Name: Formación de imágenes pHluorin-etiquetados Inserción del receptor a la membrana plasmática en neuronas primarias de ratón en cultivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Aprende a visualizar la inserción de receptores dopaminérgicos D2 en la membrana plasmática de neuronas primarias de ratón usando pHluorin y microscopía TIRF. Este método permite estudiar dinámicas de tráfico de proteínas en tiempo real.

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Este trabajo es apoyado por fondos de puesta en marcha del Laboratorio Jackson.

1. Preparación de Cultura del ratón para Glia acondicionado Cultura Neuronal <ol><li> Matraces T75 se recubren con una solución de colágeno (1:3 dilución de Purecol en ddH 2 O). Los matraces se colocará en posición vertical y se dejó secar durante la noche en una campana de cultivo de tejidos. </li><li> Tampón de disección (LCRa: 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM de MgCl 2, 30 mM dextrosa, 25 mM HEPES, pH 7,4, sin calcio) y los medios de comunicación glía (DMEM suplementado con FBS al 10%, 10 unidades / ml de penicilina, 10 g / ml de estreptomicina, y Glutamax) se preparan y se almacenan a 4 ° C hasta que esté listo para su uso. </li><li> En el día de la cultura glia, los medios de comunicación glía se calienta durante al menos 30 min en un baño a 37 ° C antes de la disección de los cerebros de ratón. Ratones embrionarios o neonatal son sacrificados por decapitación rápida. Cortezas cerebrales se diseccionan bajo un microscopio de disección. </li><li> Disecados tejidos cerebrales son digeridos en solución de papaína (100 ml papaína y 20 l 1% de DNasa I en tampón de disección 2 ml) a 37 ° C for 20 min. </li><li> Después de la digestión con papaína, los tejidos del cerebro se aclaró con 10 ml de medio glía precalentado. Medios frescos glía (2 ml) se añade entonces a los tejidos del cerebro digeridos, y los tejidos se trituraron con un pulido al fuego pipeta Pasteur de vidrio. </li><li> Medios frescos glía (8 ml) se añade a los tejidos disociados. A 70 m de células colador se utiliza para filtrar la suspensión de tejido disociado. Después las células se sembraron en frascos T75 (usualmente 2-3 embriones pueden sembrar una matraz T75) y se colocaron en un 37 ° C incubadora de células de cultivo. </li><li> El día siguiente, los medios de comunicación de los matraces T75 se aspira. Los matraces se enjuagaron con 10 ml de PBS. Medios frescos glía (10-15 ml) se añade a continuación a cada matraz. </li><li> Dentro de 10-12 días, en las células de los matraces T75 debe ser confluente. Las células gliales se lavan con PBS, y 5 ml de tripsina al 0,05% se añade a cada matraz T75. </li><li> Después de la incubación de tripsina a 37 º C durante 5 min, las células gliales son células disociadas y gliales de cada matraz T75 se dividen en dosdiferentes recubiertas con colágeno matraces T75. </li><li> Insertos de cultivo (Millipore PICM03050) se preparan colocándolos en placas de 6-y, recubrimiento con colágeno, y secado con aire durante la noche. Medios de comunicación glía (2 ml cada uno) se coloca debajo de cada inserto de cultivo. </li><li> Glia de matraces T75 confluentes se tratan con tripsina y se siembran en los insertos de cultivo (un matraz T75 por 6-así placa, 2 ml cada pieza de inserción). Estos insertos de cultivo de células gliales se utiliza para acondicionar los cultivos neuronales. </li></ol> 2. Cultura Neuronal <ol><li> Los cubreobjetos de vidrio para el cultivo neuronal se limpian por inmersión en 70% de HNO 3 al menos durante la noche. Los cubreobjetos se lavan a continuación con ddH 2 O por lo menos 3 veces, y se secó en un horno Isotemp (&gt; 200 ° C) durante la noche. </li><li> Cubreobjetos limpios se colocan en una placa de 6-así, un cubreobjetos por pocillo. Los cubreobjetos se recubren con poli-L-lisina solución (2 ml, 0,1% en ácido bórico 100 mM, pH = 8,5) durante la noche en una incubadora de 37 ° C. </li><li> Lapoli-L-lisina solución se elimina de los cubreobjetos y los cubreobjetos se lavaron 3 veces con ddH autoclave 2 O. Los cubreobjetos se incuban a continuación en un 37 ° C durante la noche en medios galvánicos (Neurobasal suplementado con suero de caballo al 5% inactivado por calor, 10 unidades / ml de penicilina, 10 mg / ml de estreptomicina, Glutamax incubadora; 2% suplemento B27 se añade al medio de chapado el día en que