Name: Progenitor derivado de sistema de cultivo de oligodendrocitos de cerebro fetal humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-20T11:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Aprende a diferenciar progenitores neuronales fetales humanos en oligodendrocitos mediante factores de crecimiento específicos. Este protocolo genera poblaciones puras sin células de soporte para estudiar biología y enfermedades desmielinizantes.

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Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Salud, NINDS. Los autores desean agradecer a todos los miembros del Laboratorio de Medicina Molecular y Neurociencias, Rick Dreyfuss por ayudar con microscopía y tamizado Pamela C. por su ayuda en la edición.

Nota: Para el cultivo de rutina de las células progenitoras neurales y oligodendrocíticos linaje, la incubación se realiza a 37 ° C en un humidificado 5% de CO 2 atmósfera. Cada 2 días, el medio se sustituye con 50 a 100% de medio fresco si la cultura es 40-70% de confluencia. En el momento de confluencia cerca, los cultivos se pasaron a 2-2.5e6/T75 matraz por lo general con un programa semanal. 1. Preparación del frasco recubierto <ol><li> Para preparar matraces recubiertos diluir 5 mg de poli-D-lisina (PDL) en 100 ml de agua desionizada (DI-agua), luego capa matraces T75 con 50 ug / ml de PDL a temperatura ambiente (TA) en la oscuridad. Después de 1 ½ hr, aspirar el PDL y enjuague los frascos una vez con DI-agua. Que los matraces secos antes de la siembra de las células (Tabla 1). </li></ol> 2. A partir diferenciación de células progenitoras neurales progenitoras en oligodendrocitos derivados (DOP) El protocolo esolato humanos células progenitoras del SNC se describe en una publicación anterior y no es parte de este protocolo 1. Humanos de las células progenitoras del SNC se aislaron a partir del telencéfalo de un cerebro 8-semanas de gestación fetal, obtenido de acuerdo con las directrices del NIH. <ol><li> Grow población multipotencial de las células progenitoras neurales en PDL matraces recubiertos en medio neurobasal suplementado con 25 ng / ml de bFGF y 20 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Figura 1A). No los use si es superior a paso 11 (p11). </li><li> Iniciar para diferenciar las células progenitoras neurales cuando el cultivo es de aproximadamente 70% de confluencia. </li><li> Hacer medio de diferenciación de oligodendrocitos completa utilizando suero libre de DMEM / Hams F12 01:01 suplementado con albúmina de suero bovino, L-glutamina, gentamicina, componentes N2, T3, Shh, NT-3, bFGF y PDGF-AA (Tabla 1) . Este medio se define como medio oligo con factores de crecimiento (oligo medio GF +). </li><li> Retire Progenmedios Itor de los matraces, enjuagar las células una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS), a continuación se añade medio de oligo + GF (detalles descritos en 2,3) para iniciar la diferenciación de oligodendrocitos. Sólo las células comprometidas con el linaje oligodendrocíticos crecerá (Figura 1B). Cultivar las células en este medio durante 3 semanas. </li><li> Cada semana, cuando las células están en 90-95% de confluencia, paso utilizando tripsina (0,05%)-EDTA (0,1%) (4 ml para un matraz T75). Pasar el medio completo de las células a ser pasados ​​en un tubo cónico de 50 ml; este medio acondicionado se utiliza para apagar la tripsina. Asegúrese de que no se sequen las células. A continuación, añadir tripsina. </li><li> Se incuban las células en tripsina durante 5 min a TA, golpeando suavemente el matraz varias veces para ayudar desprendimiento celular. </li><li> Se inactiva la tripsina mediante la adición de 4-5 ml de medio condicionado al matraz con las células separadas. </li><li> Pasar el medio y las células con el mismo tubo de 50 ml cónico. Se centrifuga el medio y las células a 1.200 rpm (~300 xg) durante 5 min a TA. </li><li> Aspirar el sobrenadante, resuspender el sedimento celular, inclinando suavemente el tubo y, a continuación añadir medio fresco oligo + GF. Suavemente medio de la pipeta y las células arriba y abajo para realizar una