y se comprimen para formar láminas delgadas en un molde de teflón. </li><li> Después de la liofilización durante la noche, andamios se sumergieron en tres cambios de doble destilada (dd) H 2 O para disolver la sacarosa, y suavemente retiró de la placa de teflón con una espátula de punta fina. </li><li> Después de lavado de partículas, todos los andamios se desinfectaron por inmersión en 50%, 60% y 70% de etanol durante 30 min cada uno, seguido de tres lavados de ddH 2 O. </li><li> Todos los andamios se secaron bajo una campana de flujo laminar. </li><li> Después de Fabricación de la estructura, scaffolds fueron recubiertos con apatita. <ol class="ualpha"><li> SBF (fluido corporal simulado) Se preparó una solución con concentraciones de iones que eran 5 veces la del plasma sanguíneo humano. Todas las soluciones son estériles filtró a través de una membrana de 0,22 micras PES (Nalgene). Inmediatamente antes de que el proceso de recubrimiento, se secó andamios de PLGA se someten a descarga de resplandor, argón-plasma de grabado (Harrick Scientific) para mejorar la humectación y la uniformidad del recubrimiento. </li><li> Etched andamios de PLGA se incubaron entonces en SBF a 37 ° C dentro de una incubadora con camisa de agua durante 12 horas, seguido de Mg 2 + y HCO 3 - SBF libre 2 por otro hr 12 a 37 ° C bajo agitación suave. </li><li> Andamios recubiertos de PLGA se enjuaga suavemente con estéril ddH 2 O para lavar el exceso de solución de cloruro de sodio, se secó en una campana de flujo laminar y desinfectado con 70% de etanol. </li><li> Integridad del recubrimiento de apatita se analizó con un microscopio electrónico de barrido (SEM). Recubiertos con apatita scaffolds fueron montados en los talones de SEM (Ted Pella) y recubiertos con carbono para mejorar la conductividad. El modo de electrones secundario se aplicó durante SEM (FEI / Phillips XL-30) observación. Dispersión de energía de rayos X del espectro se obtuvo a confirmar la composición elemental de las estructuras de apatito. </li></ol></li></ol> 3. Siembra Celular <ol><li> Al llegar a los niveles de sub-confluencia, se lavan las células con PBS (x2) y Tripsinizar. </li><li> Contar las células para cuantificar para la siembra </li><li> Semilla en precortadas andamios de diámetro 4,0 mm con 1,5 x 10 5 células. <ol class="ualpha"><li> Lugar individual andamio en un pocillo de una placa de 96 pocillos </li><li> Volver a suspender las células en medio de cultivo regulares con una concentración de aproximadamente 1,5 x 10 5 células por 20 l de medios de comunicación </li><li> Pipetear 20 l directamente sobre el andamio y el lugar en el cultivo celular incubadora durante 30 min. </li><li> Después de 30 min, añadir 200 l de medios de comunicación y permitir que las células se incubanen el andamio durante la noche antes de la cirugía </li><li> No es necesario para asegurar la adhesión de las células en el andamiaje como la siembra de un número suficiente de células se asegurará de que la mayoría se adhieren al andamio. Esto se ha validado en nuestro laboratorio con bioluminiscencia in vivo y análisis histológico. </li></ol></li></ol> 4. Creación de defectos de calota y la implantación in vivo <ol><li> Anesthetize adultos (60 días de edad) CD-1 de ratones desnudos con cóctel anestésico. (Ketamina / xilazina / acepromazina) a 50% de concentración (1:1 dilución con 0,9% de NaCl) o por régimen recomendado anestésico por protocolos de la institución. Estos ratones son atímicos para los hASCs no provocará una reacción inmune. <ol class="lalpha"><li> Dosificación: El clorhidrato de ketamina (80 mg / kg), xilazina (2,5 mg / kg) acepromazina (2,5 mg / kg) </li><li> Duración de acción: aproximadamente 30 min </li></ol></li><li> Quirúrgicamente cubrir el animal y esterilizar el quirúrgicositio con Betadine y alcohol (x3) y cubrir los ojos de ratón con pomada antes de hacer una incisión sagital en la línea media del cuero cabelludo del animal para exponer el hueso parietal derecho. Retire el pericráneo del hueso parietal derecho con raspado romo (fig. 1B). </li><li> Crear una unilateral de 4 mm de espesor completo defecto en el derecho no sutura del hueso parietal asociada mediante una estéril con recubrimiento de diamante broca trépano. Debe tener mucho cuidado de no alterar la duramadre subyacente (Figura 1B) como el espesor del ratón calota es &lt;0,3 mm. </li><li> Antes de la implantación, andamios enjuague con PBS estéril para evitar la transferencia de factores de crecimiento derivados de medio. </li><li> Coloque el andamio en el defecto. </li><li> Por último, suturar la piel se cerró y vigilar el animal por los protocolos establecidos postoperatorias. </li><li> Utilice analgesia establecido según las indicaciones de los protocolos de cuidado de los animales, según sea necesario después de la operación-por ejemplo. buprenorfina 0,1 mg / kg. </li></ol> 5. La cuantificación de la formación de osteoide <ol><li> Después de MicroCT se realizó en el ratón, la imagen tridimensional fue reconstruido utilizando software MicroView como se ha descrito anteriormente 1. </li><li> Uso de Adobe Photoshop, las imágenes eran de tamaño a una altura normal. </li><li> Con la función Magic Wand, los píxeles se mide el defecto craneal. </li><li> Porcentaje de curación del defecto se determinó mediante posteriores TC medir el área del defecto craneal y determinar el número de píxeles y