se utiliza). </li><li> Al día siguiente, los medios de deposición se retira y 2 ml de medio fresco con enchapado de B-27 se añadieron a cada pocillo que tiene un cubreobjetos de vidrio. </li><li> Ratones embarazadas (E15-18) son sacrificados con el CO 2, y embriones de ratones son sacrificados por decapitación. El hipocampo o estriado se disecciona el tejido cerebral y se colocó en un tubo cónico de 15 ml con tampón enfriado con hielo disección, para el cultivo de neuronas del hipocampo o estriatal neuronas espinosas medias, respectivamente. </li><li> Disecados tejidos cerebrales se disocian con papaína como se describe en los pasos 1,4) y 1,5). </li><li> Fespués de disociación, el número de células en cada suspensión neuronal se contaron con un hemocitómetro. Las neuronas se sembraron entonces sobre cada cubreobjetos a una densidad de 0,4 x 10 6 células por pocillo de una placa de 6 pocillos y se cultivaron en una incubadora de 37 ° C durante la noche (las neuronas son DIV 0). </li><li> Para preparar insertos glía de cultivo para el acondicionamiento de los cultivos neuronales, los medios de comunicación glía se elimina de los insertos de cultivo de células gliales y medianas recubrimiento fresco se añade (2 ml en el inserto y 2 ml debajo de la pieza de inserción). </li><li> El día siguiente (DIV 1), los cubreobjetos con las neuronas se colocan debajo de los insertos de cultivo glia, un cubreobjetos en cada pocillo. </li><li> Las neuronas se alimentan con medio fresco que el volumen de los medios de alimentación pre-calentado (con B-27) cada 3-4 días hasta que están listas para experimentos de transfección y de imagen. </li></ol> 3. Transfección <ol><li> Neuronal transfección se realiza usando Lipofectamine 2000. Para cada cultivo neuronal (un cultivo por cubreobjetos), 2 lLipofectamine 2000 y 1 ug de ADN se utilizan. Medio fresco Neurobasal sin suplemento se usa para diluir Lipofectamine y ADN. </li><li> ADN y Lipofectamine se incuban durante 20 min a temperatura ambiente después de la mezcla. </li><li> Guardar 1 ml de los medios de debajo de cada inserto de cultivo glia, y 1 ml desde el interior de cada inserto, y transferir los medios de comunicación a un tubo cónico. Añadir el mismo volumen de medios de alimentación + B27 al medio de salvado y se incuba a 37 ° C. Este medio se utiliza para el cultivo neuronal después de la transfección. </li><li> Después de la 20-min Lipofectamine / ADN incubación, insertos glía de cultivo se retira momentáneamente de las placas 6-y. El 200 l Lipofectamine / ADN mezcla se añade a cada cubreobjetos con las neuronas. Los insertos de cultivo de células gliales se devuelven luego a cada pocillo, por encima de las neuronas. Generación de burbujas debajo de la membrana de los insertos de cultivo debe ser evitado. Las neuronas se incubaron con la mezcla de Lipofectamine / ADN a 37 ° C durante 2-4 h. </li><li> Después de the 2-4 hr período de incubación, las inserciones glía se retiran de nuevo. Los medios de cultivo con la mezcla de Lipofectamine / ADN se retiraron de cada pocillo. Los medios guardados en el paso 3,3) se añade a las neuronas (2 ml por pocillo). Glia insertos de cultivo se devuelven a cada pocillo, y los medios de comunicación glía de cada inserto se retira, y 2 ml de los medios de paso 3,3) se añadió a cada inserto. </li><li> Las neuronas se cultivaron durante 24-72 horas para permitir la expresión de cDNA transfectadas antes TIRF formación de imágenes se realiza en estas neuronas. </li></ol> 4. TIRF imágenes <ol><li> Líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa: 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 30 mM de glucosa, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM de HEPES, pH = 7,4) se utiliza para los experimentos de formación de imágenes en vivo. Nuestro sistema de imagen TIRF es costumbre puesta a punto con un láser de 100 mW Cian para la excitación, y una carga del electrón Multiplicando Coupled Device (EMCCD) de la cámara por un detector. </li><li> Antes de los experimentos de imagen, la LCRa se advirtió en un 37 &amp; dpor ejemplo, baño de agua C durante al menos 30 min. El inserto de calefacción para formación de imágenes en vivo se coloca en la platina del microscopio, y el inserto de calefacción, el láser y la cámara se calienta durante al menos 30 min antes del inicio de los experimentos de imagen. </li><li> Un cubreobjetos