Name: Neo-Islet Formación en el hígado de ratones diabéticos por Ayudante dependiente de transferencia adenoviral Gene mediada por vector (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 59 s
Description: Aprende a inducir neo-isletos hepáticos en ratones diabéticos mediante transferencia génica con vectores adenovirales asistente-dependientes. Este método normaliza la glucosa e insulina, ofreciendo una alternativa terapéutica viable a la trasplantación de islotes pancreáticos.

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Este trabajo fue apoyado por becas de los NIH R03: DK089061-01 (VKY); NIH: K08 DK068391 (VKY); Diabetes y Endocrinología del Centro de Investigación-(DERC - P30DK079638) en el Baylor College of Medicine, una subvención Pilot y viabilidad de el DERC (VKY), Juvenile Diabetes Research Foundation: Premio JDRF # 5-2006-134 (VKY).

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<li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li>
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<li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li>
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<li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+Cre%2FloxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li>
<li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li>
<li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li>
<li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li>
<li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

HDAds se han desarrollado para superar la debilidad de Anuncios de primera generación y de aprovechar para la aplicación de la terapia génica. Sin embargo, los desafíos técnicos permanecen. Por ejemplo, HDAD requiere HV para el envasado HDAD y amplificación vector no es tan eficiente como anuncios de primera generación. HV es una oferta de primera generación y la contaminación de compromiso HV la eficacia de la Hdad. Por lo tanto, la transfección altamente eficiente y las condiciones óptimas para cada paso en serie son críticos. Otro parámetro crítico para la producción del vector es la que el paso (P1-P4) se debe utilizar para el posterior paso 5 que se utiliza directamente como inóculo para células en suspensión. En nuestra experiencia, los mejores resultados se obtienen usando el pasaje por el cual se dramáticamente proporción HDAD vector aumentado en el paso siguiente (P3 en la figura 2). El rendimiento de los vectores HDAD depende de casetes de transgén. Durante la producción de vectores, ambos transgenes se expresan debido a que ambos genes se encuentran bajopromotor ubicuo. Ngn3 es un factor de transcripción y BTC es un factor de crecimiento, lo que sugiere que el vector que expresa HDAD factor de transcripción que pueden influir en el linaje celular inhibe la amplificación de vector mientras que la hormona del crecimiento ayuda a expresar en la replicación del vector y envasado. Con la diabetes adquiriendo proporciones epidémicas, nuevos enfoques para restaurar b masa de células se necesitan. En este informe, se describen los métodos para aprovechar las ventajas de los vectores HDAD para efectuar la transferencia de genes de islote linaje de definición de factor de transcripción, Ngn3 junto con el factor de crecimiento de los islotes, betacelulina para inducir la neogénesis de islotes en regiones periportal del hígado. Para evaluar la eficacia de esto, es importante elegir ratones con hiperglucemia estable y los controles adecuados se incluyen siempre. Para estos experimentos de transferencia de genes, el vector vacío ratones diabéticos tratados siempre debe ser utilizado. Además, el uso Hdad-Ngn3 y Hdad BTC-diabética tratada individualmente millasce sirve para probar la contribución individual de estos dos genes en la neogénesis de islotes. Como nuestros datos demuestran que Ngn3 por sí solo es suficiente para inducir la neogénesis de islotes, pero la adición del factor de crecimiento, BTC, sirve para aumentar la respuesta que conduce a la inducción robusto de neogénesis de islotes. También es importante comprobar que el vector de expresión se había alcanzado de hecho en el tejido diana, el hígado y también para demostrar que la insulina se ensaya en el plasma de los ratones tratados no viene de islotes residuales en el páncreas, por lo que demuestra la ausencia de páncreas islotes en los ratones diabéticos. En resumen, la ventaja del sistema HDAD-vector para la transferencia de genes reside en su capacidad de clonaje elevada, transducción eficiente y la expresión a largo gen duradera en el hígado con la mínima toxicidad crónica, así como su naturaleza de no integración del genoma del vector en el huésped cromosoma. Las limitaciones principales son los pasos complejos que intervienen en su generación y suaplicación in vivo está limitada principalmente al hígado con el serotipo Ad más popular 5. Islet neogénesis puede ser inducido para restaurar completamente la insulina en plasma y la tolerancia a la glucosa en ratones diabéticos mediante la inducción de la neogénesis de islotes en el hígado por la transferencia de genes de factor de transcripción Islet linaje que define, junto con Ngn3 el factor de crecimiento de los islotes, betacelulina. En este informe, se muestra el protocolo óptimo para generar calidad-Hdad Ngn3 y Hdad BTC-, y demostrar las técnicas para inducir y evaluar la neogénesis islote en el hígado de ratones diabéticos a reducir la hiperglucemia. Nota: Los vectores virales y las líneas celulares descritas aquí están disponibles en el Laboratorio de Producción Vector Core, Diabetes Research Center, Baylor College of Medicine ( <a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731</a> ). Algunos kits comerciales están también disponibles para la generación de virus HDAD (por ejemplo, Microbix biosystems Inc.).

