Alto rendimiento secuencial ELISA para la Validación de Biomarcadores de aguda injerto contra huésped

El objetivo general del siguiente experimento es utilizar Eliza secuencial de alto rendimiento para analizar de manera eficiente un gran número de nuevos biomarcadores que fueron descubiertos por proteómica. Esto se logra agregando primero muestras a una placa fuente, que se utiliza para crear dilución para cada biomarcador y para almacenar el plasma recuperado entre pruebas. A continuación, se analizan las de Eliza para cada proteína con el fin de determinar sus concentraciones en las muestras de los pacientes.

En última instancia, se puede evaluar la elevación de los niveles proteicos de estos biomarcadores al inicio de las manifestaciones clínicas de la enfermedad aguda de injerto contra huésped. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que los analizadores secuenciales pueden analizar múltiples proteínas nuevas que no siempre están disponibles con plataformas de sobremultiplexación. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de la enfermedad aguda de injerto contra huésped.

Los biomarcadores validados a través de este método ahora se están investigando para la atención clínica. Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre las complicaciones en el trasplante de células madre poéticas postraumáticas. También se puede aplicar al descubrimiento y validación de biomarcadores para otras enfermedades como el trasplante de pulmón, complicaciones, cáncer de pulmón o potencialmente cualquier enfermedad para la que sea útil un análisis de sangre de diagnóstico.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que es importante que los múltiples pasos se realicen de manera consistente para garantizar la reproducibilidad y la baja variabilidad de los lotes. El día antes del experimento, centrifuga las muestras alícuotas de plasma durante 10 minutos a 15, 300 RCF y cuatro grados Celsius para separar los coágulos en la parte inferior y los lípidos en la parte superior del plasma. A continuación, coloque 150 microlitros de plasma sin diluir de cada muestra en una placa inferior de 96 pocillos en V mediante pipeteo manual de acuerdo con mapas predefinidos. Envuelva la placa en Paraform y colóquela en una cámara humana a cuatro grados centígrados durante un máximo de 72 horas.

A continuación, después de reconstituir y diluir el receptor alfa de IL dos y el factor de crecimiento humano, o los anticuerpos de captura HGF según las especificaciones del fabricante, placa de 50 alícuotas de microlitros de cada anticuerpo en cada pocillo de las respectivas placas de medio pocillo de alta unión de 96 pocillos. A continuación, selle estas placas con un sellador de placas e incube durante la noche a cuatro grados centígrados. Ahora diluya reg three alpha con el tampón de recubrimiento del fabricante de acuerdo con el protocolo del fabricante y coloque 25 microlitros de la solución en cada pocillo de una placa de 3 84 pocillos sin maxor.

Luego, guarde esta placa sellada a cuatro grados centígrados también el primer día del experimento. Comience lavando la placa de prueba de IL dos receptores alfa y bloqueándola con blotto en TBS. Después de reconstituir el estándar, configure una curva estándar de ocho puntos según el protocolo del fabricante.

Siguiente placa, 50 microlitros de plasma sin diluir y 50 microlitros de cada patrón por duplicado desde la placa de origen hasta la placa de prueba ELIZA. A continuación, incube la placa sellada a temperatura ambiente en un rotador de placas ajustado a 300 RPM. Después de dos horas, recupere el plasma de la placa de prueba ELIZA de dos receptores alfa de IL y vuelva a colocarlo en la placa fuente de plasma sin diluir.

Luego, después de completar el EIA según el protocolo del fabricante, lea la densidad óptica de cada pocillo usando un lector de placas configurado de 450 a 570 nanómetros para los tres alfa Eliza ricos, primero transfiera 10 microlitros de plasma sin diluir a una placa de fuente inferior de vista separada, y luego agregue 90 microlitros de tampón de dilución proporcionado por el fabricante a cada pocillo para crear una placa de fuente de dilución de uno a 10. Después de completar el Reg three alpha Eliza, según el protocolo del fabricante, agregue la solución de parada a la placa de 384 pocillos y lea la densidad óptica de cada pocillo usando un lector de placas configurado de 450 a 620 nanómetros. Después de reconstituir y diluir el elefante y tn FFR, uno de los anticuerpos de captura según las especificaciones del fabricante, codifique cada pocillo de las respectivas placas de medio pocillo de alta unión de 96 pocillos con 50 microlitros de anticuerpos de captura.