con neuronas transfectadas se monta en la cámara de formación de imágenes en vivo. El LCRa pre-calentado se coloca en la cámara después de que la cámara está montada, este paso debe ser completado tan pronto como sea posible. </li><li> Una vez que la cámara se coloca en el inserto de calefacción en la platina del microscopio, las neuronas transfectadas se identifican visualmente bajo el modo de formación de imágenes epi-fluorescente. </li><li> Después sanos neuronas transfectadas se identifican (consulte las Figuras 1 y 2), se realizan típicamente 1 min de foto-blanqueador para eliminar la pre-existente pHluorin fluorescencia en la membrana plasmática, como pHluorin-receptores en la membrana plasmática tienen niveles de fluorescencia muy alta cuando TIRF imágenes por primera vez, lo que interfiere con la visualización de ins individuoertion eventos. </li><li> Después de fotoblanqueador, el ajuste de ganancia del multiplicador de electrones en la cámara EMCCD se ajusta al máximo, y la grabación se realiza durante 1 min a 10 Hz. </li><li> Cada registro contendrá 600 imágenes. Los eventos individuales de inserción se identifican por jugar la parte de atrás de grabación usando ImageJ. Los eventos individuales de inserción se analizaron manualmente usando ImageJ. </li></ol> 5. Los resultados representativos Cultivo neuronal consistente es la clave para el éxito de formación de imágenes en vivo-experimentos. Figura 1 muestra las neuronas del hipocampo de ratón cultivadas usando el protocolo de DIV 11 a DIV 18. Es evidente a partir de las imágenes que las neuronas han desarrollado procesos extensos y que los procesos dendríticos son cubiertos densamente con las espinas dendríticas, las indicaciones de que estas neuronas son saludables en cultivo. Nuestro protocolo de cultivo también podría ser utilizado para otros tipos de neuronas en el cerebro. Por ejemplo, recientemente hemos usado este protocolo a la culturaestriatal neuronas espinosas medias en un estudio para examinar los receptores de dopamina D2 (DRD2) inserción en cultivos de ratón estriatal neuronas espinosas medias 9. Figura 2 muestra ratón estriatal neuronas espinosas medias cultivadas utilizando nuestro protocolo en DIV 8. También hemos realizado con éxito TIRF imágenes de superecliptic DRD2s pHluorin-etiquetados en este tipo de neurona. Figura 3 muestra la expresión de pHluorin-etiquetados DRD2 (pH-DRD2) en una neurona espinosa medio y visualización de pH-DRD2 inserción en esta neurona. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig1.jpg" /> Figura 1. Hipocampo de ratones de cultivo utilizando el método de cultivo de interfaz. DIV: días in vitro, el día de la cultura se considera como DIV 0. De las imágenes, es evidente que las neuronas del hipocampo maduros en este tipo de cultivo entre 11 DIV y DIV 15. En DIV 11 y 13, las dendritas neuronales están cubiertos con filipodia y espinas inmaduras. En DIV 15 y18, las dendritas neuronales están cubiertos por espinas grandes, una indicación de más neuronas maduras. Paneles izquierdo: bajo aumento imágenes de las neuronas del hipocampo de ratones de diferentes edades. Paneles de la derecha: imágenes de gran aumento (zoom en las dendritas neuronales del panel de la izquierda) de los procesos neuronales dendríticas con las espinas dendríticas en las diferentes edades. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig2.jpg" /> Figura 2. Ratón espinoso neurona estriatal medio de cultivo utilizando el método de cultivo de interfaz. Las neuronas de las imágenes están en DIV 8. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig3.jpg" /> Figura 3. Un ratón medio estriatal neurona espinosa transfectadas con super eclíptica pHluorin marcada con receptor de dopamina D2 (DRD2 pH). Imagen de la izquierda es la proyección de intensidad máxima de la grabación de lapso de tiempo (600 imágenes, 100 ms por imagen). Puntas de flechas blancas indican inserción individual de pH vesicular-DRD2. Esta imagen retiene la información de la inserción en la dimensión XY pero pierde la información de tiempo. Imagen de la derecha muestra la proyección yt intensidad máxima, en el que la pila XYT se gira 90 grados alrededor del eje y, y el máximo de píxeles en cada línea del eje x se proyecta sobre un único eje y pixel. Esta imagen retiene la información de inserción a lo largo del eje yt pero pierde la información eje x.

