Name: Fabricación y uso de Piggy-back Multibarrel Electrodos para En vivo Manipulaciones farmacológicas de las respuestas neuronales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Aprende a fabricar electrodos multicanal piggy-back para aplicar fármacos mediante iontoforesis durante registros neuronales in vivo. Este método permite manipular circuitos neuronales con precisión en tiempo real.

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<ol><li> Tire de los electrodos de vidrio Tire de los electrodos de vidrio <ol><li> Tire electrodo solo barril. El uso de vidrio solo barril capilar con filamento y tire de la punta de un diámetro de aproximadamente 1-2 micrómetros, longitud de eje de 10-12 mm, y la resistencia de electrodo correspondiente de aproximadamente 12 MOhm (rango 5-20 MOhms) según se mide en 0,9% de solución de NaCl. Más bajas resistencias de electrodo tendría como resultado más actividad de fondo y por lo tanto más dificultad en el aislamiento de la actividad unitaria de las neuronas individuales. Para extraer este electrodo, utilizar horizontal o vertical con un extractor de filamentos que se calientan ya sea o bobinas de calentamiento. </li><li> Tire electrodo multibarrel. Debido al diámetro mucho más grande de vidrio multibarrel y la necesidad de una distribución uniforme del calor alrededor de la multibarrel todo, un extractor de gran alcance con una bobina de calefacción diámetro más grande, no es un filamento de calefacción, que se necesita. Una pipeta multibarrel tiene que ser insertado en el centro del filamento de calefacción con no ponerse en contacto a la bobina de calentamiento. Tenga en cuenta que además de las pipetas 5-barril descrito aquí, pipetas 3-barril o barril 7-son alternativas comercialmente disponibles. Tire de vidrio a una punta de pipeta de aproximadamente 10 micrómetros de diámetro total, o menos. La punta se romperá al diámetro correcto en la siguiente etapa, por lo que el tamaño de la punta exacta es menos crítico durante la operación de extracción de la forma general de la punta del electrodo, que debe ser relativamente largo y delgado. Se refieren a la imagen en la Figura 1C para la forma electrodo de punta deseado. Formas de electrodos cortas y gruesas (Figura 1B) hará que una cantidad sustancial de daño en el tejido cuando está avanzado en el cerebro, mientras que las formas de los electrodos muy largos y delgados (Figura 1A) se dobla y por lo tanto será más difícil de romper la punta del electrodo a la correcta diámetro (véase el paso 2). </li></ol></li><li> Modificar puntas de los electrodos Modificar puntas de los electrodos. Antes de que los dos electrodos se pueden pegar juntos, Tienen que ser modificados. El eje del electrodo solo necesita ser doblado antes de que pueda estar unido a la multibarrel para asegurarse de que el eje combinado del acabado de lengüeta electrodo es lo más fina posible. Además, la punta del electrodo multibarrel tiene que ser interrumpido con el fin de asegurar una baja resistencia para iontoforesis. <ol><li> Doble árbol de un electrodo solo barril de unos 20 grados. Use la menor llama del quemador Bunsen posible. Típicos &quot;pequeñas&quot; mecheros Bunsen estándar de las compañías de suministro de laboratorio crear tamaños de llama que son demasiado grandes para esta aplicación. Para sortear este problema utilice la menor quemador Bunsen comercial y garantizar una aguja de jeringa (~ 18 gauge) a la parte superior del quemador, y sellar la conexión con cemento dental. Cuando funciona, la llama debe ser difícil de ver, sobre 5 mm o menos de diámetro, y aproximadamente 8 mm de altura. Cualquier movimiento del aire en la habitación se apaga la llama, así que es una buena idea para hacer funcionar el quemador en unahabitación cerrada, o usar escudos de viento. Mueva el electrodo solo barril a través de la llama de doblarla por cerca de 20 grados. Tender a que la llama del quemador fundir el vidrio en la zona de transición en alrededor de 10 milímetros de distancia de la punta del electrodo. Para evitar la fusión de la punta del electrodo, se aconseja que el electrodo se mantiene a aproximadamente 45 grados, la punta señalando hacia abajo, y mover el electrodo a través de la llama de forma relativamente rápida. </li><li> Rompa la punta del electrodo multibarrel. Para asegurar un control visual ya romper la punta del electrodo, use un microscopio con un objetivo mínimo de 10x y 10x oculares. Una escala de medición insertado en el ocular también se necesita para medir tamaños de boquilla. Coloque una pieza de plexiglás para el microscopio de tal manera que el extremo de la plexiglás se puede ver en alrededor de un tercio a la mitad del campo de visión del microscopio. En nuestro