Un método práctico y novela para extraer el ADN genómico de los kits de extracción de sangre para la Preservación Plasma Protein

Este video describirá un método práctico y novedoso para extraer ADN genómico de nuevo sistema de preservación de proteínas plasmáticas BDP 100 conocido como tubos P 100. TNA. La extracción a partir de suero y más tubos de plasma ha sido un procedimiento bastante común en el pasado, pero la combinación de este nuevo tubo P 100 y el método de extracción presentado aquí ofrece un enfoque novedoso y más sencillo para obtener ADN de mejor calidad con mucho menos esfuerzo. El interior del tubo P 100 está recubierto con EDTA de potasio y con inhibidores de proteasas.

Esto evita la coagulación y estabiliza las proteínas plasmáticas. La sangre se recoge en estos tubos con el fin de obtener plasma para su análisis después de la centrifugación. La sangre contenida en un P 100 se separará en capas según la densidad: plasma en la parte superior, glóbulos rojos en la parte inferior y glóbulos blancos.

La capa de buffy se encuentra entre estas dos capas. La recuperación del plasma es generalmente el uso principal de estos tubos. Se realizan varias mediciones utilizando este plasma, como los niveles de anticuerpos y de proteínas.

El componente leucocitario generalmente se descarta, pero, como se mostrará en este video, contiene suficiente ADN para varios análisis, incluidas la secuenciación, la genotipificación, la identificación de biomarcadores, entre otros. Los P100 están compuestos por tres componentes principales: tapón, tubo y separador. El separador mecánico migra justo por encima de la capa del componente leucocitario.

Para obtener acceso a la capa de coágulo leucocitario, es necesario aumentar la distancia entre el separador y dicha capa. Esto se logra mediante la adición de sacarosa al 17%. Normalmente, la capa de coágulo leucocitario se descarta junto con el P 102, pero, como se mostrará en este video, es posible recuperar fácilmente suficiente ADN de esta capa para realizar varias pruebas analíticas antes de extraer los tubos P 100 del congelador a menos 80.

Caliente un baño de agua a 37 grados Celsius, coloque cada tubo P 100 en el baño de agua caliente e incube durante aproximadamente cinco minutos para descongelar todas las muestras. Una vez que todas las muestras estén completamente descongeladas, debe eliminarse cualquier suero restante por encima del separador. A continuación, se añaden cinco mililitros de sacarosa al 17 % por encima del separador. Después de añadir la sacarosa, centrifugue todos los tubos durante 20 minutos a 2.500 ×g. Ahora que el separador está en la parte superior del tubo y separado del anillo leucocitario, puede retirarse fácilmente.

Pulverice etanol al 70 % sobre una toallita química y esterilice un gancho de clip de papel limpiando completamente toda su superficie. Sostenga el tubo P 100 en un ángulo de 45 grados con el clip de papel estéril. Comience a extraer el separador del tubo tirando suavemente del borde del separador y diríjalo hacia una bolsa de material biopeligroso.

Con el separador fuera, retire la mayor cantidad posible de la capa de sacarosa al 17 %, sin perturbar la capa del manto leucocitario ni la de los glóbulos rojos; ahora el manto leucocitario debe ser la capa superior en el tubo. Transfiera esta capa a un nuevo vial cónico de 15 mililitros etiquetado. El volumen del manto leucocitario extraído de cada tubo variará, pero debe ser inferior a tres mililitros.

Para normalizar el volumen de todos los tubos, agregue suficiente solución salina tamponada con fosfato PBS para llevar el volumen de cada tubo a tres mililitros. Ahora que todas las capas de buffy coat están suspendidas en un volumen igual, cualquier glóbulo rojo restante debe eliminarse mediante la adición de nueve mililitros de solución de lisis de glóbulos rojos (RBC).

A continuación, invierta los tubos varias veces durante una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente para separar los glóbulos rojos lisados del código Buffy. Centrifugue durante cinco minutos a 2.500 G; la centrifugación crea un pellet del cual se extraerá el ADN. Deseche este sobrenadante de cada tubo en un recipiente para residuos líquidos de riesgo biológico, dejando un pequeño volumen en el que se volverá a suspender el pellet. Vortexee el tubo para desalojar y resuspender el pellet.

Agregue tres mililitros de solución de lisis celular y vortexee vigorosamente durante al menos 10 segundos. Tras la lisis celular, las proteínas y el ADN quedan ahora libres en solución y deben separarse; comience precipitando las proteínas mediante un mililitro de solución de precipitación de proteínas, y VORTEXEANDO a alta velocidad durante al menos 15 segundos. A continuación, centrifugue los tubos durante cinco minutos a 2,500 ×g para formar un pellet de proteínas durante esta centrifugación.

Realice los pasos adecuadamente. Etiquete un vial cónico de 15 mililitros para cada muestra que se esté procesando en cada tubo nuevo. Transfiera tres mililitros de isopropanol al 100%.

Una vez que las proteínas se han precipitado y centrifugado, cada tubo debe tener un sedimento relativamente grande y un sobrenadante transparente mayormente acuoso. Decante el sobrenadante que contiene ADN de cada tubo al tubo correspondiente de isopropanol preparado durante la última centrifugación. El isopropanol provocará que el ADN en la solución se precipite en forma de pequeñas hebras blancas y filamentosa. Invierta todos los tubos 50 veces para asegurar una buena mezcla. A continuación, centrifugue todos los tubos durante tres minutos a 2.500 ×g para formar un sedimento de ADN. El ADN generalmente es visible como un pequeño sedimento blanco en el fondo del tubo. Sin embargo, un bajo rendimiento de ADN puede ser invisible a simple vista. Continúe con todas las extracciones hasta que se midan las concentraciones.