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Por razones desconocidas, las neuronas de ratón son siempre más difíciles de cultivar que las neuronas de rata. En nuestra experiencia, un cultivo mixto de las neuronas y las células gliales funciona bien para los principales cultivos de neuronas de ratón. Sin embargo, como un cultivo mixto no es adecuado para TIRF experimentos de imagen, como en este tipo de neuronas de cultivo y sus procesos tienden a crecer en la parte superior de células de la glia, situando la somata neuronal y procesos dendríticos más allá del alc...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Nombre del reactivo</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Número de catálogo</strong</td&gt;<td<strong&gt; Comentarios</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Purificado solución de colágeno bovino (Purecol)</td&gt;<td&gt; Advanced Biomatrix</td&gt;<td&gt; 5005-B</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Hank solución salina equilibrada (HBSS)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14185-045</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penicilina-estreptomicina (Pen Strep)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 15140-122</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Piruvato de sodio</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 11360-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM alto en glucosa</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 10313-021</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Suero fetal bovino (FBS)</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; GlutaMAX</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 35050-061</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Papaína</td&gt;<td&gt; Worthington Biochemical Corp.</td&gt;<td&gt; LS003126</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; I de páncreas bovino desoxirribonucleasa (DNasa I)</td&gt;<td&gt; SIGMA</td&gt;<td&gt; DN25-10MG</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdFosfato&gt; Dulbecco Buffered Saline (DPBS)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14190-144</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tripsina 0,05%</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 25300-054</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Poli-l-lisina hidrobromuro</td&gt;<td&gt; SIGMA</td&gt;<td&gt; P2636-1G</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ácido bórico</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific-</td&gt;<td&gt; BP 168-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Medio Neurobasal</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 21103-049</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B-27 libre de suero Suplemento</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Calor inactiva suero de caballo</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 26050-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lipofectamine 2000</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11668 019</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific-</td&gt;<td&gt; BP310-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cultura Insertar</td&gt;<td&gt; Millipore</td&gt;<td&gt; PICM03050</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