suspensión celular uniforme. </li><li> Contar las células y 2.5e6 de transferencia en cada nueva PDL recubierto matraz T75. </li></ol> 3. Etapa Final en la diferenciación de oligodendrocitos <ol><li> Después de 3 semanas de cultivo en medio oligo + GF, cuando las células están en 70-80% de confluencia, inicie el proceso final de la diferenciación (Figura 1C). </li><li> Preparar el medio de la misma manera como el medio de oligo + GF pero sin añadir el GF cuatro: Shh, NT-3, bFGF y PDGF-AA. Este medio sin el GF cuatro se define como medio oligo - GF. </li><li> Aspirar el medio oligo + GF del matraz, se lava una vez con PBS y luego añadir un volumen total de 16 ml de medio, de los cuales ¾ (12 ml) es oligo medio - GF y ¼ (4 ml) es medio acondicionado PDN, por 6-10 Días). El uso de medio acondicionado de PDN no es crítica para el proceso de diferenciación o la supervivencia de las células. Hemos observado que, de hecho, sólo el contacto directo de las células con DOP con NEM en experimentos de co-cultivo tuvo un efecto sobre la duración de la supervivencia PDO. El tiempo de supervivencia medio en oligo - GF podría prolongarse a dos o tres semanas si las células PDO se co-cultivadas con células NEM. El protocolo para diferenciar las células progenitoras neurales en PDN se describe en una publicación anterior y no es parte de este protocolo 1. Crecimiento factor de retirada de los resultados del medio de cultivo en cultivo progresivamente diferenciadas de células con múltiples procesos (Figura 1D). </li></ol> 4. Ensayo de citometría de flujo El ensayo de citometría de flujo se compara la adquisición de marcadores de oligodendrocitos durante el proceso de diferenciación en relación con los de la población parental. <ol><li> Use pro neuralgenitores como control. Semillas DOP células en 2.5x10 6 células en dos matraces T75 recubiertos con poli-D-lisina en medio de oligo + GF. </li><li> Una semana más tarde, sustituir medio con medio fresco oligo + GF en matraces como un cultivo de control para la viabilidad celular, mientras que otros frascos tenía medio oligo - GF. </li><li> Para disociar células PDO en ambos medios utilizar 20 U / ml de papaína y tripsina no. Esto es debido a la papaína tiene un efecto suave con las células durante la disociación preservar la morfología celular. </li><li> Añadir 5 ml de solución salina equilibrada de Earle (EBSS) a un vial de papaína. Colocar el vial a 37 º C durante 10 min o hasta que la papaína está completamente disuelta y la solución aparece clara. Esta es la solución de papaína utilizado para disociar las células. </li><li> Añadir 0,5 ml de EBSS a una desoxirribonucleasa I (ADNasa) vial (Tabla 1). Mezclar suavemente. Añadir 0,25 ml de esta solución en el vial de la papaína disuelto. Esta preparación contiene una concentración final de aproximadamente 20 U / ml de papaína y 00.005% DNasa. </li><li> Place papaína solución (como se describió anteriormente) en las células y se incuba a 37 ° C durante 15-30 min; controlar el desprendimiento de las células utilizando un microscopio. Detener la reacción con 5 ml de medio con o sin GF y centrifugar a 1.200 rpm durante 7 min. </li><li> Transferir los sedimentos celulares de ambos matraces en dos diferentes tubos de 5 ml de polipropileno y lavar con medio fisiológico normal (NPM: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 10 mM Hepes y 10 mM de glucosa) suplementado con 1 mg / ml albúmina de suero bovino (BSA + NPM). </li><li> Realizar superficie inmunotinción a 4 º C durante 20 min utilizando anticuerpos primarios específicos y se titula apropiadamente para A2B5, O4, GalC (Tabla 2). </li><li> Lavar las células con NPM + BSA a 4 ° C durante 5 min y se incuban con anticuerpos secundarios específicos a 4 º C durante 20 min (Tabla 2). </li><li> Para la tinción de antígenos intracelulares incluyendo nestina, proteína ácida glial fibrilar (GFAP), clase III y serta;-tubulina y la proteína básica de la mielina (MBP) (Tabla 2), fijar las células en 2% de paraformaldehído (PFA) durante 20 min a TA y se permeabilizan con etanol frío al 70% durante 15 min a -20 ° C. </li><li> Lavar