Independientemente de la presencia de un pellet de ADN, deseche el isopropanol. Lave el ADN agregando etanol al 70%. Este paso eliminará cualquier componente residual no deseado que pueda interferir con análisis posteriores. Centrifugue durante un minuto a 2.500 ×g. Para asegurar que el pellet de ADN quede bien adherido al fondo del tubo, deseche todo el etanol al 70% de los tubos e inviértalos sobre una toalla de papel limpia para que sequen al aire durante una hora.

No debe quedar etanol visible en los tubos al continuar con el protocolo. El paso final en la extracción consiste en resuspender el ADN en una solución. Tanto la solución de hidratación de ADN como el agua son opciones adecuadas para la mayoría de las extracciones.

Añada 250 microlitros de solución de hidratación de ADN menos para muestras que produzcan hebras o pelets de ADN poco visibles o nulos; vortex suavemente e incrementalmente para suspender el ADN. Finalmente, transfiera todo el ADN suspendido a un tubo de centrífuga. En este punto, la concentración y pureza del ADN pueden leerse mediante NanoDrop u otro espectrofotómetro.

Por lo general, se espera que la pureza del ADN sea similar a la del ADN extraído directamente de sangre total obtenida en tubos con EDTA de potasio recolectados exclusivamente con el fin de recuperar ADN. La concentración de ADN depende de la cantidad de material inicial, pero puede variar desde 50 nanogramos por microlitro hasta casi 1000 nanogramos por microlitro, con un promedio en el rango de 200 nanogramos por microlitro. La ventaja de utilizar este protocolo es doble. En primer lugar, permite a los clínicos usar una sola extracción de sangre para dos pruebas clínicas en lugar de extraer sangre dos veces.

En segundo lugar, simplifica el proceso de obtener acceso a las células que contienen ADN mediante el uso de tubos separadores mecánicos modernos en lugar de las generaciones anteriores. En los tubos con separador de gel de la generación anterior, tanto el gel separador como el coágulo de sangre actuaban como barreras para las células que contienen ADN. Con los tubos P 100, el separador mecánico se puede retirar fácilmente mediante separación por densidad con sacarosa al 17 %.

Esta es una captura de pantalla de la lectura del nano drop de una extracción promedio de ADN. Usando este método por muestra P 109, la extracción resultó en una solución de 250 microlitros con una concentración de 209 nanogramos por microlitro de ADN. El rendimiento total fue de aproximadamente 52 microgramos.

La relación 260 sobre 280, la medida principal para la pureza del ADN, se encontró dentro del rango óptimo de 1,8 a 1,9, con un valor de 1,88. Una medida secundaria para la pureza del ADN: la relación 260 sobre 230 estuvo cercana al rango esperado de 2 a 2,2, con un valor de 2,35.

Estos son resultados bastante típicos. Realmente, los rendimientos de las extracciones variarán en cantidad y calidad, dependiendo del volumen y estado de la sangre antes de la extracción, utilizando electroforesis en gel estándar con tinción de bromuro de etidio. Pruebas adicionales de calidad muestran que el ADN genómico extraído de tubos P 100 es tan intacto como el ADN extraído de sangre completa.

Esto es evidente por la banda gruesa y brillante que aparece en la parte superior de cada carril que contiene ADN genómico. Existen dos beneficios principales de utilizar este protocolo en lugar de métodos anteriores. En primer lugar, combina lo que normalmente serían dos extracciones de sangre en una sola.

En segundo lugar, este protocolo es más rápido y limpio que un protocolo que utiliza tubos típicos con separador de gel SST. Al eliminar la necesidad de deshacer habitualmente coágulos de sangre, los clínicos extraen dos tubos de sangre cuando se requieren pruebas genéticas y serológicas. Por lo general, se utiliza un tubo con separador de gel SST, denominado tubo con tapón dorado, y un tubo de EDTA con potasio, denominado tubo con tapón púrpura; el suero se retira del tubo SST y el ADN se extrae del tubo con tapón púrpura. Con este método, solo es necesario extraer un único tubo con tapón rojo P100.

Aunque las instituciones familiarizadas con el método de separación por gel para la extracción de ADN ya puedan estar recolectando un tubo para pruebas serológicas y genéticas simultáneamente, el método aquí presentado constituye una mejora incremental pero sustancial respecto a estos métodos existentes de separación por gel. Ambos métodos requieren la eliminación de algún tipo de separador, aunque el gel suele ser más incómodo de manejar que el separador plástico.

Los tubos separadores requieren que la sangre coagulada se homogenice a través de una malla metálica antes de la extracción de ADN. Esta homogeneización puede ser complicada, y la extracción de ADN resulta más difícil cuando están presentes en cantidad notable los glóbulos rojos, que no contienen ADN. Este método de extracción P 100 permite la separación de los glóbulos blancos que contienen ADN del hematocrito, dejando pocos glóbulos rojos que interfieran con la extracción de ADN.

Este sistema de recuperación de ADN a partir de un tubo de plasma P 100, en lugar de los tubos separadores de gel de generaciones anteriores, presenta numerosas ventajas. Los tubos P 100 contienen EDTA, que inhibe las endonucleasas dependientes de magnesio y actúa como anticoagulante para prevenir la coagulación sanguínea. El resultado final es una mayor integridad del ADN y un protocolo de extracción mucho más sencillo, específicamente al evitar la ruptura y la homogenización de sangre coagulada.

Además, la sangre desprovista de plasma puede almacenarse en P uno cientos indefinidamente, comprobado hasta tres años, hasta que se desee la extracción de ADN. Asimismo, los médicos generarían datos de pacientes más útiles con menos extracciones de sangre y, por consiguiente, con menos estrés para los pacientes sometidos a los procedimientos.