formación de imágenes phluorin-etiquetados inserción del receptor a la membrana plasmática en neuronas primarias de ratón en cultivo

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Una mejor comprensión de los mecanismos que regulan el tráfico del receptor entre la membrana plasmática (PM) y los compartimentos intracelulares requiere un enfoque experimental con excelentes resoluciones espaciales y temporales. Además, este enfoque también debe tener la capacidad de distinguir los receptores localizados en el PM de aquellos en los compartimentos intracelulares. Lo más importante, la detección de los receptores en una sola vesícula requiere sensibilidad de detección relevante, ya que cada vesícula lleva sólo un pequeño número de receptores. Enfoques estándar para examinar el tráfico de receptores incluyen biotinilación superficie seguido por la detección bioquímica, que carece tanto de las resoluciones espaciales y temporales necesarias, y examen de microscopía de fluorescencia de receptores de superficie inmunomarcadas, lo que requiere la fijación química de las células y por lo tanto carece de suficiente resolución temporal 1-6. Para superar estas limitaciones, nosotros y otros han desarrollado y empleado una nueva estrategia que permite la visualización de la inserción dinámica de los receptores en el PM con excelentes resoluciones 7-17 espaciales y temporales. El enfoque incluye el etiquetado de un GFP sensible al pH, el superecliptic pHluorin 18, para el dominio extracelular N-terminal de los receptores. Superecliptic pHluorin tiene la propiedad única de ser fluorescente a pH neutro y no fluorescentes a pH ácido (pH &lt;6,0). Por lo tanto, los receptores son etiquetados no fluorescente cuando está dentro del lumen de las vesículas ácidas de tráfico intracelular o los compartimentos endosomales, y se convierten fácilmente visualizadas sólo cuando se expone al entorno extracelular pH neutro, en la superficie exterior de la PM. Nuestra estrategia en consecuencia nos permite distinguir los receptores de superficie de las PM en vesículas intracelulares de tráfico. Para lograr suficientes resoluciones espaciales y temporales, así como la sensibilidad requerida para estudiar el tráfico dinámico de los receptores, se emplearon interna total reflejarmicroscopía fluorescente ion (TIRFM), lo que nos permitió lograr la resolución espacial óptima de imagen óptica (~ 170 nm), la resolución temporal de microscopía de vídeo-rate (30 fotogramas / segundo), y la sensibilidad para detectar la fluorescencia de GFP una sola molécula. Por pHluorin imagen marcada con receptores de bajo TIRFM, hemos sido capaces de visualizar directamente los receptores individuales de los eventos de inserción en el PM en las neuronas cultivadas. Este enfoque de formación de imágenes potencialmente se puede aplicar a cualquier proteína de la membrana con un dominio extracelular que podría etiquetarse con pHluorin superecliptic, y permitirá a la disección de los mecanismos clave modalidades de inserción de proteínas de membrana diferentes (receptores, canales iónicos, transportadores, etc) a la PM.

Mediante el etiquetado de los dominios extracelulares de los receptores de membrana con pHluorin superecliptic, y por imágenes de estos receptores de fusión en las neuronas de ratón en cultivo, se puede visualizar directamente los eventos de inserción individuales vesiculares de los receptores a la membrana plasmática. Esta técnica será fundamental para elucidar los mecanismos moleculares que regulan la inserción del receptor en la membrana plasmática.

Formación de imágenes pHluorin-etiquetados Inserción del receptor a la membrana plasmática en neuronas primarias de ratón en cultivo

Una mejor comprensión de los mecanismos que regulan el tráfico de receptores entre la membrana plasmática (MP) y los compartimentos intracelulares requiere un...