caso, la pieza de plexiglás es de aproximadamente 25 x 70 mm y 5 mm de espesor y unido mediante un tornillo que puede fijarse en una costumbrehizo hilo en la platina del microscopio. Es importante tener un diseño que permite el movimiento independiente de plexiglás de la diapositiva. Coloque el electrodo multibarrel en una cama de plastilina sobre un portaobjetos de vidrio, e insertar la diapositiva que contiene el electrodo en la fase de soporte de diapositivas microscopio. Usando manipuladores xy la platina del microscopio, la mueva suavemente la punta del electrodo contra la pieza de plexiglás y observe la rotura de la punta a través de los oculares del microscopio. Tratar de romper limpiamente la punta multibarrel a un diámetro acumulativo de unos 25-35 micrómetros. Deseche las pipetas con diámetros de punta que se desprendieron demasiado grande, o consejos con pausas irregulares. Descartamos aproximadamente el 30% de nuestros electrodos multibarrel debido a formas de las puntas indeseables. </li></ol></li><li> Ensamble Piggy-back Electrodo Ensamble piggy-back electrodo. <ol><li> Posición electrodos. Retire la pieza de plexiglás utilizado en el paso 2.2 de la platina del microscopio. Asegure terminadomultibarrel electrodo en plastilina sobre un portaobjetos de vidrio, punta apuntando ligeramente hacia arriba. Apuntando hacia arriba será importante para el paso 3,2, el encolado de los dos electrodos. Consejos que apuntan a que el pegamento para huir de la punta, evitando pegar las puntas de los electrodos. Insertar electrodo doblado solo barril en el porta electrodo del micromanipulador hecho a medida (Figura 2). Usando la guía visual primero y luego la orientación microscópico, baje el electrodo solo barril en el electrodo multibarrel. El único electrodo debería reducirse directamente en la ranura que está formada por la disposición de los 5 barriles, con su punta que sobresale de la punta de la punta multibarrel por aproximadamente 5-10 micrómetros. Al bajar el barril, supervisar de cerca al ángulo que se forma entre los dos electrodos. Para obtener el mejor resultado evitar cualquier ángulo en el que las puntas punto de diferencia el uno del otro, sino que intentan reducir el electrodo único en el multi perfectamente paralelo o incluso con su puntatocando el multibarrel primera, formando un arreglo muy leve &quot;cuña&quot;. Desde la punta de cilindro único es muy flexible, se dobla cuando el único electrodo se baja un poco más después de que la punta ha alcanzado la superficie superior del electrodo de barril múltiples, formando una punta limpia compuesto que tiene una pequeña cantidad de la acción del muelle construido en que ayuda a la celebración de las puntas juntas. Sin embargo, si el ángulo entre el cañón y el electrodo único multibarrel es demasiado empinada (demasiado de una cuña), la acción de resorte será demasiado alta y doblar hacia abajo la disposición de electrodos. </li><li> Pegue los electrodos ejes juntos. Pegue los ejes de los dos electrodos junto con cianocrilato (pegamento). Colocar una pequeña gota de pegamento en el lado pequeño de un palillo plano y montaje de electrodos contacto con la gota de pegamento. Comience en la posición más distal de las extremidades y mueva lentamente palillo con la gota de pegamento a lo largo de los ejes de los electrodos hacia las puntas de los electrodos. El uso de pegamento en exceso, o aplicar pegamento too para cerrar las puntas de los electrodos se traducirá en el pegado de las aberturas de los electrodos, haciendo que el electrodo al menos parcialmente no funcional. </li><li> Estabilizar conjunta con cemento dental. Mezclar una pequeña cantidad de cemento dental y acrílico dental en un pequeño plato de plástico desechable o pesan barco, utilizando un palillo de dientes plana. Esperar hasta que el cemento se vuelve moldeable y aplicar una pequeña cantidad de la junta entre los dos electrodos para estabilizar la articulación (material de color rosa en la Figura 3). Deje aproximadamente 15 min para secar. </li><li> Quite y guarde los electrodos. Retire con cuidado el terminado piggy-back primer electrodo del titular micromanipulador, y luego desprenderse del portaobjetos de vidrio, y guárdelo en un recipiente a prueba de polvo. </li></ol></li><li> Preparar Soluciones Electrodos de relleno Preparar soluciones electrodo de relleno. Desde iontoforesis requiere moléculas cargadas, la mayoría de los agentes tienen que ser disuelto ya sea en un ambiente ácido o alcalino (típicamente unta pH de aproximadamente 3-4, o un pH de aproximadamente 8-10, respectivamente). Un número de sustancias químicas que se utilizan a menudo en la iontoforesis se enumeran en la Tabla 1. Para los agentes que no figuran en la