las células con PBS 1x y se incuban con anticuerpos secundarios específicos (Tabla 2). </li><li> Para discriminar entre las células intactas y los desechos subcelular durante el análisis de citometría de flujo, tinción de células con 4,6-diamidino-2-phenyllindole, dihidrocloruro (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY). </li><li> En la optimización del protocolo anterior, hemos realizado todos los experimentos de control adecuadas para confirmar la especificidad de cada inmunorreactivo. En resumen, para los anticuerpos marcados directamente, el control negativo apropiado era un anticuerpo conjugado directamente de la clase de inmunoglobulina mismo isotipo (o subclase) y conjugado con fluorocromo como el anticuerpo primario (es decir, el control de isotipo). Para inmunotinción indirecta de anticuerpos primarios, el adecuado control negativo wcomo el anticuerpo secundario conjugado con el fluorocromo de interés que específicamente la clase de inmunoglobulina (o subclase) de la máquina en la que se generó el anticuerpo primario. Cuando los anticuerpos primarios desde múltiples hosts (ratón, conejo, pollo) se utilizan conjuntamente, se utilizó el anticuerpo secundario dirigido el anticuerpo primario de cada host y cada anticuerpo secundario utilizado fue típicamente cruzada adsorbida contra las inmunoglobulinas de los otros anfitriones para minimizar cruzada acoger inmunorreactividad. Los controles positivos incluidos inmunotinción directa o indirecta de preparaciones de células se sabe que expresan los antígenos de interés usando ya sea inmunorreacciones directa o indirecta con los anticuerpos primarios específicos para estos antígenos. Los métodos de optimización más arriba se han llevado a cabo una vez por cada tipo de inmunotinción experimentos. Inmunorreacciones controles no reveló cruzada significativa epítopo inmunoreactividad entre los anticuerpos primarios y secundarios. Citometría de flujo se realizó en uniformementesuspendidas las células marcadas con fluorescencia utilizando un clasificador de células FACVantage SE (BD Biosciences, San Jose, CA) equipado con tres rayos láser, que proporcionan longitudes de onda de excitación sintonizados a 488 nm, 647 nm, y un amplio UV (351-364 nm) (Figura 2) . </li></ol> 5. Ensayo de inmunofluorescencia Nota: Para los experimentos de inmunofluorescencia, PDO se sembraron en medio oligo + GF o medio oligo - GF en 2.5e5 en placas de 6 pocillos recubiertas con PDL. Las células se fijan en 2% de PFA en diversos puntos temporales después de la retirada de factores de crecimiento. El anticuerpo mancha se realiza en placas de 6 pocillos de plástico en lugar de cubreobjetos de vidrio. <ol><li> Retire el medio y añadir el 2% PFA. Incubar durante 10 min a TA. Deseche PFA. Lavar las células 3 veces con PBS, 5 minutos cada vez. Tenga cuidado de no secar las células. </li><li> Permeabilizar las células para marcadores intracelulares utilizando 0,25% de solución de Triton en PBS durante 10 min a TA. </li><li> Para evitar que las células no específicas vinculantes, bloque fo 10 min con HHG (1 mM de tampón HEPES, 2% de suero de caballo, y 10% de suero de cabra en solución salina equilibrada de Hanks). Diluir específicos anticuerpos primarios (Tabla 2) para una concentración predeterminada en HHG. Coloque anticuerpos diluidos sobre las células. Incubar 1 hora a temperatura ambiente con agitación mecánica o a 4 º C durante la noche. </li><li> Lavar las células 3 veces con PBS, durante 5 min cada vez. Diluir anticuerpos secundarios apropiados (Tabla 2) junto con un fluorocromo a una concentración predeterminada en HHG. Coloque la mezcla diluida de anticuerpos secundarios en las células. Incubar 1 hora a temperatura ambiente en un agitador en la oscuridad. </li><li> Lavar las células 3 veces con PBS, durante 5 min cada vez. </li><li> Para evitar photobleaching añadir 10 l de prolongar oro con DAPI a las células y colocar un cubreobjetos de vidrio en la parte superior de ellos. Visualizar las células marcadas utilizando un microscopio de fluorescencia Axiovert 200M (Zeiss, Thornwood, NY) (Figura 3). </li></ol>