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar los receptores neuronales a medida que se insertan en la membrana plasmática en neuronas primarias cultivadas de ratón. Para ello, se obtienen GL de ratón del cortex cerebral de embriones o ratones neonatos y se cultivan sobre insertos de cultivo recubiertos con colágeno semipermeable. Los cultivos de células gliales se suspenden sobre neuronas hipocampales embrionarias primarias en laminillas.Luego de siete días de condicionamiento, las neuronas se transfectan con un receptor de dopamina D2 marcado con fluorina super eclíptica. El receptor marcado se localiza en vesículas intracelulares, pero permanece no fluorescente dentro del entorno ácido de las vesículas. Sin embargo, cuando la vesícula se fusiona con la membrana plasmática, la fluorina se expone al pH neutro del entorno extracelular y fluoresce intensamente, lo que permite su detección mediante microscopía de fluorescencia por reflexión interna total.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del tráfico de proteínas de membrana, permitiéndonos visualizar el tráfico de cualquier proteína de membrana que pueda ser marcada con flúor, como los receptores de glutamato y los receptores acoplados a proteínas G. Demostrando el procedimiento junto conmigo hoy estarán Breeding Dry y, y nosotros uno, dos otros miembros de nuestro grupo de investigación. El día anterior al procedimiento de disección, agregue frascos T75 con solución de colágeno, coloque los frascos en posición vertical y déjelos secar durante la noche. El día del cultivo de células gliales, caliente el medio para glía durante al menos 30 minutos en un baño de agua a 37 grados Celsius; tras la eutanasia, diseccione las cortezas cerebrales de ratones embrionarios o neonatos bajo un microscopio de disección.Coloque las cortezas eliminadas en un tubo cónico de 15 mililitros con hielo, lleno con líquido cefalorraquídeo artificial frío o LCR. A continuación, retire todo el LCR excepto dos mililitros y agregue 100 microlitros de solución de pepaina y 20 microlitros de ADNasa al 1%. Coloque el tubo en un baño de agua a 37 grados Celsius y deje que el tejido se digiera durante 20 minutos.Después de la digestión, lave cuidadosamente los tejidos cerebrales eliminando con cuidado la solución de propano y añadiendo 10 mililitros de medio glial precalentado. Luego, teniendo cuidado de no perturbar el tejido, retire la mayor cantidad posible del medio glial.Agregue dos mililitros de medio glial fresco y, utilizando una pipeta de vidrio pulida al fuego, triture hasta que el tejido ya no sea visible. Evite formar burbujas una vez que el tejido esté completamente disociado. Agregue ocho mililitros adicionales de medio glial fresco y pase la suspensión a través de un filtro celular de 70 micrones.Recoger el flujo en un tubo cónico de 50 mililitros. Transferir las células disociadas de dos a tres embriones a un matraz T 75 recubierto con colágeno y cultivar a 37 grados Celsius en una incubadora de cultivo de tejidos durante la noche. Al día siguiente, aspirar el medio. Enjuagar las células una vez con 10 mililitros de PBS.Luego, agregue de 10 a 15 mililitros de medio glial fresco a cada matraz. Incube las cultivos durante 10 a 12 días, cambiando el medio cada tres a cuatro días. Una vez confluentes, enjuague las células gliales con PBS.Luego, agregue cinco milímetros de tripsina al 0,05 % al matraz y deje que las células se desprendan durante cinco minutos a 37 grados Celsius. Tras la breve incubación, agregue medio glial y pipetee para desprender las GL del fondo del matraz. Divida las células en dos nuevos matraces T 75 recubiertos con colágeno.Una vez que alcancen confluencia, realizar la tripsinización como antes y sembrar el contenido de cada matraz en placas de seis pocillos que contengan insertos de cultivo recubiertos con colágeno. Colocar sobre dos mililitros de medio de cultivo glial y dejar las células durante uno a siete días. Estos insertos de cultivo glial se utilizarán para condicionar los cultivos neuronales.Añada cuatro mililitros de medio de siembra a cada pocillo de una placa de seis pocillos que contenga laminillas recubiertas con polilisina limpia y coloque la placa en un incubador a 37 grados Celsius durante la noche. Este paso aumenta la probabilidad de supervivencia neuronal, probablemente al eliminar la polilisina residual al día siguiente. Retire el medio de siembra y sustitúyalo con dos mililitros de medio de siembra fresco.Medio que contiene 2 % del medio. Suplemento B 27 para el cultivo de neuronas hipocampales. Bajo un microscopio estereoscópico, seccionar los hipocampos a partir del tejido cerebral de cuatro ratones embrionarios E15 a E18. Colocar los hipocampos en un tubo cónico de 15 mililitros con tampón de disección frío con hielo.A continuación, diseccionar el estriado a partir del tejido cerebral de tres ratones embrionarios de E 15 a 18 y colocarlos en un tubo cónico separado de 15 mililitros con tampón de disección frío con hielo. Digiera el tejido con pepane como antes. Luego, utilizando un hemocitómetro.Determine el número de células en cada suspensión neuronal y siembre. Cada cubreobjetos con 0,4 veces 10 a la sexta células y cultívelos durante la noche en un incubador a 37 grados Celsius. Para preparar los insertos de cultivo glial para la condicionación de los cultivos neuronales, aspire el medio de los insertos de cultivo glial