tabla, determinar a partir del valor de pKa, si sería más fácil de usar la molécula de un ácido o en un medio alcalino para mantener la molécula cargada, y se disuelven en consecuencia. Para obtener los mejores resultados, mezcle todas las soluciones frescas todos los días. </li><li> Rellenar y preparar electrodos Rellenar y preparar electrodos. Justo antes de utilizar el electrodo, de vuelta a llenar cada barril con su respectivo medicamento, el uso de fibra de carbono 28 a 34 agujas de calibre unidas a jeringas con filtros de jeringa. Rellene los 4 barriles exteriores de la configuración de 5 cañón con los fármacos de elección, y el barril centro con NaCl 3M como un barril de equilibrio. Llenar el electrodo barril sola grabación con NaCl 3M también. Adición de un colorante a la solución de NaCl, tal como rojo o verde rápido fenol hará que sea más fácil ver la punta del electrododurante la colocación del electrodo sobre la superficie del cerebro. Insertar el electrodo en el soporte del electrodo de la configuración de la grabación e insertar todos los cables en los barriles de vidrio apropiados. Use cable aislado de plata de la que alrededor de 1 cm de aislamiento se ha eliminado en la punta. No debe haber cables 5 para el electrodo de multibarrel (4 barriles de drogas y un barril de equilibrio), más el alambre amplificador que debe ser insertado en el electrodo de registro solo barril. </li><li> Encienda módulos de bomba Iontoforesis Encienda módulos de bomba iontoforesis y probar todos los barriles. La función de prueba de electrodo de cada módulo de la bomba le ayudará a determinar si el barril electrodo es funcional. Para impedir la fuga de los fármacos de los barriles cuando no está en uso, una tensión de retención en la polaridad opuesta, como la molécula de carga necesita ser aplicada. </li></ol>

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No hay conflictos de interés declarado.

Se describe una técnica que permite la manipulación de un microcircuito de una sola neurona en vivo, mientras que al mismo tiempo que permite la grabación de las respuestas de las neuronas durante la manipulación experimental. Circuitos neuronales son manipuladas a través de la aplicación iontophoretical de agonistas y antagonistas sinápticas. La principal ventaja de la iontoforesis sobre presión de eyección es que la iontoforesis no requiere el movimiento físico de fluido desde el electrodo en el tejido neural, y por lo tanto no existe la preocupación de causar daños en los tejidos a través de la presión aplicada o el volumen de líquido. La principal limitación de esta técnica es la falta de información sobre la concentración de fármaco absoluta en el tejido, y el volumen de tejido afectado. Sin embargo, dado que las cantidades de los agentes farmacológicos eyectadas con iontoforesis son mucho más pequeño y mucho más controlable con precisión que con la presión de eyección, la recuperación de la aplicación del fármaco es típicamente mucho más rápido und mucho más completo. Microiontophoresis ha sido utilizado con éxito en un número de sistemas neuronales, sensoriales y otros, y se aplica con éxito en la mayoría de las áreas del cerebro con procesamiento intrínseca pequeña o nula. La razón es que algo del agente farmacológico expulsado puede difundirse desde el sitio de aplicación a una neurona vecina y también manipular las propiedades de respuesta de la neurona vecina. La fabricación por separado de electrodos barril simples como múltiples permite la combinación de electrodos con propiedades arbitrarias y no relacionados. Tirando de barriles de electrodos juntos y utilizando algunos para la grabación y para algunos fines de iontoforesis se producen puntas de electrodo con propiedades muy similares, de tal manera que las puntas de los electrodos podría ser o bien demasiado grande para la grabación única célula, o demasiado pequeño para la aplicación del fármaco. Además, tener la punta del cañón único extienden más allá de las puntas de los electrodos multibarrel por unos 20 micrómetros reduce el ruido en las grabaciones, unad elimina los posibles efectos de confusión de las actuales corrientes de retención o expulsión de disparo de la neurona 3. Piggy-back multibarrel electrodos hayan sido previamente descrito más de 30 años 4-6 y se han utilizado con mucho éxito para analizar circuitos neuronales 7-18 19-29. Así, el método en sí no es nuevo ni único. Sin embargo, los detalles particulares de la preparación del electrodo y el uso han sido modificados a través de los años, y el conjunto de instrucciones que se describen aquí ha demostrado ser especialmente fácil y con éxito, y no ha sido publicado en detalle en otra parte en la literatura. Particularmente, la flexión de la