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No hay conflictos de interés declarado.

Este protocolo describe la forma de obtener los oligodendrocitos fetales a partir de células humanas primarias progenitoras neurales y caracterizar su fenotipo utilizando tanto la citometría de flujo y tinción de inmunofluorescencia. La expansión y el crecimiento de células progenitoras neurales fetales desde CNS ha sido muy bien descrita 1-4. Sin embargo, la obtención de suficientes oligodendrocitos humanos para la experimentación in vitro sigue siendo difícil, a pesar de que es posible ide...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Concentración final </td></tr><tr><td> DME / JAMONES F12 01:01 </td><td> Omega Científico </td><td> DM-251 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Albúmina bovina </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Calidad de Productos Biológicos </td><td> 120-098-031 </td><td> 50 ug / ml </td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Calidad de Productos Biológicos </td><td> 118-084-061 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> T3 </td><td> Sigma </td><td> T2877 </td><td> 3 nM </td></tr><tr><td> N2 Componentes </td><td> Gibco BRL </td><td> 17502 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> PeproTech Inc </td><td> 450-03 </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> Shh </td><td> R &amp; D System </td><td> 1314-SH/CF </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> PeproTech Inc </td><td> 100-18B </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> PDGF-AA </td><td> PeproTech Inc </td><td> 100-13A </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> PDL </td><td> Sigma </td><td> P6407 </td><td> 50 g / m </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Microscopía Electrónica de Ciencias </td><td> 15712 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Calidad de Productos Biológicos </td><td> 118-087-721 </td><td></td></tr><tr><td> Papaína </td><td> Worthington </td><td> LK003178 </td><td> 20 U / ml </td></tr><tr><td> DNasa viales </td><td> Worthington </td><td> LK003172 </td><td> 0,005% </td></tr><tr><td> EBSS </td><td> Worthington </td><td> LK003188 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongar Oro conDAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla 1. Reactivos. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Primaria Abs (todos a 1 mg / ml) </td><td></td><td> Especies Isotipo </td><td> Fuente </td><td> Secundaria Abs </td></tr><tr><td colspan="5"> Citometría de Flujo </td></tr><tr><td> A2B5-Biotina </td><td> Ratón </td><td> IgM </td><td> Regalo J. Nielson </td><td> Estreptavidina PETR, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4FITC </td><td> Ratón </td><td> IgM </td><td> Regalo de J. Nielson </td><td></td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> Ratón </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4 </td><td> Ratón </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GalC </td><td> Ratón </td><td> IgG 3 </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgG3-PE, Southern Biotech, AL </td></tr><tr><td> MBP </td><td> Pollo </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA </td></tr><tr><td> Nestin </td><td> Ratón </td><td> IgG 1 </td><td> Messam et al. 2000 28 </td><td> gαm IgG 1-PECy5, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Conejo </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA </td></tr><tr><td> βIII tubulina </td><td> Ratón </td><td> IgG 2 </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG-2 a PETR, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td colspan="6"> La inmunocitoquímica </td></tr><tr><td> βIII tubulina (1:1,500) </td><td> Ratón </td><td> IgG2a </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG2a-FITC, Invitrogen, CA (1:1,000) </td></tr><tr><td> GFAP (1:1,000) </td><td> Conejo </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-FITC, Jackson Immu, PA (1:500) </td></tr><tr><td> MBP (1:50) </td><td> Pollo </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA (1:100) </td></tr><tr><td> O4 (1:100) </td><td> Ratón </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA (1: 100) </td></tr><tr><td> GalC (1:10) </td><td> Conejo </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA (1:100) </td></tr></tbody></table> . Tabla 2 anticuerpos (Abs) utilizados para la citometría de flujo y ensayos de inmunocitoquímica conjugados de anticuerpos: PE, ficoeritrina; PETR, ficoeritrina Texas Red; AMCA, amino-metil-cumarina-acetato; Cy, cianina; FITC, isotiocianato de fluoresceína. Ig: inmunoglobulina. . AF: Alexa Fluor; gαm: de cabra anti-ratón; gαrb: de cabra anti-conejo; dαck: burro anti-pollo. </td></tr></tbody></table>

progenitor derivado de sistema de cultivo de oligodendrocitos de cerebro fetal humano