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> ProFectionR kit de transfección de mamíferos </td><td> Promega </td><td> E1200 </td></tr><tr><td> Kit DNeasy Sangre y Tejidos (50) </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> Perfecta SYBR Green Supermix, ROX </td><td> Quanta Biosciences </td><td> 95055-500 </td></tr><tr><td> Desoxicolato de sodio </td><td> Sigma </td><td> D6750-25G </td></tr><tr><td> MEM polvo </td><td> Invitrogen </td><td> 61100087 </td></tr><tr><td> La penicilina estreptomicina </td><td> Sigma </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biológicos </td><td> S11150 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Higromicina B </td><td> Sigma </td><td> H0654-1G </td></tr><tr&gt; <td> EAGLE MEM Joklik </td><td> Sigma </td><td> M0518-10L </td></tr><tr><td> Rnase </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> DNasa I, grado II </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Estreptozocina </td><td> Sigma </td><td> s0130 </td></tr><tr><td> Vidrio frascos spinner </td><td> Corning </td><td> 4500-3L </td></tr><tr><td> Vidrio frascos spinner </td><td> Corning </td><td> 4500-250 </td></tr><tr><td> Deslice Lyzer A-casset </td><td> PIERCE CH </td><td> PI66380 </td></tr><tr><td> Tube Optiseal poli allomer, 11,2 ml </td><td> Beckman Coulter </td><td> 362181 </td></tr><tr><td> 1 kg de cloruro de cesio </td><td> JT4042-2 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman LE-80K </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optimal LE-80K ultracentrífuga </td></tr><tr><td> Filtrar </td><td> VWR </td><td> 28143-338 </td></tr><tr><td> tubo de centrífuga de 500 ml </td><td> Corning </td><td> 431123 </td></tr><tr><td> tailveiner restrainer </td><td> Braintree Scientific, Inc </td><td> tv-150 </td></tr><tr><td> La insulina, Mouse ELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td></tr><tr><td> microvette CB300 </td><td> Sarstedt </td><td> 16.443.100 </td></tr><tr><td> D-glucosa </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td></tr><tr><td> Ratón C-péptido ELISA Kit </td><td> Wako Pure Chemical Industries, Ltd </td><td> # 631-07231 </td></tr><tr><td> guinea pig anticuerpo anti-insulina </td><td> Abcam </td><td> ab7842 </td></tr><tr><td> de cabra anti-anticuerpo Pdx1 </td><td> regalo del doctor Christopher Wright </td><td></td></tr><tr><td> anticuerpo de ratón anti Ngn3 </td><td> Células Beta Consorcio de Biología, Univ. de Pennsylvania </td><td> AB2013 </td></tr><tr><td> anticuerpo de ratón anti Nkx6.1 </td><td> Células Beta Consorcio de Biología, Univ. de Pennsylvania </td><td> F64A6B4 </td></tr><tr><td> anticuerpo anti-betacelulina </td><td> Ciencias de la célula </td><td> PAAQ1 </td></tr><tr><td> ALT (SGPT) Color de reactivos. </td><td> Teco Diagnóstico </td><td> A526 - 120 </td></tr><tr><td> AST / (SGOT), punto final color de reactivos </td><td> Teco Diagnóstico </td><td> A561-120 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Reactivos y equipos específicos.