dividiéndolo por el número de píxeles del defecto original </li><li> Por consiguiente, si el MicroCT no está disponible, una alternativa es usar Adobe Photoshop y cosecha de la bóveda craneal en puntos de tiempo determinados para histología. </li><li> Utilizando tinciones histológicas tales como azul de anilina y Pentacromo que denotan la formación de osteoide, múltiples secciones a lo largo de la duración del defecto debería ser manchado </li><li> Uso de Adobe Photoshop, afloran todas las áreas que no sonen el defecto craneal </li><li> Utilice la función varita mágica y determinar el número de píxeles de la formación de hueso de novo en la zona del defecto y comparar con los controles u otras variables. </li></ol> 6. Los resultados representativos El tejido adiposo tiene el potencial de servir un papel vital en la generación de células progenitoras para su aplicación clínica. El tejido adiposo tiene una ventaja única en que existe un suministro fácilmente disponible que puede ser recolectada en un procedimiento relativamente simple que implica un mínimo de morbilidad y mortalidad. Una vez que el tejido se recogieron y se recogió, nuestro protocolo se describe en la Figura 2. Adiposas derivadas de las células estromales se aíslan mediante una serie de pasos de lavado, digestión con colagenasa, y la centrifugación. Una vez que las células se sembraron en placas de cultivo, que se puede ampliar, se colocaron en diferentes protocolos de diferenciación in vitro, o se coloca directamente in vivo. El creación de la 4 mm de tamaño crítico defecto craneal proporciona un fácil acceso y reproducible en modelo in vivo para probar la capacidad de diferenciación osteogénica de nuestros derivadas de tejido adiposo células estromales. Mediante el uso de MicroCT, que son capaces de seguir la formación de tejido esquelético in vivo y el seguimiento del progreso de nuestras intervenciones (Figura 3). El defecto fundamental del calvario de tamaño no se cura dentro de la vida del animal y vemos aproximadamente el 90% de los defectos siguen siendo patente en torno a 8 semanas. El propio andamio (véase la discusión) tiene osteogénicas propiedades inductivas y ha demostrado la capacidad de inducir algunos de regeneración ósea. Los resultados típicos de colocación de andamio sin células muestra que alrededor de un tercio del defecto tendrá de novo la formación de hueso a las 8 semanas. Con el aumento de adiposas derivadas de las células del estroma, completamente dos tercios o más del defecto se muestran en la regeneración ósea alrededor de 8 semanas, aunque hay variability entre cada animal, y la cirugía. La formación de tejido esquelético se puede cuantificar mediante histología y los resultados típicos muestran una mayor formación de osteoide en las muestras con las ASC a través de la tinción de azul de anilina y Pentacromo (Figura 3C). Además, mostramos que las células implantadas humanos contribuyen a la formación de novo subyacente óseo a través del uso de hASCs GFP-etiquetados que muestran tinción in vivo a las 2 semanas cerca de la zona de formación de hueso de novo en el defecto craneal (Figura 3D) . Además, usamos inmunohistoquímica con un anticuerpo específico humano para mostrar la supervivencia de células humanas y contribución en la zona del defecto (Figura 3E). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig1.jpg" /> Figura 1 A -. El lipoaspirado tiene dos capas. La capa superior contiene los adipocitos y la mayoría de la processes material celular, mientras que la capa inferior contiene la solución salina utilizada durante el procedimiento lipoaspiración. B - la creación del defecto craneal a través de una incisión de línea media sobre el pericráneo para aislar el hueso parietal derecho, posterior creación de un 4 mm de tamaño crítico defecto craneal sin interrupción de la duramadre subyacente. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig2.jpg" /> Figura 2. Visión general de la cosecha y la aplicación de lipoaspirado del aislamiento de adiposas derivadas de las células del estroma a su expansión, diferenciación y uso in vitro e in vivo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig3.jpg" /> Figura 3. Un MicroCT-muestra en la curación in vivo del defecto de tamaño crítico de calota con la aplicación de las ASC a través de un hydroxyapatitie andamio (fila inferior). Los controles incluyen ningún andamio y el defecto (fila superior) y el defecto con la colocación del andamio sin células (fila del medio) B - Cuantificación de la curación ósea a partir de la MicroCT mostrando curación significativamente mayor en el grupo de ASC. C - Histología mostrando una mayor formación de osteoide del grupo ASC (fila inferior) a través de la tinción de azul de anilina y Pentacromo. Para Anilina Azul, las manchas de color azul oscuro y osteoide por Pentacromo, las manchas osteoide amarillo. D - hASCS marcadas con GFP se sembraron en un andamio y se coloca en un defecto de la bóveda craneal y se sacrificaron a las 2 semanas. La tinción se realizó con una GFP anticuerpo marcado para mostrar las células humanas que contribuyen a la regeneración en la zona del defecto. E -. Inmunohistoquímica Humanos antígeno nuclear que muestra la prevalencia de las células humanas en el área del defecto a las 2 semanas <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4221/4221fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> .

