El estudio de la proteólisis de ciclina B en el nivel de células individuales en poblaciones de células enteras

El objetivo de este procedimiento es monitorear cómo la proteólisis de la ciclina B regula el inicio de la anafase y la salida mitótica. Esto se logra primero sembrando células con el reportero rápido de ciclina B en láminas de microscopía. El segundo paso consiste en marcar la molécula quimérica del reportero rápido de ciclina B con el sustrato fluorescente TMR star.

A continuación, se adquieren las series de imágenes en una estación de microscopía. El paso final consiste en analizar las células y calcular la intensidad de fluorescencia de TMR star a lo largo del tiempo, lo que refleja la proteólisis de la ciclina B. En última instancia, la microscopía de inmunofluorescencia de células vivas marcadoras revela la cinética de la proteólisis de la ciclina B que tiene lugar durante la mitosis.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el monitoreo de ciclona BGFP es que la ciclona B SNAP permite el seguimiento de la degradación de la ciclona B en lugar de la expresión completa de la proteína. Inicialmente, se permite que las células reporteras snap crezcan de forma asincrónica en fase logarítmica durante al menos 48 horas. Para comenzar, el procedimiento para sembrar tripsina consiste en utilizar células reporteras snap subconfluentes para la siembra de células en cámaras microscópicas de ocho pocillos, con una distribución constante en toda la superficie de la centrífuga de la cámara.

10.000 células y medio de resuspensión en 350 microlitros de medio de crecimiento normal sin rojo de fenol. Transfiera la suspensión celular a la cámara del microscopio para la siembra de células en cámaras microscópicas de ocho pocillos con una densidad celular máxima en el centro de la cámara. Primero, cargue la cámara con 300 microlitros de medio de crecimiento normal sin rojo de fenol.

A continuación, agregue con cuidado 5.000 células al centro de la cámara del microscopio para sembrarlas en placas de 96 pocillos con óptica especial, asegurando una distribución constante en toda la superficie del pocillo. Centrifugue 5.000 células y resuspenda en 300 microlitros de medio de crecimiento normal sin rojo de fenol, según el número total de pocillos que deban contener células. Ajuste el número de células y el volumen total del medio de suspensión.

Luego, transfiera la suspensión celular a una placa de 96 pocillos para sembrar las células en placas de óptica especial de 96 pocillos con máxima densidad celular en el centro del pocillo. Añada cuidadosamente 1.500 células en 15 microlitros de medio de crecimiento normal libre de rojo de fenol en una pequeña gota al centro de cada pocillo.

Esto restringirá el crecimiento celular al centro del pocillo. Deje que todas las células sembradas crezcan durante al menos 18 horas en condiciones estándar de cultivo celular, 30 minutos antes del inicio del procedimiento de tinción. Caliente porciones de medio de crecimiento normal sin rojo de fenol a 37 grados Celsius.

El sustrato de fijación rápida en esta demostración es TMR star para facilitar el manejo del TMR star. Disuelva el TMR star en DMSO para obtener una solución stock con una concentración de 400 micromolar. Diluya 0,5 microlitros de la solución stock de TMR star en 200 microlitros de medio de crecimiento normal tibio sin fenol rojo para obtener una concentración final de etiquetado de un micromolar. A continuación, retire el medio de crecimiento normal de las células que crecen de forma asincrónica y sustitúyalo por el medio de etiquetado. Incube las células en el medio de etiquetado durante 25 minutos bajo condiciones estándar de cultivo.

Después de 25 minutos, retire el medio de marcado y lave las células cuatro veces con medio de crecimiento normal tibio libre de rojo de fenol. Después del lavado final, incube las células en 300 microlitros de medio de crecimiento normal tibio libre de rojo de fenol durante 30 minutos antes de transportarlas al microscopio. Reemplace el medio con medio de crecimiento normal tibio fresco libre de rojo de fenol para eliminar el sustrato de snaps no unido; transporte las células al microscopio en una caja de poliestireno sobre un bloque calefactor precalentado a 37 grados Celsius.