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

La diferenciación de los progenitores neurales humanas en tipos de células neuronales y gliales ofrece un modelo para estudiar y comparar la regulación molecular del desarrollo neural linaje celular. Expansión in vitro de células progenitoras neurales a partir de tejido del SNC fetal ha sido bien caracterizado. A pesar de la identificación y el aislamiento de células progenitoras gliales de adulto humano sub-cortical materia blanca y el desarrollo de diversas condiciones de cultivo para la diferenciación directa de progenitores neurales fetales en oligodendrocitos de mielina producir, adquirir suficientes oligodendrocitos humanos para la experimentación in vitro sigue siendo difícil. Diferenciación de galactocerebrósido + (GalC) y O4 + precursoras de oligodendrocitos o células progenitoras (OPC) a partir de células precursoras neurales ha informado mediante cerebro fetal segundo trimestre. Sin embargo, estas células no proliferan en ausencia de células de apoyo incluyendo los astrocitos y las neuronas, y se pierden rápidamente con el tiempo en cultivo. Persiste la necesidad de un sistema de cultivo para producir las células del linaje de oligodendrocitos adecuado para la experimentación in vitro. Cultura de oligodendrocitos humanos primarios podría, por ejemplo, ser un modelo útil para estudiar la patogénesis de la neurotrópicos agentes infecciosos como el virus de polioma humano, JCV, que in vivo infecta las células. Estas células cultivadas también podrían proporcionar modelos de otras enfermedades desmielinizantes del sistema nervioso central (SNC). Primario, humano fetal derivado del cerebro, las células progenitoras neurales multipotenciales proliferan in vitro, mientras que el mantenimiento de la capacidad de diferenciarse en neuronas (neuronas derivadas progenitor-, PDN) y astrocitos (derivado progenitor-astrocitos, PDA) Este estudio muestra que los progenitores neurales pueden ser inducidas para diferenciar a través de muchas de las etapas del desarrollo de linaje oligodendrocíticos (derivado progenitor-oligodendrocitos, PDO). Nosotros, las células progenitoras neurales en cultivo DMEM-F12 sin suero supcomplementado con factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), factor neurotrófico 3 (NT-3), N-2 y triyodotironina (T3). Las células cultivadas se someten a pasadas en células 2.5e6 por matraces de 75 cm aproximadamente cada siete días. Usando estas condiciones, la mayoría de las células en cultivo mantener una morfología caracterizada por pocos procesos y expresan marcadores de oligodendrocitos pre-células, tales como A2B5 y O 4-. Cuando eliminar los factores de crecimiento de cuatro (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) y añadir medio acondicionado de PDN, las células comienzan a adquirir más procesos y expresan marcadores específicos de diferenciación de oligodendrocitos, tales como GalC y de la mielina proteína básica (MBP). Se realizó la caracterización fenotípica mediante citometría de flujo multicolor para identificar marcadores únicos de oligodendrocitos.

Es muy importante para iniciar el proceso de diferenciación de un 70% -80% confluentes cultura neural de células progenitoras (Figura 1A). Muchas células morirán después de cambiar el medio de cultivo a partir de progenitor a medio oligo ya que incluye factores de crecimiento específicos. Esto indica que el crecimiento de las células progenitoras neurales no comprometidos a un fenotipo oligodendrocíticos no será soportado por el nuevo medio (Figura 1B). La incubación en medio oligo + GF...

Primario, fetales humanos derivado del cerebro, células progenitoras multipotenciales proliferan<em&gt; In vitro</em&gt; Mientras se mantiene la capacidad de diferenciarse en neuronas y astrocitos. Este trabajo muestra que los progenitores neurales pueden ser inducidas a diferenciarse a través de las etapas del linaje oligodendrocíticos por aire con factores de crecimiento seleccionados.

Progenitor derivado de sistema de cultivo de oligodendrocitos de cerebro fetal humano

La diferenciación de progenitores neurales humanos en tipos celulares neuronales y gliales ofrece un modelo para estudiar y comparar la regulación molecular del desarrollo del linaje celular neural. La expansión in vitro de progenitores neurales a partir de tejido del SNC fetal ha sido bien caracterizada. A pesar de la identificación y el aislamiento de progenitores gliales de la sustancia blanca subcortical humana adulta y del desarrollo de diversas condiciones de cultivo para dirigir la diferenciación de progenitores neurales fetales en oligodendrocitos productores de mielina, la obtención de suficientes oligodendrocitos humanos para la experimentación in vitro sigue siendo difícil. Se ha informado de la diferenciación de células precursoras o progenitoras de oligodendrocitos (OPC) Galactocerebrósido+ (GalC) y O4+ a partir de células precursoras neurales utilizando cerebro fetal del segundo trimestre. Sin embargo, estas células no proliferan en ausencia de células de soporte, incluidos los astrocitos y las neuronas, y se pierden rápidamente con el tiempo en el cultivo. Persiste la necesidad de un sistema de cultivo para producir células del linaje oligodendrocítico adecuadas para la experimentación in vitro. El cultivo de oligodendrocitos humanos primarios podría ser, por ejemplo, un modelo útil para estudiar la patogénesis de agentes infecciosos neurotrópicos como el poliovirus humano, JCV, que in vivo infecta a dichas células. Estas células cultivadas también podrían proporcionar modelos de otras enfermedades desmielinizantes del sistema nervioso central (SNC). Las células progenitoras neurales multipotenciales primarias, derivadas de cerebro fetal humano, proliferan in vitro manteniendo la capacidad de diferenciarse en neuronas (neuronas derivadas de progenitores, PDN) y astrocitos (astrocitos derivados de progenitores, PDA). Este estudio demuestra que los progenitores neurales pueden ser inducidos a diferenciarse a través de muchas de las etapas del desarrollo del linaje oligodendrocítico (oligodendrocitos derivados de progenitores, PDO). Cultivamos células progenitoras neurales en medio DMEM-F12 sin suero suplementado con factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), factor neurotrófico 3 (NT-3), N-2 y triyodotironina (T3). Las células cultivadas se pasan a razón de 2,5e6 células por matraces de 75 cm aproximadamente cada siete días. Bajo estas condiciones, la mayoría de las células en cultivo mantienen una morfología caracterizada por pocos procesos y expresan marcadores de células pre-oligodendrocitarias, tales como A2B5 y O-4. Cuando eliminamos los cuatro factores de crecimiento (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) y añadimos medio condicionado de PDN, las células comienzan a adquirir más procesos y expresan marcadores específicos de la diferenciación de oligodendrocitos, como GalC y la proteína básica de la mielina (MBP). Realizamos la caracterización fenotípica mediante citometría de flujo multicolor para identificar marcadores únicos de oligodendrocitos.