punta de cilindro único electrodo permite que la punta final del electrodo de lengüeta a ser relativamente delgada (Figura 3) y, por tanto, permite para grabaciones de núcleos profundos con el mínimo daño al cerebro, el saliente de la solo barril electrodo sobre el electrodo multi-cañón elimina prácticamente todo current efectos, que se citan a menudo como una desventaja de la técnica 3. Los nuevos detalles que aquí se presenta como tener la punta del electrodo apuntando hacia arriba durante el proceso de pegado y descansando el barril en la ranura del electrodo multibarrel asegurará una alta tasa de éxito cuando se produce piggy-back electrodos. La técnica es relativamente fácil y típicamente puede ser dominado por un principiante en unos pocos días.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del elemento </td><td> Fabricante </td><td> Comentario </td><td> Cat. # </td></tr><tr><td> Mechero Bunsen </td><td></td><td> Disponible en: VWR </td><td> 17928-027 </td></tr><tr><td> Dos componentes del cemento dental: &quot;cura Fría&quot; material dental </td><td> Co-oral-ite Dental Mfg Co </td><td> Disponible en: Sistemas de AM, Inc </td><td> 525000 </td></tr><tr><td> Dos componentes del cemento dental: material de la dentadura reticulación compuesto líquido </td><td> Co-oral-ite Dental Mfg Co </td><td> Disponible en: Sistemas de AM, Inc </td><td> 525000 </td></tr><tr><td> Pegamento líquido </td><td> Henkel </td><td> Disponible en: Loctite Super Glue </td><td> 01-06849 </td></tr><tr><td> Micro-Iontoforesis Unes el siguiente: Neurophore BH-2 </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Disponible en: Harvard Apparatus </td><td> 65-0200 65-0203 y </td></tr><tr><td> Plata aislado alambre </td><td> AM-Systems </td><td> Disponible desde: AM-Systems </td><td> 785500 </td></tr><tr><td> Extractor horizontal </td><td> Zeitz DMZ-Universal Extractor </td><td> Disponible en: AutoMate Scientific </td><td> NA </td></tr><tr><td> Manipulador de micro-piezas: porta electrodo </td><td> WPI </td><td> Disponible en: WPI </td><td> M3301EH </td></tr><tr><td> Manipulador de micro-piezas: fase lineal </td><td> Newport 423 Series </td><td> Disponible en: Newport </td><td> 423 </td></tr><tr><td> Manipulador de micro-piezas: rotación etapa </td><td> Newport RSP-2 </td><td> Disponible en:Newport </td><td> RSP-2 </td></tr><tr><td> Micromanipulador piezas: traducción z </td><td> Newport 433 Series </td><td> Disponible en: Newport </td><td> 433 </td></tr><tr><td> Micromanipulador piezas: soporte de ángulo de 90 ° para montar eje xy z y </td><td> Newport 360-90 </td><td> Disponible en: Newport </td><td> 360-90 </td></tr><tr><td> Micromanipulador piezas: traducción de x / lineal etapa </td><td> Newport 423 Series </td><td> Disponible en: Newport </td><td> 423 </td></tr><tr><td> Micromanipulador piezas: traducción y / lineal etapa </td><td> Newport 423 </td><td> Disponible en: Series Newport </td><td> 423 </td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Leitz Laborlux 11 </td><td></td><td></td></tr><tr&gt; <td> Microscopio: objetivo </td><td> Leitz Wetzlar 10x, NA 0,25 </td><td></td><td> 519760 </td></tr><tr><td> Microscopio: eypieces </td><td> Leitz Wetzlar, Periplan 10x/18 </td><td></td><td> 519748 </td></tr><tr><td> Microscopio: etapa </td><td> Leitz Wetzlar </td><td></td><td> 513544 </td></tr><tr><td> Multibarrel capilar </td><td> N / A </td><td> Disponible en: sistemas de AM, Inc </td><td> 612000 </td></tr><tr><td> Sinlge barril capilar (GC 150F-10) </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Disponible en: Harvard Apparatus </td><td> 30-0057 </td></tr><tr><td> Extractor vertical </td><td> Narishige modelo PE-2 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> Elementos hechos de encargo del manipulador Micro-(marcado luz bLue en la Figura 1) </td><td></td></tr><tr><td> placa de acero </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> base de inclinación </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> fijación para soporte de electrodo </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> Tabla 2. Los fabricantes y los números de puntos de todos los equipos y materiales utilizados en el procedimiento. </td><td></td></tr></tbody></table>

fabricación y uso de piggy-back multibarrel electrodos para<em&gt; en vivo</em&gt; manipulaciones farmacológicas de las respuestas neuronales

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

