Fabricación y uso de Piggy-back Multibarrel Electrodos para En vivo Manipulaciones farmacológicas de las respuestas neuronales

Este procedimiento tiene como objetivo la aplicación iónforética de agentes farmacológicos a microcircuitos en el cerebro mientras se registra simultáneamente la actividad neuronal. Primero, prepare un electrodo de vidrio de un solo canal para el registro de una sola célula y doble la punta. Además, prepare un electrodo de vidrio multicanal y rompa su punta hasta el diámetro deseado.

Proceda a ensamblar los dos electrodos. En última instancia, el electrodo producido se utiliza para grabaciones extracelulares in vivo, en las que se pueden aplicar farmacológicamente agentes para manipular microcircuitos neuronales según sea necesario. Hola, mi nombre es el Dr. Achim Klu, y nuestro laboratorio les mostrará hoy cómo producir electrodos multibarrel tipo piggyback.

Estos electrodos pueden utilizarse para ionoforesar agonistas y antagonistas neurales en el microentorno de una neurona, y así manipular los circuitos neuronales de una neurona in vivo. Hola, soy la Dra. An Zillow. Soy posdoctoranda en el laboratorio del Dr. Ah him Crow, y hoy demostraré el procedimiento. Para un electrodo de un solo canal, utilice una capilaridad de vidrio de un solo canal con filamento y estire la punta hasta un diámetro de aproximadamente uno a dos micrómetros y una longitud del vástago de 10 a 12 milímetros.

Verifique esporádicamente la resistencia del electrodo jalado llenándolo con cloruro de sodio tres molar y probándolo con un medidor O estándar en solución salina al 0,9 %. Una vez que el electrodo se llena con la solución salina, esta se seca rápidamente, haciendo que el electrodo sea inservible. Por lo tanto, realice esta prueba únicamente.

Pise algunos electrodos que no se utilizarán para la producción de tipo piggyback. Para crear un electrodo completo de múltiples barriles, tire del vidrio hasta obtener una punta de pipeta con un diámetro total de aproximadamente 10 micrómetros o menos. Un electrodo con una punta correctamente estirada es fundamental para el éxito.

Además de ser larga y delgada, la punta debe ser aún firme y romperse fácilmente hasta alcanzar el diámetro deseado. La punta se romperá hasta el diámetro correcto en el siguiente paso. Por lo tanto, el tamaño exacto de la punta es menos crítico durante el proceso de agrupamiento que la forma general de la punta del electrodo, que debe ser larga y relativamente delgada.

Ahora, sostenga la pipeta de un solo canal a unos 45 grados, con la punta apuntando hacia abajo, y muévala a través de la llama relativamente rápido. El objetivo es que la llama derrita el vidrio en la zona de transición a unos 10 milímetros de distancia de la punta de la pipeta, para doblarla aproximadamente 20 grados. Coloque la pipeta multicanal en un lecho de arcilla modelable sobre una lámina de vidrio y luego insértela en las etapas del microscopio.

Soporte para portaobjetos: utilizando los manipuladores XY del estadio del microscopio, mueva suavemente la punta del electrodo contra la pieza de plexiglás. Observe la ruptura de la punta a través de los oculares del microscopio. Aquí se muestra la configuración del montaje del electrodo.

El electrodo de múltiples capilares se mantiene sobre una portaobjetos en la platina del microscopio. Mientras tanto, el electrodo de un solo capilar es sostenido por un manipulador manual de múltiples ejes que permite al usuario bajar con gran precisión el pipeta de un solo capilar sobre el pipeta de múltiples capilares. Baje el electrodo de un solo capilar directamente hacia la ranura del electrodo de múltiples capilares, formada por la disposición de los cinco capilares, de modo que su punta sobresalga aproximadamente entre cinco y diez micrómetros más allá de la punta del electrodo de múltiples capilares.

Pegue los ejes de los dos electrodos juntos utilizando cianoacrilato. Comience en la posición más distal respecto a las puntas y mueva lentamente un palillo con una gota de pegamento a lo largo de los ejes de los electrodos hacia las puntas de los electrodos. Aplicar pegamento demasiado cerca de las puntas de los electrodos obstruirá las puntas y hará que el electrodo sea al menos parcialmente no funcional.

Mezcle una pequeña cantidad de cemento dental. Deje secar aproximadamente 15 minutos. Luego, retire cuidadosamente el electrodo piggyback terminado.

Primero desde el soporte del micromanipulador y luego despréndalo del portaobjetos de vidrio. Justo antes de usar el electrodo, prepárese para rellenar cada barril con su fármaco respectivo. Llene los cuatro barriles externos de la configuración de cinco barriles con cuatro fármacos de elección y el barril central con cloruro de sodio tres molar como barril de equilibrio.

Luego, llene el electrodo de registro de un solo barril con cloruro de sodio tres molar. Ahora encienda los módulos de la bomba de iontoforesis y pruebe todos los barriles. La función de prueba del electrodo de cada módulo de bomba ayudará a determinar si el barril del electrodo es funcional para grabaciones en el cerebro profundo.

Un electrodo de cinco barras terminado ensamblado junto con un electrodo de registro de una sola barra tiene un vástago largo de aproximadamente siete milímetros. Varios agonistas y antagonistas sinápticos se utilizan comúnmente con iontoforesis, bloqueando la inhibición de la glicina con fármacos como los antagonistas del receptor de glicina. El clorhidrato de strychnine nueve aumenta típicamente la actividad de disparo en las neuronas.

Estos datos de ejemplo miden la tasa de descarga de una neurona auditiva frente a la función de intensidad, y muestran las respuestas a estímulos sonoros sinusoidales de intensidad creciente aplicados a los oídos del animal. Los sonidos más intensos produjeron tasas de disparo más altas antes de la aplicación del estricto nueve. La función de intensidad de la tasa de la neurona muestra tasas de disparo bajas.

La aplicación de una corriente inicial de iontoforesis de 15 nanoamperios estimula un ligero aumento en la corriente de expulsión. Corrientes de expulsión progresivamente más altas bloquean progresivamente más receptores de glicina en la neurona, lo que resulta en tasas de disparo progresivamente más elevadas. Con una corriente de 45 nanoamperios, todos los receptores de glicina de esa neurona parecen estar bloqueados por el clorhidrato de strychnine.

Cualquier aumento adicional de la corriente de eyección y la liberación de cantidades aún más elevadas de noradrenalina no produjo un cambio adicional. El nivel de la frecuencia de descarga de las neuronas después de la finalización de la iontoforesis; la recuperación completa de las respuestas neuronales hasta los niveles basales ocurre aproximadamente a los 25 minutos. Este proceso de recuperación depende del tipo y cantidad de fármaco eyectado.

Es importante recordar que el fármaco ferre se difundirá hacia la vecindad del sitio de registro y también podría bloquear receptores en neuronas vecinas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo combinar un electrodo de registro con un electrodo multibarril para fármacos y obtener grabaciones de bajo ruido en regiones profundas del cerebro, junto con la administración controlada en el tiempo de hasta cuatro agentes farmacológicos.