Este video demuestra un método para la diferenciación de células progenitoras neurales humanas primarias en oligodendrocitos. Primero, las células progenitoras neurales se cultivan en medio de progenitor hasta alcanzar una confluencia casi completa. Luego, el medio de progenitor se sustituye por medio de oligodendrocito, suplementado con los factores de crecimiento que promueven el proceso de diferenciación. A continuación, las células se cultivan y expanden durante tres semanas.El medio para oligodendrocitos suplementado con factores de crecimiento se sustituye entonces por medio para oligodendrocitos sin factores de crecimiento, y las células se cultivan durante seis a 10 días adicionales hasta que se observen cambios fenotípicos mediante microscopía. La diferenciación se confirma entonces mediante microscopía de inmunofluorescencia y citometría de flujo utilizando anticuerpos específicos para la línea de oligodendrocitos. En última instancia, los oligodendrocitos diferenciados con éxito pueden utilizarse para estudios in vitro de la biología de los oligodendrocitos y sus interacciones con agentes infecciosos como el poliomavirus humano, JCV.Una de las verdaderas ventajas de la técnica que hemos establecido en este laboratorio, en comparación con lo que ya existe en la literatura publicada, es que en nuestro sistema, los oligodendrocitos pueden cultivarse y diferenciarse sin necesidad de células de apoyo como astrocitos y neuronas. Otra ventaja de nuestro protocolo, según consideramos, es que permite cultivar un gran número de estos oligodendrocitos precursor que expresan marcadores como oh four, los cuales pueden crecer en cultivo de patógenos durante varias semanas hasta obtener poblaciones celulares numerosas, manteniendo al mismo tiempo su fenotipo. El resultado final de la diferenciación nos proporciona casi una población pura de oligodendrocitos.Primero tuvimos la idea de este método cuando leímos la extensa bibliografía sobre la diferenciación in vitro de oligodendrocitos en células de rata y mías. Asimismo, distintos investigadores estaban eliminando factores de crecimiento de cultivos específicos para completar la diferenciación celular. Esta técnica, siguiendo nuestro protocolo, será demostrada por Alexa Bandon, una estudiante universitaria en nuestro laboratorio aquí en el N-I-N-D-S.Como preparación para la diferenciación, cultive una población pluripotente de células progenitoras neuronales sobre frascos recubiertos con polilisina en medio basal neural, suplementado con BFGF y EGF, y deseche cualquier célula no utilizada. Después de 11 días, cuando el cultivo alcance aproximadamente entre un 70 y un 80 % de confluencia, inicie la diferenciación. Para ello, aspire el medio de progenitores de los frascos.Lave las células una vez con PBS y luego agregue 12 mililitros de medio con oligos y factores de crecimiento. Incube las células a 37 grados Celsius en un incubador con 5% de dióxido de carbono y humedad controlada. Después de una semana, las células restantes exhibirán una morfología bipolar estrecha.Una vez que las células diferenciadas alcancen al menos un 70% de confluencia, retire el medio y transfiéralo a un tubo cónico nuevo de 50 mililitros. Resérvelo para su uso posterior. A continuación, agregue rápidamente cuatro mililitros de tripsina al 0,05%, EDTA al 0,1% a las células e incúbelas durante cinco minutos a temperatura ambiente.Golpee suavemente el matraz varias veces para ayudar a la desprendimiento celular. Después de la incubación, detenga las tripsinas añadiendo cuatro a cinco mililitros del medio condicionado guardado al matraz. A continuación, transfiera el medio y las células de vuelta al tubo cónico de 50 mililitros.Luego, centrifugue el medio y las células a 310 RCF durante siete minutos a temperatura ambiente. Una vez finalizada la centrifugación, aspire el sobrenadante. Re suspenda el botón celular golpeando suavemente el tubo y luego agregue medio oligo fresco con factores de crecimiento.Pipetee suavemente el medio y las células hacia arriba y hacia abajo para obtener una suspensión celular uniforme. Cuente las células utilizando un hemocitómetro. A continuación, transfiera 2,5 millones de células a nuevos frascos T 75 recubiertos con poli-L-lisina y coloque el cultivo en el incubador; después de tres semanas, cuando las células