neo-islet formación en el hígado de ratones diabéticos por ayudante dependiente de transferencia adenoviral gene mediada por vector

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

La diabetes tipo 1 es causada por células T mediada por la destrucción autoinmune de las células productoras de insulina en el páncreas. Hasta ahora el reemplazo de insulina sigue siendo la terapia principal, porque el trasplante de islotes ha sido limitada por la disponibilidad de donantes y por la necesidad de inmunosupresión a largo plazo. Inducida neogénesis de islotes mediante la transferencia génica de Neuogenin3 (Ngn3), el islote de linaje definir factor de transcripción específico y betacelulina (BTC), un factor de crecimiento de islote tiene el potencial para curar la diabetes tipo 1. Los vectores adenovirales (Ads) son vectores de transferencia de genes altamente eficaz, sin embargo, los anuncios de los primeros generación tienen varias desventajas para uso in vivo. Dependientes de ayudante-Ads (HDAds) son los anuncios más avanzadas que se han desarrollado para mejorar el perfil de seguridad de la primera generación de anuncios y para prolongar la expresión del transgen 1. Carecen de toxicidad crónica por falta de codificación de secuencias virales 2-5 y conservar sólo el anuncio cisENTOS necesarias para la replicación del vector y envasado. Esto permite la clonación de genes hasta 36 kb. En este protocolo, se describe el método para generar HDAD-Ngn3 y Hdad BTC-y para entregar estos vectores en ratones diabéticos STZ inducido. Nuestros resultados muestran que la inyección conjunta de HDAD-Ngn3 y &#39;islotes Neo&#39; HDAD-BTC induce en el hígado y se invierte la hiperglucemia en ratones diabéticos.

Se describe hepática neo-islote formación en STZ (estreptozotocina)-ratones diabéticos inducidos por la transferencia de genes de Neurogenin3 (Ngn3) y betacelulina (BTC) usando ayudante dependiente de vector adenoviral (HDAD) y la inversión de la hiperglucemia. Nuestro método tiene ventajas de dependientes helper-vectores adenovirales con su alta eficiencia en la transducción in vivo y la expresión génica a largo duradera.

Neo-Islet Formación en el hígado de ratones diabéticos por Ayudante dependiente de transferencia adenoviral Gene mediada por vector