En grabaciones in vivo de las neuronas individuales permiten a un investigador para examinar las propiedades de descarga de las neuronas, por ejemplo en respuesta a estímulos sensoriales. Las neuronas reciben típicamente múltiples entradas aferentes y / o eferente excitatorias e inhibitorias que se integran entre sí, y los últimos medidos propiedades de respuesta de la neurona son impulsadas por las integraciones neuronales de estas entradas. Para estudiar el procesamiento de información en los sistemas neuronales, es necesario entender las distintas entradas a una neurona o sistema neural, y las propiedades específicas de estas entradas. Un método poderoso y relativamente sencillo técnicamente para evaluar el papel funcional de ciertos insumos que una neurona dada está recibiendo es suprimir dinámicamente y de manera reversible o eliminar estas entradas, y medir los cambios en la salida de la neurona causados ​​por esta manipulación. Esto se puede lograr por farmacológicamente alterar entorno inmediato de la neurona con piggy-back multibarrel eléctrodas. Estos electrodos consisten en un electrodo de cilindro de impresión único y un electrodo de drogas multibarrel que puede llevar hasta 4 diferentes agonistas o antagonistas sinápticas. Los agentes farmacológicos pueden ser aplicados iontoforéticamente en el momento deseado durante el experimento, lo que permite controlada en el tiempo de entrega y reconfiguración reversible de entradas sinápticas. Como tal manipulación, farmacológicos del microambiente constituye un método de gran alcance y sin precedentes para poner a prueba hipótesis específicas sobre el funcionamiento del circuito neural. Aquí se describe cómo piggy-back electrodos se fabrican y cómo se utilizan en experimentos in vivo. El sistema de lengüeta permite a un investigador combinar un electrodo de cilindro de impresión único de cualquier propiedad arbitraria (resistencia, tamaño de la boquilla, etc forma) con un electrodo de fármaco multibarrel. Esta es una ventaja importante sobre estándar con múltiples electrodos, donde todos los barriles tienen más o menos las formas y propiedades similares. Multibarrel electrodes se introdujo por primera vez hace 40 años 1-3, y han sido objeto de varias mejoras de diseño de 2,3 hasta que el tipo piggy-back se introdujo en la década de 1980 4,5. Aquí les presentamos una serie de mejoras importantes en la producción de laboratorio de piggy-back electrodos que permiten la penetración profunda del cerebro intacto en las preparaciones en animales in vivo debido a un cuerpo de electrodos relativamente delgada que causa un daño mínimo. Además, estos electrodos se caracterizan por grabaciones de bajo ruido, y tienen bajos barriles de resistencia a fármacos para iontoforesis muy eficaz de los agentes farmacológicos deseados.

En este experimento, el antagonista de receptor de glicina clorhidrato de estricnina fue aplicada iontoforéticamente. El bloqueo de la inhibición glycinergic típicamente aumenta disparo de las neuronas. Figura 4 muestra datos de ejemplo de una neurona auditiva cuyas respuestas a estímulos sonoros sinusoidales de creciente intensidad entregada a las orejas del animal se registraron. Este tipo de experimento se conoce como la función de la neurona de descarga tasa de intensidad vs. Los sonidos más fuertes como resultado mayores tasas de pico de la curva (negro). La corriente de iontoforesis inicial utilizado en este experimento fue de 15 nA. Después de que la corriente se conecta y los cambios en la función de intensidad tasa se había estabilizado en su nuevo nivel (curva de color azul oscuro), la corriente de eyección se incrementó progresivamente a 30, 45, y 60 nA (naranja, verde y luz azul curvas, respectivamente). En cada caso, las respuestas de la neurona sobre el mismo intervalo de intensidades de sonido se registraron después de los cambios en la Alta trasrgimos intensidad tasa de funciones en respuesta a la corriente de eyección nuevo se había estabilizado. La eyección más corriente apropiada a utilizar en este ejemplo fue de 45 nA a 60 nA porque estos niveles de corriente ya no alterar de manera diferente las respuestas de las neuronas. Este resultado sugiere que en 45 nA de corriente, todos los receptores de glicina de neurona que ya había sido bloqueada por el hidrocloruro de estricnina. Cualquier incremento adicional de la estricnina eyección incluso más actual y la liberación no resultó en un cambio adicional de la descarga de la neurona tasa de nivel de función. Después de la finalización del protocolo, la corriente de eyección se apaga. La recuperación de las respuestas neuronales a la línea base se logró después de unos 25 min (línea roja). Esto puede llevar, en función del tipo y cantidad de medicamento expulsado, entre varios segundos y varias decenas de minutos. <table border="1"><tbody><tr><td> Droga </td><td> Concentración </td><td> pH de una solución </td><td> Solvente </td><td> Empresa </td><td> Cat. # </td><td> Retención de Corriente típica </td><td> Corrientes típicas de eyección </td></tr><tr><td> GABA </td><td> 500 mM </td><td> 3.5-4.0 </td><td> dH 2 O </td><td> Sigma </td><td> A-2129 </td><td> -15 NA </td><td> 5 nA a 100 nA </td></tr><tr><td> Glicina </td><td> 100 mM </td><td> 3.5-4.0 </td><td> dH 2 O </td><td> Sigma </td><td> G-7126 </td><td> -15 NA </td><td> 5 nA a 100 nA </td></tr><tr><td> Bicuculina metiodida </td><td> 10 mM </td><td> 3,0 </td><td> 0,165 M de NaCl en dH 2 O </td><td> Sigma </td><td> B-6889 </td><td> -15 NA </td><td> 5 nA a 60 nA </td></tr><tr><td> La estricnina clorhidrato </td><td> 10 mM </td><td> 3,0 </td><td> 0,165 M de NaCl en dH 2 O </td><td> Sigma </td><td> S-8753 </td><td> -15 NA </td><td> 5 nA a 80 nA </td></tr><tr><td> L-ácido glutámico </td><td> 500 mM </td><td> 8.0 </td><td> dH 2 O </td><td> Sigma </td><td> G-1251 </td><td> 30 nA </td><td> -10 A -150 nA nA </td></tr><tr><td> L-ácido aspártico </td><td> 500 mM </td><td> 8.0 </td><td> dH 2 O </td><td> Sigma </td><td> A-8949 </td><td> 30 nA </td><td> -10 A -150 nA nA </td></tr><tr><td> Ácido kaínico </td><td> 1 mM </td><td> 9.0 </td><td> dH 2 O </td><td> Sigma </td><td> K-0250 </td><td> 30 nA </td><td> -NA 10 nA a -100 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Fármacos comúnmente utilizados, con pH para la disolución y concentración. La tabla lista los agonistas más comúnmente utilizados sinápticas y antagonistas utilizados con iontoforesis. El entorno de pH indicado cuentas por la necesidad de polarizar t<html> agentes stos, y las cuentas de concentración sugeridos para la variabilidad en la efectividad entre las diferentes drogas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig1.jpg" /> Figura 1. Tres multibarrel pipetas con puntas diferentes longitudes. A: La punta de este electrodo 5-barril se ha tirado demasiado largo y delgado. Tenga en cuenta que la punta esté doblada y muy suave. Este tipo de punta es muy difícil de romper para el diámetro deseado. B: La punta de este electrodo es demasiado corto y rechoncho. Cuando avanzado en áreas cerebrales más profundos, este electrodo puede causar daño cerebral innecesario debido al hecho de que el electrodo se vuelve relativamente gruesa sólo unos pocos milímetros después de la punta. C: Un ejemplo de un electrodo con una punta correctamente tira. Si bien es larga y delgada, la punta sigue siendo firme y se puede romper fácilmente al diámetro de la punta deseada. gura 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4358/4358fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Dibujo de conjunto de electrodo manipulador. El conjunto manipulador se utiliza junto con un microscopio para montar los electrodos piggy-back. Los elementos marcados en gris son productos comercialmente disponibles y se enumeran en la Tabla 2. Los artículos marcados en azul fueron maquinados a medida en la tienda de máquina de nuestra institución. Ellos son: 1) 1/4 pulgadas de placa de acero de tamaño 43x26 cm con agujeros para la etapa Newport 423 perforado en él de acuerdo con el patrón de agujeros proporcionados por Newport, 2) una etapa de inclinación que permite la inclinación de la asamblea en ángulos arbitrarios, 3) un conector que se monta el soporte del electrodo a la etapa de traslación superior. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig3.jpg" /> Figura 3. Foto de una muestra de piggy-back electrodo. Un acabado cinco barriles electrodo montado junto con una grabación en el de un solo cañónectrode. Nota eje largo de aproximadamente 7 mm lo que permite una grabación profundas del cerebro. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4358/4358fig4.jpg" /> Figura 4. La titulación de las corrientes de expulsión. El gráfico muestra la intensidad de tasa funciones grabadas desde una neurona auditiva individual, mientras que las orejas del animal se estimularon con tonos de diferentes intensidades. Los sonidos más fuertes tienden a provocar mayor tasas de disparo. Antes de la aplicación del fármaco, la neurona La tasa de intensidad función mostraron las tasas más bajas puntas (curva en negro). Progresivamente más altas corrientes de eyección comandos progresivamente más receptores de glicina en la neurona, lo que resulta en tasas de disparo progresivamente más altas. La expulsión óptima actual en esta neurona era 45-60 nA. Con estas corrientes de eyección, el bloqueo completo de todos los receptores de las neuronas de glicina fue alcanzada. Después de la finalización del protocolo experimental, la iontoforesis se terminó y la neurona se dejórecuperar. La recuperación completa se logra cuando la tasa de recuperación de intensidad coincide con la función inicial antes del fármaco función de recuperación. Reproducido, con autorización de la American Physiological Society, de Klug et al, 1995.