y de la placa, y reemplace cada uno con dos mililitros de medio fresco para siembra.Al día siguiente, coloque las laminillas con las neuronas en cada pocillo de la placa debajo de los insertos de cultivo de células gliales. Continúe la incubación a 37 grados Celsius, reemplazando cada tres o cuatro días la mitad del medio por medio de alimentación fresco, previamente calentado, que contenga B 27, hasta que estén listas para los experimentos de transfección y de imágenes.Las neuronas se transfectarán en el día siete y se observarán mediante imágenes en el día ocho de cultivo. Un cultivo neuronal consistente es clave para experimentos exitosos de imágenes en vivo. Esta figura muestra neuronas hipocampales de ratón cultivadas mediante este protocolo desde 11 días in vitro hasta 18 días in vitro.Es evidente a partir de las imágenes que las neuronas han desarrollado procesos extensos y que los procesos dendríticos están densamente cubiertos de espinas dendríticas. Indicaciones de que estas neuronas se encuentran sanas en cultivo para cada cultivo neuronal. Combine dos microlitros de lipofectamina en 2001 microgramos de ADN y codificando el receptor de dopamina D2 marcado con florina súper eclíptica.Mezcle e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente. Durante la incubación, retire y transfiera un mililitro del medio de debajo y un mililitro del interior de cada inserto de cultivo glial al mismo tubo cónico. Luego, agregue el mismo volumen de medio de alimentación con B 27 al medio guardado e incube a 37 grados Celsius.Este medio se utilizará para el cultivo neuronal tras la transfección, después del período de incubación del ADN de 20 minutos con el reactivo lipídico. Retire las inserciones con cultivo de células gliales de las placas de seis pocillos. Añada la mezcla de ADN con lipofectamina de 200 microlitros a cada cubreobjetos con neuronas.Evite generar burbujas bajo la membrana de la cultura. Reemplace los insertos de cultivo glial e incube a 37 grados Celsius durante dos a cuatro horas. Después de la incubación, retire nuevamente los insertos gliales y aspire la solución de transfección de cada pozo; luego agregue los dos mililitros de medio que se habían guardado previamente a las neuronas y reemplace los insertos de cultivo glial.Finalmente, retire el medio glial de cada inserto y agregue dos mililitros del medio guardado a cada cultivo. Incube las células durante un período adicional de 24 a 72 horas para permitir la expresión del ADNc transfectado. El sistema de imagen TIRF utilizado en este video es un montaje personalizado con un láser cian de 100 milivatios para la excitación y una cámara de dispositivo de carga acoplada con multiplicación electrónica como detector. Media hora antes del inicio de la adquisición de imágenes, caliente el LCR a 37 grados Celsius en un baño de agua. Además, encienda el láser, la cámara y el inserto calefactor, y coloque el inserto calefactor en la platina del microscopio.Coloque un cubreobjetos con neuronas transfectadas en una cámara de imagenología en vivo y agregue rápidamente A CSF previamente calentado. Coloque la cámara en el inserto de calentamiento sobre la platina del microscopio bajo el modo de imagenología fluorescente en epifluorescencia e identifique las neuronas transfectadas. Luego, bajo el modo de imagenología TIRF, haga fotoblanqueo de las neuronas durante un minuto para eliminar cualquier fluorescencia de fluorocromo preexistente en la membrana plasmática.A continuación, ajuste la ganancia del multiplicador de electrones en la cámara E-M-C-C-D al valor máximo y comience a adquirir imágenes durante un minuto a 10 hercios. Cada grabación contendrá 600 imágenes una vez que finalice toda la adquisición. Analice los datos utilizando Image J para determinar la inserción en la membrana del receptor de dopamina D2.Se transfectó un ratón sal medio de neuronas espinosas con super eclíptica. Se realizó fluoración marcada con dopamina D dos receptor PDR D dos vivo, seguida de imágenes TIRF, en las cuales se tomaron 600 imágenes a una velocidad de una imagen cada 100 milisegundos. Esta imagen muestra la proyección de intensidad máxima de la grabación lapseada en el tiempo; la flecha blanca indica los lugares donde vesículas individuales que contienen pH DD dos se han fusionado con la membrana plasmática.Esta imagen muestra la proyección de intensidad máxima de YT, en la que la pila XYT se rota 90 grados alrededor del eje Y, y el píxel máximo en cada línea del eje X se proyecta sobre un único píxel del eje Y. Para proporcionar información sobre la cronología de la inserción, estos datos demuestran que este método puede emplearse con éxito para examinar la regulación de la inserción en la membrana plasmática de receptores en neuronas cultivadas de ratón tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del tráfico de receptores neuronales exploraran la regulación de otros receptores, canales y transportadores en la membrana plasmática neuronal.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este protocolo describe los pasos necesarios para analizar, a través de la electroporación y transfectar neuronas del hipocampo del ratón y la cultura cortical. Corto plazo, las culturas pueden ser utilizados para los estudios del axón y la orientación, mientras que a largo plazo las culturas pueden ser utilizados para estudios de la sinaptogénesis y el análisis espina dendrítica.