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Desde el aislamiento de tejido adiposo derivado de células estromales 2 de lipoaspirado, estas células se han diferenciado en una amplia variedad de linajes celulares. El tejido adiposo es de origen mesodérmico y por lo tanto, multipotentes derivadas de tejido adiposo células estromales será probablemente más eficaz con aplicación hacia un linaje mesodérmico. La capacidad de generar tejido óseo es especialmente importante dada la escasez de zonas donantes para un autoinjerto y las limitaciones inherentes de l...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo: </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Lipoaspirado Harvest </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010-023 </td><td></td></tr><tr><td> Solución salina equilibrada de Hank </td><td> Cellgro </td><td> 21-023 CV- </td><td></td></tr><tr><td> La colagenasa </td><td> Sigma </td><td> C6885-500MG </td><td></td></tr><tr><td> Filtro de células 100 micras </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td><td></td></tr><tr><td> Steri-top 500 ml 0,22 micras filtro </td><td> Millipore </td><td> SCGPT05RE </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Defecto del calvario </td></tr><tr><td> Z500 Brushless MicromotorsUM50C </td><td> NSK </td><td> NSKZ500 </td><td></td></tr><tr><td> Circular Knife 4,0 mm </td><td> Xemax quirúrgica </td><td> CK40 </td><td></td></tr></tbody></table>