La diabetes tipo 1 es causada por la destrucción autoinmune mediada por células T de las células productoras de insulina en el páncreas. Hasta ahora, la reposición de insulina sigue siendo la ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en inducir neoislets en el hígado de ratones diabéticos mediante transferencia génica mediada por vectores adenovirales dependientes de ayudante. Esto se logra generando vectores adenovirales dependientes de ayudante que portan el factor de transcripción de islets neurogenina 3 y el factor de crecimiento de islets betacellina, con el fin de inducir la formación de neoislets periporales en el hígado; los vectores se inyectan luego en ratones diabéticos. A continuación, se evalúa en los ratones diabéticos tratados la normalización de la glucosa sanguínea, la insulina plasmática y la presencia de células beta productoras de insulina en el hígado.Los resultados de estos ensayos demuestran que la hiperglucemia se revierte en ratones tratados con el vector como consecuencia de la formación de neoestructuras palpebrales en las regiones periportales del hígado. La ventaja del vector adenoviral dependiente de herpa es su amplio tropismo y su alta capacidad crónica. Además, el vector adenoviral dependiente de herpa no contiene ninguna región codificante de avir.Por eso carece de toxicidad crónica. La implicación de esta técnica se extiende a la terapia de la diabetes, ya que la inducción de nuevos islotes es una alternativa eficaz al trasplante de islotes, que se ve limitado por la escasez de donantes, el fracaso del injerto y la inmunidad aloinmune. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el proceso de transfección es complicado debido al gran tamaño del vector compañero de clase.Y para minimizar la contaminación por virus en el hospedero, el proceso de amplificación y purificación debe manejarse con cuidado. La producción de vectores adenovirales dependientes de un virus auxiliar implica múltiples pasos que deben seguirse cuidadosamente para obtener resultados óptimos. Como preparación para la siembra previa a la transfección, siembre 800,001 células 16 en cada uno de dos platos de seis centímetros.Incubar a 37 grados Celsius, 5% dióxido de carbono. Después de dos días, las células tendrán una confluencia del 70 al 80% para la transfección. El día de la transfección.Sustituya el medio de crecimiento por cinco mililitros de medio fresco e incube las células durante tres horas. Luego, utilizando el kit de transfección mamífera Pro Perfection Arm de Promega Transfect, transfecte las células 16 con 10 microgramos de ADN que codifica la neurogenina 3, denominada en lo sucesivo 3, o una célula beta, denominada en lo sucesivo BTC. Al día siguiente, lave las células dos veces con un mililitro de medio de crecimiento cada vez.Añada el virus auxiliar a 500 partículas vectoriales por célula en 0,1 mililitros de PBS con calcio y magnesio. Luego coloque las células en el incubador cada 10 minutos. Agite suavemente las placas para distribuir uniformemente el virus auxiliar.Después de 60 minutos, agregue 1,5 mililitros de medio de mantenimiento y devuelva los cultivos a la incubadora durante 24 horas. Al día siguiente, agregue otro mililitro de medio de mantenimiento. Luego, utilizando un microscopio óptico estándar, examine las células para evaluar los efectos citopáticos.Las células infectadas se volverán redondeadas y se desprenderán. Continúe incubando las células infectadas hasta el día dos. En este punto, más del 80 % de las células deben mostrar efectos citopáticos.Recolecte el lisado viral crudo pipeteando hacia arriba y hacia abajo, y transfiéralo a un tubo de cinco mililitros destinado al lisado viral crudo. Añada un 10% en volumen de sacarosa al 40%. Etiquete este tubo como CVL para el paso cero del lisado viral crudo a piojos.Para liberar partículas virales, congele y descongele tres veces el tubo que contiene el lisado viral crudo alternando su colocación en un congelador a menos 80 y en un baño de agua a 37 grados Celsius. Después del tercer ciclo de congelación-descongelación, utilice el medio para amplificar aún más el vector según se describe en el texto adjunto. El proceso de amplificación del vector producirá un lisado viral crudo del pase cinco o P cinco del vector.Para la producción a gran escala de adenovirus dependientes del auxiliar, comience descongelando y volviendo a congelar tres veces la P cinco del procedimiento de amplificación del vector, tal como se hizo anteriormente durante el proceso de congelación y descongelación. Transfiera una cantidad de 16 células de un matraz agitador de tres litros a botellas cónicas de 500 mililitros y centrifúgelas a 1000 veces G durante