Un ensayo de explante para evaluar el comportamiento celular del mesénquima craneal

El objetivo de este procedimiento es monitorear el comportamiento de la cultura de meninges craneales. Bajo condiciones de cultivo definidas. El primer paso consiste en recolectar los cuernos uterinos de un ratón preñado sincronizado.

8,5 días post coito. Una vez aislados, los embriones se extraen del endometrio y el saco vitelino se elimina para la genotipificación. A continuación, las placas mesenquimatosas craneales se microdiseccionan y se transfieren a placas de cultivo celular recubiertas con matriz extracelular.

Se permite que los explantes X se adhieran y se cultivan hasta por 48 horas en presencia o ausencia de agentes farmacológicos definidos. Finalmente, se toman imágenes del explante para mostrar las diferencias en la migración celular. Este método es útil para responder preguntas clave, como cuáles son las vías de señalización y las proteínas de la matriz extracelular implicadas y que controlan el comportamiento del pliegue neural durante la elevación del pliegue neural.

La demostración visual de este método es fundamental porque los pasos de la microdisección son difíciles de aprender y requieren paciencia y práctica para dominarlos. Para comenzar, si se realizará inmunohistoquímica, prepare cubreobjetos; de lo contrario, omita este paso y recubra directamente las placas de cultivo celular con cubreobjetos circulares de vidrio esterilizados de 12 milímetros en ECM, sumergiéndolos en etanol. Deje que sequen al aire. A continuación, coloque un cubreobjeto esterilizado en cada pocillo de una placa de 12 pocillos.

Trabajando en una campana de flujo laminar, agregue un mililitro de matriz extracelular o ECM para recubrir los cubreobjetos o el fondo de una placa de cultivo de tejidos. Incube la placa a 37 grados Celsius durante tres horas; tras la incubación, aspire la solución de ECM y lave tres veces con PBS. En este punto, las placas recubiertas pueden usarse inmediatamente o envolverse y almacenarse a cuatro grados Celsius durante hasta dos semanas.

Adecuado para visualizar el embrión translúcido. Se preparan placas de Syl con fondos negros resistentes. Siguiendo el protocolo del fabricante.

Prepare las herramientas de disección insertando un alfiler minutien en un soporte para alfileres. Use un bloque de afilado para afilar la pinza una vez que todo esté preparado. Recolecte el útero de un ratón preñado sincronizado que se encuentre a 8.5 días post quot.

Coloque el útero aislado en un recipiente con PBS estéril y lávelo. Una vez bajo un microscopio de disección, separe los deciduos individuales usando tijeras con pinzas. Retire el tejido conectivo uterino con un movimiento de desgarro, teniendo cuidado de no ejercer presión y hacer salir al embrión del decídua.

Utilice pinzas para rasgar cuidadosamente el tejido uterino en el lado opuesto a la placenta. Para exponer el embrión contenido en la vesícula vitelina, use las pinzas para pellizcar el embrión y la vesícula vitelina desde la placenta y retire el tejido uterino del recipiente. A continuación, usando las pinzas para rasgar suavemente, retire la vesícula vitelina del embrión.

Coloque la bolsa vitelina en un tubo eppendorf para la genotipificación utilizando una pipeta; una vez aislado, determine la etapa del embrión contando los somitos. Idealmente, el embrión estará entre las etapas seis y diez somitos. En esta etapa, los pliegues neurales apenas comienzan a elevarse y la morfogénesis principal del mesénquima craneal aún no ha ocurrido.

Una vez determinado el estadio, transfiera el embrión a una placa negra de cultivo celular que contenga DMEM sin rojo de fenol. Primero, bajo un microscopio de disección con el mayor aumento posible, enfoque la cabeza del embrión utilizando una aguja de disección en cada mano y seccione la cabeza anterior a las meres rmba. A continuación, corte a lo largo de la línea media para bi.

Divida la cabeza en dos mitades iguales utilizando una aguja de disección en cada mano. Diseque los bordes externos a lo largo del margen de la cabeza del embrión y de la línea media. Retire según sea necesario para evitar confundir el explante deseado con tejido no deseado.

El explante contendrá cresta neural craneal migratoria, mesodermo paraxial y ectodermo de superficie para eliminar las células débilmente adheridas. Pipetee cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo con una punta de pipeta de 200 microlitros. Y para Pepin, levante cuidadosamente el explante con una punta de pipeta.

Coloque aproximadamente 10 microlitros de DMEM en el centro de un pocillo recubierto para cultivo de tejidos, con 20 microlitros de DMEM tibio suplementado con 15 %FBS; ahora se puede transferir la placa de cultivo a un incubador para cultivo de tejidos. Después de aproximadamente una a dos horas, el explante estará adherido y se puede añadir un volumen adicional de 250 microlitros de medio. Después de aproximadamente 24 horas, el explante estará firmemente adherido al cubreobjetos.

En este momento, se pueden agregar agentes farmacológicos al medio después de otras 24 horas; las células migrarán desde loss. Por lo general, se adquieren imágenes para documentar la distancia y el número de células que migran desde loss. En este punto, puesto que las comienzan a mostrar signos de viabilidad disminuida con incubaciones más prolongadas observadas.

Aquí se muestran ejemplos de células que migran de explantes craneales y de explantes de chix. Después de 48 horas en diferentes sustratos, tanto la forma como el tamaño de las células que migran del explante dependen del sustrato. La migración sobre sustrato se llevó a cabo en fibronectina, laminina, gel mátrix, matriz extracelular (ECM) y ácido hialurónico.

Tras seguir este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como inmunofluorescencia e imagenología en vivo, para investigar más a fondo las vías que regulan el comportamiento de las células de la cresta neural craneal durante la elevación del pliegue neural.