la reparación de un modelo de defecto crítico del tamaño de calota uso adiposo derivados de las células del estroma cosechadas desde lipoaspirado

Repair of a Critical-sized Calvarial Defect Model Using Adipose-derived Stromal Cells Harvested from Lipoaspirate

Reparación y regeneración del esqueleto craneofacial ofrece la promesa de la formación de tejido de novo a través de un enfoque basado en células utilizando células madre. Derivadas de tejido adiposo células del estroma (ASCs) han demostrado ser una fuente abundante de células madre multipotentes capaces de experimentar diferenciación osteogénica, condrogénicos, adipogénicos, y miogénica. Muchos estudios han explorado el potencial osteogénico de estas células in vivo con el uso de biomateriales andamios diferentes para la entrega celular. Se ha demostrado que mediante la utilización de un osteoconductivos, con recubrimiento de hidroxiapatita poli (láctico-co-glicólico) (PLGA-HA) andamio se sembró con ASC, un defecto de la bóveda craneal de tamaño crítico, un defecto que se define por su incapacidad de someterse espontánea cicatrización durante la vida del animal, se puede mostrar efectivamente la regeneración ósea robusta. Este modelo in vivo demuestra la base de enfoques translacional destinada a regenerar el tejido óseo - el celularcomponente y la matriz biológica. Este método sirve como un modelo para la aplicación clínica final de una célula progenitora hacia la reparación de un defecto específico de tejido.

Este protocolo describe el aislamiento de tejido adiposo derivado de células estromales de lipoaspirado y la creación de un 4 mm de tamaño crítico defecto craneal para evaluar la regeneración esquelética.

La reparación de un modelo de defecto crítico del tamaño de calota Uso adiposo derivados de las células del estroma cosechadas desde lipoaspirado

La reparación y regeneración del esqueleto craneofacial ofrece la promesa de una formación de tejido de novo mediante un enfoque basado en células que utiliza células madre.