alcancen una confluencia del 80 al 85%, aspire el medio oligo con factores de crecimiento del frasco.Lave una vez con PBS y luego agregue 12 mililitros de medio oligo sin factores de crecimiento y 4 mililitros de medio no acondicionado derivado de progenitores neuronales. Mantenga las células en este medio durante seis a 10 días en días alternos. Examine las células mediante microscopía de contraste de fases para evaluar la diferenciación y la confluencia, y reemplace al menos el 50 % del medio tras la retirada de los factores de crecimiento; las células desarrollarán progresivamente múltiples prolongaciones, lo que indica una diferenciación exitosa de las células en oligodendrocitos derivados de progenitores.En este momento, los oligodendrocitos derivados de progenitores pueden utilizarse para experimentos de citometría de flujo o inmunofluorescencia, tal como se describe en las próximas secciones de este video. El ensayo de citometría de flujo compara la adquisición de marcadores de oligodendrocitos durante el proceso de diferenciación en relación con los de su población parental. Se utilizan células progenitoras neurales humanas como controles C. 2,5 millones de células de oligodendrocitos derivadas de progenitores en cada uno de dos frascos T 75 recubiertos con poli-D-lisina en medio oligo con factores de crecimiento, incubador a 37 grados Celsius. Una semana después, reemplace el medio en un frasco con medio oligo fresco que contenga factores de crecimiento como control de viabilidad celular.Sustituya el medio en el segundo frasco por medio con oligo fresco sin factores de crecimiento. Cultive estas células hasta por 10 días; entre tres y nueve días después de la eliminación de los factores de crecimiento, las células comenzarán a adquirir más prolongaciones características de un fenotipo de oligodendrocito. Para disociar las células oligodendrocitos derivadas de progenitores, aspire el medio y agregue 5,25 mililitros de solución perian a cada frasco.Se utiliza perian en lugar de tripsina porque tiene un efecto más suave sobre las células durante la disociación. Para preservar la morfología celular, incubar a 37 grados Celsius durante 15 a 30 minutos. Compruebe periódicamente la disociación de las células utilizando un microscopio.Una vez que las células se hayan desprendido, añada cinco mililitros de medio con o sin factores de crecimiento para detener la reacción. A continuación, transfiera el contenido de cada matraz a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugue los tubos a 310 RCF durante siete minutos a temperatura ambiente. Tras la centrifugación, aspire el sobrenadante y resuspenda los pellet celulares en cuatro mililitros de medio fisiológico normal, suplementado con un miligramo por mililitro de albúmina sérica bovina o NPM más BSA.Luego cuente las células como antes, y a continuación, para cada condición de inmunomarcado, suspenda un millón de células en un tubo de polipropileno de cinco mililitros. Asegúrese de incluir todos los controles apropiados para confirmar la especificidad de cada reactivo inmunoquímico. A continuación, para realizar el inmunomarcado, primero se incuban las células con anticuerpos contra las proteínas de superficie A dos B 5, 0 4 y gal C. Luego se lavan las células para eliminar los anticuerpos primarios no unidos y se incuban con los anticuerpos secundarios marcados con fluorocromo apropiados.Luego, las células se lavan nuevamente para eliminar los anticuerpos secundarios. Fijadas con paraformaldehído al 2 % y permeabilizadas con etanol frío al 70 %, a continuación se tiñen para detectar proteínas intracelulares; las células se lavan y luego se incuban con anticuerpos contra nestina, proteína ácida fibrilar glial, tubulina beta clase III y proteína básica de la mielina. Después, se eliminan mediante lavado los anticuerpos primarios no unidos.Las células se incuban con los anticuerpos secundarios marcados con el fluorocromo adecuado. Finalmente, para discriminar entre células íntegras y restos subcelulares durante el análisis de citometría de flujo, las células se mantienen con cuatro seis DIA medino. Dos fenol Lind dihidrocloruro o dappy realizan citometría de flujo en un instrumento equipado con tres láseres, que proporcionan longitudes de onda de excitación ajustadas a 488 nanómetros, 647 nanómetros y