cinco minutos. Después de la centrifugación, retire todo el sobrenadante excepto 100 mililitros.Luego, resuspenda las células y transfiéralas a un matraz agitador de 250 mililitros con las células resuspendidas. Añada todo el lisado viral crudo P5. A continuación, añada el virus auxiliar a 200 partículas virales por célula e incube durante una hora a 37 grados Celsius a 60 RPM.Tras la incubación, transfiera un mililitro de la suspensión celular a un pocillo de una placa de 12 pocillos. Transfiera el resto de la suspensión celular a un matraz agitador nuevo de tres litros y agregue dos litros de medio de crecimiento en suspensión. Incube tanto el matraz como la placa durante dos días en una incubadora de dióxido de carbono a 60 RPM. Durante los próximos dos días, supervise las células en la placa en busca de efectos citopáticos.Si las células en la placa muestran efectos citopáticos, las células en el matraz agitador también presentan efectos citopáticos. Después de la incubación, recopile las células mediante centrifugación y resuspenda con 15 mililitros de tris 100 milimolar HCl en un tubo de 50 mililitros etiquetado como P seis.Almacene este tubo a menos 80 grados Celsius hasta la purificación. Para purificar el vector, añada un mililitro de desoxicolato de sodio al 5 % al tubo descongelado que contiene el lisado viral crudo P seis. Mezcle suavemente e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.Luego, agregue cloruro de magnesio, ARN A y ADN 1, e incube a 37 grados Celsius durante una hora. Tras la incubación, centrifugue el tubo a 6.000 × g durante 10 minutos. Después de la centrifugación, recoja el sobrenadante en un nuevo tubo de 50 mililitros y transfiéralo a un tubo de ultracentrífuga NVT 65 esterilizado. Agregue 2,8 mililitros de una solución de cloruro de cesio de baja densidad de 1,25 gramos por mililitro.Luego, utilizando una pipeta de dos mililitros, subyacer 2,8 mililitros de una solución de cloruro de CM de alta densidad de 1,41 gramos por mililitro en el tubo, tocando el fondo del tubo con la pipeta y liberando lentamente la solución. A continuación, utilizando una pipeta de dos mililitros, superponer de cinco a seis mililitros del sobrenadante. Al tocar la pared lateral del tubo y liberar lentamente la solución, el tubo debe llenarse hasta el cuello.De lo contrario, podría colapsarse durante la centrifugación a alta velocidad. Use tris HCl 100 milimolar para llenar el tubo hasta el final si es necesario. Luego, centrifugue a 10 grados Celsius durante 30 minutos a 237.000 veces G a 10 grados Celsius.Después de la ultracentrifugación en gradiente de densidad, se observa una única banda opalescente de vector por debajo del sedimento opaco de restos celulares. A veces puede verse una banda de ayuda muy tenue por debajo de la banda de vector más prominente. Limpie el tubo en la banda opalescente inferior con etanol al 70 %.Luego, utilizando una jeringa de tres mililitros equipada con una aguja de calibre 22, punzar la pared del tubo en la base de la banda del vector y recolectar la banda opalescente inferior. Transferir el material del vector recolectado a nuevos tubos esterilizados para ultracentrífuga y, a continuación, superponer solución de cloruro de cesio a una densidad de 1,35 gramos por mililitro para llenar los tubos hasta el cuello.Centrifugar a 10 grados Celsius a 237.000 × g durante la noche. Después de la segunda gradiente de densidad, recoger la banda opalescente mediante ultracentrifugación como antes. Transferir la banda a una cinta de diálisis y dializar frente a tres litros de T tris estéril, HCl que contiene cloruro de magnesio y sacarosa, a cuatro grados Celsius durante la noche; realizar el procedimiento al día siguiente.Para eliminar el vector adenoviral dependiente del auxiliar del casete de diálisis, utilice una jeringa de tres mililitros para inyectar dos mililitros de aire en el casete desde la esquina superior. Gire el casete de modo que la jeringa y la aguja queden en la esquina inferior y, manteniendo el casete en posición vertical, aspire la solución hacia la jeringa. Transfiera la solución, que ahora contiene el virus purificado, a tubos criogénicos etiquetados.Aliquotar 20 microlitros para la titulación física y 50 microlitros para la caracterización del ADN en tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros y luego congelar. Los tubos criogénicos contienen el virus purificado a menos 80. A continuación, el virus purificado debe evaluarse para determinar una mayor pureza y eficacia in vitro.Como se describe en el documento adjunto, se utiliza estreptozotocina para inducir diabetes. En este estudio, como se describe en el documento adjunto, monitoree semanalmente a