El objetivo general de este procedimiento es obtener células estromales multipotentes a partir de tejido adiposo con el fin de inducir su diferenciación osteogénica, utilizando un modelo in vivo de defecto calvarial en un ratón. Esto se logra primero aislándolas células progenitoras de la capa vascular estromal del tejido adiposo, que puede obtenerse tras un procedimiento de liposucción. El siguiente paso consiste en preparar un andamio tridimensional y luego sembrar las células sobre ese soporte. El paso final consiste en la creación de un defecto calvarial de tamaño crítico en un modelo murino en el que se colocan el andamiaje y las células. En definitiva, los resultados muestran que las células estromales multipotentes aisladas del tejido adiposo tienen potencial para la regeneración esquelética in vivo. Las aplicaciones de esta técnica abarcan un amplio espectro de posibles aplicaciones clínicas debido a la escasez de tejido disponible para la regeneración esquelética.Aunque los injertos óseos autólogos son el estándar de oro, la falta de sitios donantes y la morbilidad del sitio donante limitan esta opción. Los aloinjertos y materiales extraños pueden utilizarse, pero están limitados por el costo, la mala integración y el riesgo de infección.El posible uso del tejido adiposo o graso para el aislamiento de células progenitoras en la ingeniería de tejidos esqueléticos es emocionante. El procedimiento será demostrado por mí y por Michael Chung del laboratorio Long Anchor. En primer lugar, obtenga tejido adiposo subcutáneo humano a partir de procedimientos electivos de liposucción por aspiración.Y observe las dos capas en el aspirado lipídico. El sobrenadante contiene la gran mayoría del material celular del proceso. La capa inferior consiste principalmente en solución salina inyectada.Las células estromales derivadas del tejido adiposo pueden obtenerse de cualquiera de las capas, pero el rendimiento es mucho mayor a partir del sobrenadante. Para aislar la fracción vascular estromal o lavado de SVF, lave extensamente el aspirado de grasa con volúmenes iguales de solución salina tamponada con fosfatos 1x o PBS que contenga Betadine al 2,5 %; luego aspire un volumen igual de PBS 1x sin Betadine. Deje que el lavado sedimente.Asegúrese de mantener una técnica estéril durante todo el proceso para evitar la contaminación con tejido humano procesado. A continuación, aspire la capa inferior y deseche. Después de cada lavado, transfiera 15 mililitros de tejido adiposo a tubos cónicos Falcon de 50 mililitros. Luego, digiera el tejido adiposo en 15 mililitros filtrados de 0,075 % filtrado.Incube tipo dos colagenasa en solución salina equilibrada de Hank o HBSS a 37 grados Celsius en un baño de agua durante 60 minutos bajo agitación constante; asegúrese de ventilar los tubos cada 15 minutos. Luego, neutralice la actividad enzimática con 15 mililitros de PBS que contenga 10 % de suero bovino fetal o FBS y centrifugue. Para obtener un pellet denso de SVF, el pellet será una mezcla de células madre derivadas del tejido adiposo y eritrocitos.Descarte primero la capa de grasa del sobrenadante y luego deseche la capa líquida del sobrenadante sin perturbar el precipitado. Re_suspenda el precipitado en 10 mililitros de medio de crecimiento tradicional. A continuación, combine tres tubos en un tubo cónico limpio de 50 mililitros a través de un filtro de 100 micrones y centrifugue.Descarte el sobrenadante sin perturbar el precipitado y luego resuspenda el precipitado. En cinco mililitros de medio de crecimiento tradicional, combine dos tubos cónicos de 50 mililitros por cada placa de 10 centímetros, o cinco tubos cónicos de cinco mililitros por cada placa de 15 centímetros. Establezca cultivos primarios durante la noche a 37 grados Celsius con 21% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono.Después de incubar durante la noche, lave las placas con PBS para eliminar los glóbulos rojos residuales no adheridos. Las poblaciones celulares resultantes son células estromales derivadas del tejido adiposo. Mantenga las células a niveles subconfluentes para prevenir la diferenciación espontánea.A 37 grados Celsius, 21 % de oxígeno y 5 % de dióxido de carbono. En medio de crecimiento, las células generalmente deben dividirse cada tres o cuatro días en medio de crecimiento habitual. Cuando se siembran al 50 % de confluencia, prepare el andamio como se explica en el manuscrito adjunto.Cuando las células alcancen niveles de subconfluencia, lave las células dos veces con PBS y tripsine. Cuente las células para cuantificarlas. Para la siembra, prepare para sembrar las células sobre andamios precortados de cuatro milímetros de diámetro con 1,5 veces 10 a la quinta células.Coloque un andamio individual en un pocillo de una placa de 96 pocillos y luego suspenda las células en medio de crecimiento regular con una concentración de aproximadamente 1,5 × 10⁵ células por 20 microlitros de medio. Siembre el andamio pipeteando 20 microlitros de la solución directamente sobre el andamio y coloque esto en el incubador de cultivo celular durante 30 minutos.Después de 30 minutos, agregue 200 microlitros de medio y permita que las células se incuben sobre el andamio durante la noche. Antes de la cirugía, no es necesario asegurar la adhesión de las células al andamio como si fuera siembra. Un número suficiente de células garantizará que la mayoría se adhiera al andamio.Después de anestesiar un ratón CD1 nu/nu adulto de 60 días de edad, esterilice el sitio quirúrgico con Betadine y alcohol tres veces y coloque lubricante sobre los ojos de los ratones. A continuación, realice una incisión sagital media en el cuero cabelludo del ratón para exponer el hueso parietal derecho. Retire el perrostio del hueso parietal derecho mediante raspado romo.A continuación, cree un defecto unilateral de cuatro milímetros de espesor total en el hueso parietal derecho no asociado a sutura. Utilizando una broca de fresa recubierta de diamante, tenga extrema precaución para no perturbar la duramadre subyacente, ya que el grosor calvarial del ratón es inferior a 0,3 milímetros antes del implante. Enjuague los andamios con PBS estéril para evitar la transferencia de factores de crecimiento derivados del medio.Coloque el andamio en el defecto. Finalmente, sutúre la piel y supervise al animal según los protocolos postoperatorios establecidos. Realice una tomografía computarizada micro para obtener una imagen tridimensional reconstruida utilizando el software microview.Utilice Adobe Photoshop para ajustar las imágenes a una altura estándar. Normalmente, medimos la regeneración calvarial cada dos semanas. Los ratones son anestesiados durante la exploración para el seguimiento a largo plazo y, finalmente, son sacrificados.Para el análisis histológico, utilice la herramienta de varita mágica para medir los píxeles del defecto craneal. Determine el porcentaje de curación del defecto mediante escáneres de TC posteriores. Mida el área del defecto craneal, determine el número de píxeles y divídalo por el número original de píxeles del defecto; tiña múltiples secciones a lo largo del tramo del defecto utilizando tinciones histológicas como azul de alizarina y rojo de ponceau para indicar la formación ósea.Utilice Adobe Photoshop para recortar todas las áreas que no estén en el defecto craneal y use la herramienta de selección mágica para determinar el número de píxeles correspondientes a la formación ósea de novo en el área del defecto, y compare esto con los controles u otras variables mostradas. A continuación se presenta una visión general de la obtención y aplicación del aspirado de grasa, desde el aislamiento de células estromales derivadas del tejido adiposo hasta su expansión, diferenciación y uso in vitro e in vivo. A continuación se muestra una microtomografía computarizada que ilustra la cicatrización in vivo de un defecto craneal de tamaño crítico mediante la aplicación de células ASC a través de un andamio de hidroxiapatita, observado en la fila inferior.Los controles, que se observan en la fila superior, incluyen ausencia de andamio y defecto. La fila media muestra el defecto con la colocación del andamio sin células. LS, mostrado aquí, es la cuantificación de la cicatrización ósea a partir de la micro-TC, que muestra una cicatrización significativamente mayor en el grupo A SC.Esta es una imagen histológica que muestra el aumento de la formación ósea del grupo A SC mediante andal. En azul y lapicero AROM, la tinción es para al. En azul, el osteoide se tiñe de azul oscuro con lapicero arom.Las manchas de osteoide de color amarillo que se muestran aquí corresponden a ASC humanas marcadas con GFP, las cuales fueron sembradas sobre un andamio y sacrificadas a las dos semanas. La tinción se realizó con un anticuerpo marcado con GFP para mostrar las células humanas que contribuyen a la regeneración en el área del defecto. Aquí se muestra la inmunoquímica para antígeno nuclear humano, que evidencia la presencia de células humanas en el área del defecto a las dos semanas.Una vez dominado, el procesamiento del tejido adiposo puede realizarse en menos de cuatro horas, y el procedimiento quirúrgico puede tomar unos 10 minutos por ratón. Es importante recordar que el hueso parietal es redondeado mientras que la fresa es plana, por lo que se debe tener cuidado para atravesar toda la circunferencia del defecto de cuatro milímetros. Recuerde proceder lentamente para evitar lesionar la duramadre del cerebro.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar las células progenitoras del tejido adiposo. Siembre estas células sobre un andamio y colóquelas en el ratón.

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