A continuación, incube las placas de prueba selladas durante la noche a temperatura ambiente para la placa de elefante y a cuatro grados centígrados para la placa TN FFR de una placa. Después de completar la IL, dos receptores alfa, Eliza transfiere 60 microlitros de plasma sin diluir a una nueva placa fuente. Luego, a 60 microlitros de 1%BSA en PBS a cada pocillo para hacer una placa fuente de plasma diluida de uno a dos.

A continuación, lave y bloquee la placa de prueba HGF con BLOTTO en TBS y, a continuación, configure la dilución de la curva estándar de ocho puntos. Después de lavar la placa, siguiendo el paso de bloqueo de la placa de 50 microlitros, duplique las alícuotas de uno a dos plasma diluido y de cada patrón en la placa de prueba EISA. A continuación, incube la placa sellada durante la noche a temperatura ambiente en un rotador de placas ajustado a 300 RPM.

A la mañana siguiente, recupere el plasma diluido de uno a dos de la placa de prueba HGF Eliza y vuelva a colocarlo en la placa de fuente de plasma diluido de uno a dos. Después de completar el EIA, de acuerdo con el protocolo del fabricante, lea la densidad óptica de cada pozo usando un lector de placas configurado de 450 a 570 nanómetros el segundo día del experimento. Primero transfiera 10 microlitros de plasma sin diluir a una nueva placa fuente, y luego 190 microlitros de 1%BSA en PBS para hacer 200 microlitros de uno a 20 plasma diluido.

Luego, después de completar el elefante, Eliza, de acuerdo con el protocolo del fabricante, leyó la densidad óptica usando un lector de placas configurado entre 450 y 570 nanómetros. Para el TN FFR, Eliza primero agrega 25 microlitros de 1%BSA y PBS a la placa fuente de uno a 20, lo que da como resultado 125 microlitros de plasma diluido de uno a 25 por pocillo. Luego, después de completar el TN FFR one EIA según el protocolo del fabricante, lea la densidad óptica de cada pocillo utilizando un lector de placas configurado de 450 a 570 nanómetros para la primera transferencia I-L-H-E-I-A, 60 microlitros de plasma diluido de uno a dos a una nueva placa fuente, y luego agregue 180 microlitros de diluyente IL ocho a cada pocillo para hacer una placa fuente de plasma diluida de uno a seis.

Luego, después de completar el ILH Eliza según el protocolo del fabricante, lea la densidad óptica de cada pocillo usando un lector de placas configurado de 450 a 570 nanómetros. Finalmente, una vez que se hayan completado todos los Eliza, reemplace el plasma de conversación no utilizado en el pensamiento Eloqua y congele para uso futuro. En este gráfico, las densidades ópticas para la curva estándar de siete placas ELIZA diferentes que miden las concentraciones de reg three alpha correspondientes a los 1084 pacientes examinados para el informe inicial de biomarcadores de injerto gastrointestinal contra huésped reg three alpha injerto versus huésped se muestran Las densidades ópticas consistentes entre las placas aseguran mediciones consistentes de concentración de proteínas entre experimentos.

Las concentraciones de las proteínas en las muestras de plasma se calcularon comparando las densidades ópticas de la muestra con las densidades ópticas de la curva estándar. Se puede utilizar una plataforma de manipulación robóticamente limpia para aumentar aún más la reproducibilidad y, al mismo tiempo, disminuir el volumen de plasma utilizado por el funcionamiento de Eliza y las placas de pocillos de forma creativa. Al planificar este procedimiento, es importante ejecutar primero las EIS que son plasma sin diluir para que pueda recuperarse y usarse en experimentos posteriores después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la proteómica exploraran biomarcadores candidatos en cualquier enfermedad de interés mediante el uso universal de Eliza s. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo validar múltiples biomarcadores usando E secuencial mientras usa pequeños volúmenes de plasma y minimiza los ciclos libres.