Para minimizar la variación de temperatura, dos horas antes de la medición de la intensidad de fluorescencia, ajuste la temperatura del aire en la cámara climática a 37 grados Celsius en modo seco, con el fin de llevar al microscopio y a todos sus componentes a la temperatura deseada. Para evitar la condensación y posibles daños posteriores al microscopio, es importante precalentar antes de ajustar la humedad.

Cuando todo el sistema del microscopio haya alcanzado 37 grados Celsius, ajuste la humedad del aire al 60 % y el dióxido de carbono al 5 %. Inicie el software de escaneo o adquisición y defina los ajustes estándar. Defina las posiciones de los pocillos que se analizarán. Defina el delta T o el tiempo del ciclo de adquisición y el número absoluto de ciclos de adquisición.

En esta demostración, se ha preseleccionado el enfoque automático de hardware para analizar un mayor número de pocillos. Inicie la adquisición y supervise los dos primeros ciclos de adquisición.

El microscopio enfocará la señal de histona H2A GFP, adquiriendo posteriormente una primera imagen en ese canal antes de cambiar el filtro y adquirir la imagen correspondiente de TMR star. Esto se repite luego para todas las posiciones dentro de un pocillo y para cada uno de los pocillos que se examinarán, antes de repetir el siguiente ciclo. Para analizar los perfiles proteolíticos, inicie el software de análisis ScanR.

Analice las imágenes con los núcleos celulares visualizados mediante histona H dos GFP, definidos como el objeto principal utilizando un umbral basado en la intensidad de la señal y un algoritmo de watershed para ayudar a separar las células adyacentes. Se debe crear un subobjeto compuesto por núcleo con citoplasma para el análisis de TMR estrella. Las propiedades importantes del objeto principal son las posiciones X e Y, el tiempo y las intensidades máxima y media de GFP para el objeto principal, así como la intensidad total dividida por el área.

Para el subobjeto de la estrella TMR, cambie al modo de trazado para visualizar la intensidad media de fluorescencia de la estrella TMR a lo largo del tiempo o los trazos celulares asignados a los objetos principales analizados. Observar un mayor número de células permite obtener una primera visión representativa y objetiva, pero la cantidad de células a examinar puede reducirse mediante la selección de aquellas mediciones que duren al menos 140 ciclos y que presenten una intensidad máxima elevada de histona H2 GFP. Seleccione un trazo celular de interés para visualizar simultáneamente la fluorescencia de la histona H2 GFP y la estrella TMR a nivel individual de célula.

Utilizando el botón derecho del ratón, haga clic en una celda de interés y genere una imagen exportable. Galería para ilustrar la histona H2 GFP y la ciclina B marcada con TMR estrella en cada punto temporal. Cambie al modo de población del software de análisis del escáner y delimite la región donde se representa la celda de interés en el diagrama de puntos.

Aplique una nueva ventana de gráfico de puntos a la región seleccionada y visualice la intensidad media de fluorescencia de TMR star a lo largo del tiempo. Exporte los datos a Microsoft Excel para realizar cálculos adicionales. Las figuras aquí mostradas representan la cinética de la ciclina B, expresada mediante una curva de intensidad de fluorescencia de TMR star de una célula que atraviesa una mitosis normal sin signos de desalineación cromosómica tras la compactación del citoplasma tras la ruptura de la envoltura nuclear o NEBD, tal como indica el triángulo rojo. La intensidad de fluorescencia de TMR staph muestra un aumento brusco hasta que se alcanza la ventana isomórfica.

Cuando la célula entra en prometafase, la intensidad de fluorescencia se mantiene en un nivel estable mientras la célula avanza a través de la profase y la metafase, y luego comienza a disminuir rápidamente. Una vez que todos los cromosomas han establecido una placa metafásica estable, esta disminución precede a la separación de los cromosomas. Durante la anafase, indicada por el punto azul en la curva en la mitosis tardía, la cromatina comienza a descondensarse y la célula adopta una morfología en fase.

Mientras la curva de intensidad de fluorescencia se aproxima a la meseta, que es más baja que la meseta anterior a la mitosis tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la mitosis exploraran el equilibrio estrecho entre el ciclo celular, la degradación y la síntesis que regula la progresión mitótica.