La iontoforesis de agonistas y antagonistas neuronales durante extracelular<em&gt; In vivo</em&gt; Grabaciones es una poderosa manera de manipular microambiente de una neurona. Estas manipulaciones pueden más fácilmente ser hecho a través de piggy-back multibarrel electrodos. Aquí se describe cómo fabricarlos y usarlos durante las grabaciones auditivas.

Fabricación y uso de Piggy-back Multibarrel Electrodos para<em&gt; En vivo</em&gt; Manipulaciones farmacológicas de las respuestas neuronales

Los registros in vivo de neuronas individuales permiten que un investigador examine las propiedades de disparo de las neuronas, por ejemplo, en respuesta a estímulos sensoriales. ...

Este procedimiento tiene como objetivo la aplicación iónforética de agentes farmacológicos a microcircuitos en el cerebro mientras se registra simultáneamente la actividad neuronal. Primero, prepare un electrodo de vidrio de un solo canal para el registro de una sola célula y doble la punta. Además, prepare un electrodo de vidrio multicanal y rompa su punta hasta alcanzar el diámetro deseado.Proceda a ensamblar los dos electrodos. En última instancia, el electrodo producido se utiliza para grabaciones extracelulares in vivo, en las que se pueden aplicar farmacológicamente agentes para manipular microcircuitos neuronales según sea necesario. Hola, mi nombre es el Dr. Achim Klu, y nuestro laboratorio les mostrará hoy cómo producir electrodos multibarrel tipo piggyback.Estos electrodos pueden utilizarse para ionoforesis de agonistas y antagonistas neurales en el microentorno de una neurona, y así manipular los circuitos neuronales de una neurona in vivo. Hola, soy la Dra. An Zillow. Soy posdoctoranda en el laboratorio del Dr. Ah him Crow, y hoy demostraré el procedimiento. Para un electrodo de barril único, utilice una capilar de vidrio de un solo barril con filamento y estire la punta hasta un diámetro de aproximadamente uno a dos micrómetros y una longitud del vástago de 10 a 12 milímetros.Verifique esporádicamente la resistencia del electrodo jalado llenándolo con cloruro de sodio tres molar y probándolo con un medidor O estándar en solución salina al 0,9 %. Una vez que el electrodo se llena con la solución salina, esta se seca rápidamente, haciendo que el electrodo sea inservible. Por lo tanto, realice esta prueba únicamente.Pise algunos electrodos que no se utilizarán para la producción de tipo piggyback. Para crear un electrodo completo de múltiples barriles, tire del vidrio hasta obtener una punta de pipeta con un diámetro total de aproximadamente 10 micrómetros o menos. Un electrodo con una punta correctamente estirada es fundamental para el éxito.Además de ser larga y delgada, la punta debe ser aún firme y quebrarse fácilmente hasta el diámetro deseado. La punta se romperá hasta el diámetro correcto en el siguiente paso. Por lo tanto, el tamaño exacto de la punta es menos crítico durante el proceso de agrupamiento que la forma general de la punta del electrodo, que debe ser larga y relativamente delgada.Ahora, sostenga el electrodo de barril único aproximadamente a 45 grados, con la punta orientada hacia abajo, y muévalo a través de la llama relativamente rápido. El objetivo es que la llama derrita el vidrio en la zona de transición a unos 10 milímetros de la punta del electrodo, doblando así el electrodo aproximadamente 20 grados. Coloque el electrodo de múltiples barriles en un lecho de arcilla modelable sobre una lámina de vidrio y luego insértelo en las etapas del microscopio.Sostenedor de portaobjetos Utilizando los manipuladores XY del estadio del microscopio, mueva suavemente la punta del electrodo contra la pieza de plexiglás. Observe la ruptura de la punta a través de los oculares del microscopio. Aquí se muestra la configuración del montaje del electrodo.El electrodo de múltiples capilares se mantiene sobre una portaobjetos en la platina del microscopio. Mientras tanto, el electrodo de un solo capilar