El estudio de la proteólisis de ciclina B en el nivel de células individuales en poblaciones de células enteras

Metafase anafase transición se activa a través de la promoción de complejos anafase (APC / C)-dependiente de ubiquitinación y posterior destrucción de la ciclina B. En este caso, hemos establecido un sistema que, a raíz de pulso-caza etiquetado, permite monitorizar la proteólisis de ciclina B en poblaciones de células enteras y facilita la detección de interferencia por el puesto de control mitótico.

El objetivo de este procedimiento es monitorizar cómo la proteólisis del ciclo B gobierna el inicio de la anafase y la salida mitótica. Esto se logra mediante la siembra inicial de células reporteras de snap de ciclo B en portaobjetos de microscopía. El segundo paso es marcar la molécula quimérica Cyclin B snap reporter con el sustrato fluorescente TMR star.

A continuación, las series de imágenes se adquieren en una estación de microscopía. El paso final es analizar las células y calcular la intensidad de fluorescencia de las estrellas TMR a lo largo del tiempo, lo que refleja el ciclo de la proteólisis B. En última instancia, la microscopía de inmunofluorescencia de células reporteras vivas revela la cinética del ciclo de la proteólisis B que tiene lugar durante la mitosis.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el monitoreo del ciclón BGFP, es que el ciclón B SNAP permite monitorear la degradación del ciclón B en lugar de la expresión de proteínas completas. Inicialmente, se permite que las celdas reporteras de ajuste para este experimento crezcan de forma asíncrona en fase logarítmica durante al menos 48 horas. Para empezar, el procedimiento para sembrar tripsina es la subconfluencia de células reporteras para la siembra de células en ocho cámaras de microscopio de pocillos con una distribución constante en toda la superficie de la centrífuga de cámara.

10.000 células y Resus gastan en 350 microlitros, un medio de crecimiento normal libre de rojo fenol. Transfiera la suspensión celular a la cámara del microscopio para sembrar las células en ocho cámaras de microscopio de pocillos con una densidad celular máxima en el centro de la cámara. Primero cargue la cámara con 300 microlitros de medio de crecimiento normal libre de fenotipos rojos.

A continuación, agregue 5.000 células con cuidado al centro de la cámara del microscopio para sembrar las células en 96. Placas ópticas especiales de pocillo en una distribución constante a través de toda la superficie de la centrífuga de pocillo, 5.000 células y se resuspenden en 300 microlitros de medio de crecimiento normal libre de rojo fenol dependiendo del número total de pocillos que contienen pocillos requeridos. Ajuste el número de celdas y el volumen total del medio de suspensión.

A continuación, transfiera la suspensión de células a una placa de 96 pocillos para sembrar las células en 96. Placas ópticas especiales para pozos con máxima densidad celular en el centro del pocillo. Agregue con cuidado 1,500 células en 15 microlitros de medio de crecimiento normal libre de rojo fenol en una pequeña gota en el centro de cada pocillo.

Esto restringirá el crecimiento celular al centro del pocillo. Permita que todas las células sembradas crezcan durante al menos 18 horas en condiciones estándar de cultivo celular 30 minutos antes del comienzo del procedimiento de tinción. Calentamiento cuasi de rojo fenol libre de medio de crecimiento normal a 37 grados centígrados.

El sustrato a presión en esta demostración es TMR star para facilitar el manejo de la estrella TMR disuelta en DMSO para obtener una solución madre con una concentración de 400 micromolares diluidos 0,5 microlitros de la solución madre TMR star. En 200 microlitros de medio de crecimiento normal libre de rojo de fenol tibio para obtener una concentración de marcaje final de un micromolar. A continuación, retire el medio de crecimiento normal de las células en crecimiento asincrónico y reemplácelo con un medio de marcaje para incubar las células en el medio de marcaje durante 25 minutos en condiciones de cultivo estándar.

Después de 25 minutos, retire el medio de etiquetado y lave las células cuatro veces con un medio de crecimiento normal libre de rojo fenol tibio. Después del lavado final, incube las células en 300 microlitros de medio de crecimiento normal libre de rojo fenol tibio durante 30 minutos antes de transportarlas al microscopio. Reemplace el medio con un medio de crecimiento normal fresco, tibio y sin rojo fenol para eliminar las células de transporte de sustrato residuales y no unidas al microscopio en una caja de espuma de poliestireno en un bloque de calor precalentado a 37 grados Celsius.