los ratones tratados con estreptozotocina para detectar hiperglucemia. Una vez que la glucosa en sangre se encuentre entre 250 y 500 miligramos por decilitro durante 48 horas, coloque los ratones en el sujetador de cola para realizar una inyección en la vena de la cola.Coloque la cola en un tubo de 50 mililitros que contenga agua tibia para dilatar las venas de la cola. Luego limpie la cola con un tejido empapado en etanol al 70 %. Cargue una jeringa de un mililitro con una aguja de calibre 30 y medio con la concentración adecuada del vector y verifique que no haya burbujas en la jeringa.Luego, con el pulgar y el índice, sujete la cola por debajo del sitio de inyección e inserte la aguja en la vena de la cola. Si la aguja está dentro de la vena, puede observarse un destello de sangre en la base de la aguja. Inyecte el vector lentamente.Si la aguja está colocada adecuadamente, no habrá resistencia durante la inyección tras la administración. Retire la aguja y presione el sitio de inyección con gasa para detener cualquier sangrado antes de devolver el ratón a la jaula. Después del tratamiento con el vector, controle semanalmente la glucosa en ayunas de seis horas y el peso corporal, y controle los niveles de insulina y enzimas hepáticas cada dos semanas.Realice una prueba de tolerancia a la glucosa a las seis semanas posteriores al tratamiento para comprobar si la secreción de insulina estimulada por glucosa se restablece in vivo a las tres y seis semanas después del tratamiento. Extraiga el hígado y el páncreas de los ratones para analizar el MNA tisular y realizar tinción inmunohistoquímica con el fin de evaluar si puede inducirse la neogénesis de islotes en el hígado de ratones diabéticos mediante transferencia génica mediada por vector adenoviral. Los vectores de adenovirus dependientes de ayuda o H-D-A-D-N-G-N tres y los vectores BTC se prepararon y purificaron según se describe en este video, y luego se administraron a ratones diabéticos inducidos con estreptozotocina mediante inyección en la vena de la cola.Los vectores vacíos y los vectores H-D-A-D-B-T-C solos sirvieron como controles negativos. Luego, la glucosa sanguínea se monitoreó cada dos días durante siete a 10 días posteriores a la inyección. La hiperglucemia se revirtió en los ratones inyectados con HDAD y GN tres y H-D-A-D-B-T-C, pero no en los ratones de control.La secreción de insulina estimulada por glucosa también se monitoreó mediante una prueba de tolerancia a la glucosa realizada seis semanas después del tratamiento, como se observa aquí. La secreción de insulina se restableció en los ratones inyectados con HDAD y GN tres y H-D-A-D-B-T-C para evaluar si la insulina fue sintetizada en el hígado. El contenido de péptido C e insulina se analizó en el hígado.Las concentraciones de péptido C y el contenido total de insulina se midieron utilizando un kit comercial de ELIZA. La presencia de péptido e insulina en proporciones molares confirma que la insulina detectada en el hígado efectivamente se está sintetizando en dicho órgano. La inmunohistoquímica mostró células positivas en el hígado de ratones tratados con HDAD, NGN tres y H-D-A-D-B-T-C, pero no en ratones tratados con el vector control. La tinción inmunológica también demostró que no había islotes residuales en el páncreas de los ratones tratados con NGN tres BTC.La expresión del factor de transcripción específico de la línea celular del párpado también se evaluó mediante tinción inmunológica del hígado. Como se muestra aquí, NGN tres se expresó en el hígado de los ratones tratados con NGN tres BTC, pero no en los ratones tratados con el vector vacío.Asimismo, BTC se expresó a un nivel más alto en el hígado de los ratones tratados con NGN tres BTC en comparación con el observado tras el tratamiento con el vector vacío, como se muestra aquí. La tinción inmunológica con P DX uno reveló una localización nuclear en los hígados tratados con NGN tres BTC, pero no en los hígados de ratones tratados con el vector vacío. NK X 6.1 también se detectó únicamente en los hígados de ratones tratados con NGN tres BTC.En conjunto, estos resultados sugieren una inducción exitosa de la formación de párpados neo en el hígado de ratón. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar vectores adenovirales dependientes de ayuda para transferir genes determinantes de la línea celular del párpado al hígado con el fin de inducir la neogénesis del ojo. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres semanas si se lleva a cabo correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el virus auxiliar es un avir de primera generación que nos ayuda. La contaminación debe mantenerse al mínimo para aplicaciones in vivo.