es sostenido por un manipulador manual de múltiples ejes que permite al usuario bajar con gran precisión el pipeta de un solo capilar sobre el pipeta de múltiples capilares. Baje el electrodo de un solo capilar directamente hacia la ranura del electrodo de múltiples capilares, formada por la disposición de los cinco capilares, de modo que su punta sobresalga aproximadamente entre cinco y diez micrómetros más allá de la punta del electrodo de múltiples capilares.Una los ejes de los dos electrodos utilizando cianoacrilato. Comience en la posición más distal respecto a las puntas y mueva lentamente un palillo con una gota de pegamento a lo largo de los ejes de los electrodos hacia las puntas. Aplicar pegamento demasiado cerca de las puntas de los electrodos obstruirá las mismas y hará que el electrodo sea al menos parcialmente no funcional.Mezcle una pequeña cantidad de cemento dental. Deje secar aproximadamente 15 minutos. Luego, retire cuidadosamente el electrodo piggyback terminado.Primero desde el soporte del micromanipulador y luego despréndalo del portaobjetos de vidrio. Justo antes de usar el electrodo, prepárese para rellenar cada barril con su fármaco respectivo. Llene los cuatro barriles externos de la configuración de cinco barriles con cuatro fármacos de elección y el barril central con cloruro de sodio tres molar como barril de equilibrio.Luego, llene el electrodo de registro de un solo barril con cloruro de sodio tres molar. Ahora encienda los módulos de la bomba de iontoforesis y pruebe todos los barriles. La función de prueba del electrodo de cada módulo de bomba ayudará a determinar si el barril del electrodo es funcional para grabaciones en el cerebro profundo.Un electrodo de cinco barras terminado ensamblado junto con un electrodo de registro de una sola barra tiene un vástago largo de aproximadamente siete milímetros. Varios agonistas y antagonistas sinápticos se utilizan comúnmente con iontoforesis, bloqueando la inhibición de la glicina con fármacos como los antagonistas del receptor de glicina. El clorhidrato de strychnine nueve suele aumentar la actividad de disparo en las neuronas.Estos datos de ejemplo miden la tasa de descarga de una neurona auditiva frente a la función de intensidad, y muestran las respuestas a estímulos sonoros sinusoidales de intensidad creciente aplicados a los oídos del animal. Los sonidos más intensos produjeron tasas de impulsos más altas antes de la aplicación del estricto nueve. La función de intensidad de la tasa de la neurona muestra tasas bajas de impulsos.La aplicación de una corriente inicial de iontoforesis de 15 nanoamperios estimula un ligero aumento en la corriente de expulsión. Corrientes de expulsión progresivamente más altas bloquean progresivamente más receptores de glicina en la neurona, lo que resulta en tasas de disparo progresivamente más elevadas. Con una corriente de 45 nanoamperios, todos los receptores de glicina de esa neurona parecen estar bloqueados por el clorhidrato de strychnine.Un aumento adicional de la corriente de eyección y la liberación de cantidades aún más elevadas de noradrenalina no produjo un cambio adicional. El nivel de la frecuencia de descarga de las neuronas después de la finalización de la iontoforesis muestra una función que recupera completamente las respuestas neuronales hasta los niveles basales tras aproximadamente 25 minutos. Este proceso de recuperación depende del tipo y cantidad de fármaco eyectado.Es importante recordar que el fármaco ferre se difundirá hacia la vecindad del sitio de registro y también podría bloquear receptores en neuronas vecinas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo combinar un electrodo de registro con un electrodo multibarril para fármacos y obtener grabaciones de bajo ruido en regiones profundas del cerebro, junto con la administración controlada en el tiempo de hasta cuatro agentes farmacológicos.

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