Para minimizar la variación de temperatura dos horas antes de la medición de la intensidad de fluorescencia. Ajuste la temperatura del aire de la cámara climática a 37 grados centígrados en modo seco para que el microscopio y todos sus componentes alcancen la temperatura deseada. Para evitar la condensación y el consiguiente daño al microscopio, es importante precalentar antes de ajustar la humedad.

Cuando todo el sistema de microscopio haya alcanzado los 37 grados centígrados, ajuste la humedad del aire al 60% y el dióxido de carbono al 5%Inicie el software de escaneo o adquisición y defina los ajustes estándar. Definir las posiciones de los pozos a analizar. Defina el delta T o tiempo de ciclo de adquisición y el número absoluto de ciclos de adquisición.

En esta demostración. El enfoque automático de hardware está preseleccionado para el análisis de un mayor número de pocillos. Inicie la adquisición y supervise durante los dos primeros ciclos de adquisición.

El microscopio se centrará en la histona H dos señales GFP con la posterior adquisición de una primera imagen en ese canal antes de que se cambie el filtro y se adquiera la imagen de estrella TMR correspondiente. Es decir, se repiten para todas las posiciones dentro de un pozo y para cada uno de los pozos que se van a examinar antes de repetir el siguiente ciclo. Otra vez. Para analizar los perfiles proteolíticos, inicie el software de análisis R de escaneo.

Analice las imágenes con los núcleos celulares visualizados por la histona H dos GFP, definida como el objeto principal utilizando un umbral basado en la intensidad de la señal y un algoritmo de cuenca hidrográfica para ayudar a separar las células vecinas. Se debe crear un subobjeto que consista en un núcleo con citoplasma para el análisis de estrellas TMR. Las propiedades importantes del objeto principal son las posiciones X e Y, el tiempo y el máximo, y las intensidades medias de GFP para el objeto principal y la intensidad total dividida por el área.

Para el subobjeto de estrella TMR, cambie al modo de rastreo para visualizar la intensidad media de fluorescencia de la estrella TMR del subobjeto a lo largo del tiempo o las trazas de células asignadas a los objetos principales analizados. Observar un mayor número de células permite una primera visión representativa y objetiva, pero el número de células que se van a examinar puede reducirse limitando a aquellas mediciones que duren al menos 140 ciclos y que contengan una gran intensidad máxima de histona H y dos GFP. Seleccione una traza de célula de interés para visualizar la histona H, dos estrellas GFP y TMR fluorescentes simultáneamente a nivel de célula única.

Con el botón derecho del ratón, haga clic en una celda de interés y genere una imagen exportable. Galería para la ilustración de la histona H, dos GFP y el ciclo B snap TMR estrella para cada vez. Cambie el punto al modo de población del software de análisis del escáner y compruebe la región donde se representa la celda de interés en la mancha de puntos.

Aplique una nueva ventana de diagrama de puntos a la región cerrada y visualice la intensidad media de fluorescencia de las estrellas TMR a lo largo del tiempo. Exporte datos a Microsoft Excel para realizar cálculos posteriores. Las figuras aquí representan la cinética de la ciclina B, representada por una curva de intensidad de fluorescencia de estrella TMR de una célula que procede a través de una mitosis regular sin signos de desalineación cromosómica tras la compactación del citoplasma después de la ruptura de la envoltura nuclear o NEBD, como lo indica el triángulo rojo: la intensidad de fluorescencia del estafilococo TMR muestra un aumento abrupto hasta que se alcanza la ventana isomórfica.

Cuando la célula entra en prometafase, la intensidad de la fluorescencia permanece en un nivel estable mientras la célula pasa por la profase y la metafase, y luego comienza a caer rápidamente. Una vez que todos los cromosomas han establecido una placa metafásica estable, esta caída precede a la separación cromosómica. Durante la anafase indicada por el punto azul en la curva en la mitosis tardía, la cromatina comienza a desconcondensarse y la célula adopta la morfología de fase.

Mientras que la curva de intensidad de fluorescencia se acerca a la meseta, que es más baja que la meseta antes de la mitosis después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la mitosis exploraran el estrecho equilibrio entre el ciclo, la degradación y la síntesis que regula la progresión mitótica.