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El trasplante de islotes aislados se ha propuesto ser un tratamiento potencial para la diabetes tipo 1. Aquí se describe un método para aislar los islotes de páncreas de ratón y trasplantarlas en el espacio subcapsular del riñón.

Un método para el aislamiento de los islotes murinos y Trasplante Renal subcapsular

Este protocolo permite a uno identificar los factores que modulan la masa funcional de las células beta para encontrar posibles dianas terapéuticas para el tratamiento de la diabetes. El protocolo consiste en un método simplificado para evaluar la replicación de islotes y la función de las células beta en los islotes de rata aislados siguientes manipulación de la expresión génica con adenovirus.

La evaluación de la replicación y la función celular beta en Adenovirally transducidas aislados islotes de roedores

Proporcionamos un método reproducible para inducir la diabetes tipo 1 (DM1) en ratones dentro de dos semanas por la transferencia adoptiva de células del islote T específicas de antígeno, células CD4 + primarias.

Tipo 1 Diabetes inducción acelerada en ratones por transferencia adoptiva de células CD4 + células T diabetogénico

Presentamos aquí un protocolo para el aislamiento de islotes del modelo de ratón de diabetes tipo 2, Leprdb y detalles de un ensayo de células vivas para la medición de la secreción de insulina de islotes intactos que utiliza microscopía de 2 fotones.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modelo de ratón de la Diabetes Tipo 2: El aislamiento de los islotes pancreáticos y células en Vivo 2-Photon imágenes de islotes intactos

Este protocolo demuestra el aislamiento de los islotes murinos y la siembra en un andamio decelularizado. Los islotes soportados por el andamio fueron trasplantados en la almohadilla de grasa epididimal de ratones diabéticos inducidos por estreptozotocina (STZ). Los islotes sobrevivieron en el sitio del trasplante e invirtieron la condición hiperglucémica.

Transplante de islotes en el cojín de grasa epididimal de ratones diabéticos

Se introduce un método para el trasplante omental de islotes en un ratón. Los islotes aislados se mezclan con hidrogel y la mezcla se coloca en la bolsa omental de un ratón diabético. Luego, se controla la glucosa en la sangre, y se realiza el análisis inmuno-histoquímico.

Un método para el trasplante de islotes pancreáticos para el epiplón en ratón

Aquí, presentamos un protocolo para la modulación de la expresión transgénica mediante interruptor gen singular de pEUI(+) tratamiento de tebufenozide.

Un ecdisona basada en Receptor Singular gen interruptor para deliberada expresión del transgén con robustez, reversibilidad y filtración insignificante

Trasplante de islotes pancreáticos es una manera de lograr normoglycemia en diabetes tipo 1. Este artículo se centra en la técnica de trasplante vía intraportal para mantener niveles normales de glucosa en ratones diabéticos.

Intraportal trasplante de islotes pancreáticos en modelo murino

Se presenta un protocolo para crear pseudoislotes humanos modificados genéticamente a partir de células de islotes humanos dispersas que son transducidas por lentivirus que transportan ARN de horquilla corta (ARN de shRNA). Este protocolo utiliza enzimas y vasos de cultivo fácilmente disponibles, se puede realizar fácilmente y produce pseudoislotes humanos modificados genéticamente adecuados para estudios funcionales y morfológicos.

Silenciamiento de genes mediado por Lentiviral en pseudoislet humano preparado en placas de baja fijación

Este protocolo describe un método sencillo y mínimamente invasivo para trasplantar e imágenes de células NIT-1 en ratones inmunodeficientes combinados diabéticos no obesos (NOD) graves desafiados con esplenocitos purificados de ratones NOD espontáneamente diabéticos.

Monitorización bioluminiscente de la supervivencia del injerto en un modelo de transferencia adoptiva de diabetes autoinmune en ratones

Proporcionamos un protocolo mínimamente invasivo para el trasplante intramuscular de islotes de células madre pancreáticas derivadas de células madre humanas en ratones inmunodeficientes, para implantación in vivo y análisis posteriores.

Trasplante intramuscular de células endocrinas pancreáticas derivadas de células madre pluripotentes humanas en ratones

Aprende a inducir neo-isletos hepáticos en ratones diabéticos mediante transferencia génica con vectores adenovirales asistente-dependientes. Este método normaliza la glucosa e insulina, ofreciendo una alternativa terapéutica viable a la trasplantación de islotes pancreáticos.

Neo-Islet Formación en el hígado de ratones diabéticos por Ayudante dependiente de transferencia adenoviral Gene mediada por vector (Video) | JoVE Journal

Neo-Islet Formación en el hígado de ratones diabéticos por Ayudante dependiente de transferencia adenoviral Gene mediada por vector

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