una luz ultravioleta amplia. Como preparación para la microscopía de inmunofluorescencia, prepare seis recubiertos con poli-D-lisina.Placas de seis pocillos con 250.000 células de oligodendrocitos derivados de progenitores por pocillo. Se necesitan dos placas para cada punto temporal. Una se cultiva con factores de crecimiento y otra sin ellos cuando las células alcancen una confluencia del 70 al 80 %.Aspire el medio con factores de crecimiento de la placa. Enjuague una vez con PBS y luego agregue 12 mililitros de medio sin factores de crecimiento. Realice la tinción inmunológica a los cinco y nueve días posteriores a la retirada de los factores de crecimiento de la siguiente manera: primero, fije las células con PFA al 2% durante 10 minutos a temperatura ambiente.A continuación, deseche el PFA y lave las células tres veces con PBS durante cinco minutos cada vez. Luego trate las células con triton al 0,25 % y, para prevenir la unión no específica, bloquee las células con suero de caballo al 2 % y suero de cabra al 10 %. Después del bloqueo, incube las células con anticuerpos contra beta tres tubulina, G-F-A-P-M-V-P oh cuatro y gal C. Luego, lave los anticuerpos no unidos de las células e incube las células con los anticuerpos secundarios marcados con fluorocromo apropiados.Lave los anticuerpos secundarios no unidos de las células y luego evite el fotoblanqueamiento y la decoloración. Monte el núcleo. La cubreobjetos utilizando 10 microlitros de oro prolongado con dpi.Visualice las células marcadas utilizando un microscopio de fluorescencia con el conjunto de filtros adecuado para determinar si las células progenitoras neurales primarias humanas podrían diferenciarse en oligodendrocitos. Las células progenitoras neurales multipotentes se cultivaron según se describe en este video. Los cambios fenotípicos luego se monitorearon mediante citometría de flujo y microscopía de inmunofluorescencia.Como puede observarse aquí, la mayoría de los progenitores neuronales expresan el marcador de células madre neuroepiteliales nesting, mientras que solo pequeñas subpoblaciones expresan marcadores restrictivos de linaje, tales como el marcador de astrocitos GFAP, el marcador neuronal tubulina beta clase tres, o el marcador de oligodendrocitos oh cuatro. Cuando el medio de cultivo fue reemplazado por medio oligo más factores de crecimiento y las células fueron cultivadas durante una semana, se observó una disminución de la expresión de nesting y un aumento de la expresión de A dos B cinco después de dos semanas.La expresión de nesting disminuyó aún más, y la expresión del marcador de precursor neuroglial A dos B cinco aumentó; asimismo, la expresión de otro marcador de oligodendrocito, oh cuatro, también aumentó dos días después de la retirada del factor de crecimiento. La expresión de oh cuatro y la expresión de GAL C, un marcador tardío de oligodendrocito, aumentaron seis días después de la retirada del factor de crecimiento. La coexpresión de oh cuatro y gal C aumentó y fue comparable a la coexpresión de gal C y MBP.La tinción inmunológica con múltiples epítopos revela que el 72 % de las células en cultivo expresaron MBP. Se obtuvo evidencia adicional de la diferenciación de oligodendrocitos derivados de progenitores mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Dos días después de la retirada de los factores de crecimiento, se detectó la expresión de MVP mostrada en verde.Esto aumentó en el día cinco y aumentó aún más en el día nueve. Es evidente la localización de MVP en los oligodendrocitos diferenciados. En conjunto, estos datos indican que los cultivos de células progenitoras neurales fetales humanas utilizando el método descrito son capaces de proliferar in vitro manteniendo la capacidad de diferenciarse a través de las etapas de la linaje de oligodendrocitos.Tras el desarrollo de este protocolo, la técnica permite a los investigadores en los campos de la biología del desarrollo, la neurociencia y la virología investigar la biología del cerebro humano y las enfermedades que afectan al cerebro humano, y particularmente aquellas que resultan en enfermedades de la materia blanca.

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Investigación

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Neuroscience

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