Nucleofection y cultivos primarios de neuronas del hipocampo de embriones de ratón y corticales

Este informe describe el uso de imágenes de células vivas y técnicas fotoblanquear para determinar la expresión en la superficie, las vías de transporte y la cinética de la trata de exógena expresó, sensible al pH las buenas prácticas agrarias de etiquetado proteínas en la membrana plasmática de las neuronas.

Difusión lateral y exocitosis de proteínas de membrana en neuronas cultivadas evaluó a través de la recuperación de fluorescencia y la pérdida de fluorescencia photobleaching

Fuente: Schönherr, S., et. al. Inmunomarcaje combinado optogenético y réplica de fractura por congelación para examinar la disposición específica de entrada de los receptores de glutamato en la amígdala de ratón. J. vis. exp. (2016)Este vídeo muestra el inmunomarcaje de réplicas fracturadas por congelación de tejido cerebral de ratón para microscopía electrónica. Las réplicas fracturadas y recubiertas se digieren para exponer los receptores. Se añaden anticuerpos primarios y secundarios...

Inmunomarcaje de proteínas de membrana neuronal en un espécimen de tejido cerebral de ratón fracturado por congelación

Fuente: Lacin, E., et al. Construcción de reporteros de ingeniería fluorescente de neurotransmisores basados en células (CNiFER) para la detección óptica de neurotransmisores in vivo. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra una técnica para obtener imágenes de la liberación de neurotransmisores in vivo utilizando reporteros de ingeniería fluorescente de neurotransmisores basados en células (CNiFER), células reporteras especializadas preinyectadas en la corteza del ratón. Colocado bajo un...

Obtención de imágenes de liberación de neurotransmisores mediante reporteros de ingeniería fluorescente de neurotransmisores basados en células

Aquí, se presenta un procedimiento para activar selectivamente una proteína neuronal con un pulso corto de luz mediante la codificación genética de un aminoácido no natural foto-reactivo en una proteína neuronal diana expresada en neuronas en cultivo o in vivo.

Control óptico de una proteína neuronal utilizando un ácido Unnatural Amino genéticamente codificados en las neuronas

Etiquetar el dominio extracelular de una proteína de membrana con un fluoróforo sensible al pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite la localización subcelular, la expresión y el tráfico que se determinen. proteínas de imágenes SEP-etiquetado con total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna (TIRFM) permite la cuantificación de los niveles de proteína en el ER y la membrana plasmática periférica.

La utilización de receptores de etiquetado pHluorin de Seguimiento de localización subcelular y el Tráfico

Aquí se presenta un protocolo para investigar los efectos tempranos de la amiloide-β (Aß) en el cerebro.  Esto demuestra que Aβ induce la endocitosis mediada por clatrina y colapso de conos de crecimiento axonal. El protocolo es útil en el estudio de efectos tempranos de Aβ en conos de crecimiento axonal y puede facilitar la prevención de la enfermedad de Alzheimer.

Visualizar el colapso del cono de crecimiento Axonal y temprano efectos β amiloidea en las neuronas de ratón cultivadas

En este informe, describimos un protocolo simple para estudiar el crecimiento de neurita en neuronas corticales de rata embrionaria mediante la co-transfección con EGFP y la proteína de interés.

Un ensayo mejorado basado en proteínas de fluorescencia verde para el estudio del crecimiento de neurita en las neuronas primarias

Aquí presentamos un protocolo para medir los flujos in vitro ca2+ en las neuronas de cerebro medio y sus efectos aguas abajo en la caspasa-3 utilizando cultivos primarios de cerebro medio ratón. Este modelo se puede emplear para estudiar los cambios fisiopatológicos relacionados con la actividad anormal de Ca2+ en las neuronas de cerebro medio, y para detectar nuevas terapias en busca de propiedades anti-apoptóticas.

Cuantificación de los flujos espontáneos de Ca2+ y sus efectos aguas abajo en las neuronas primarias de cerebro medio de ratón

Aquí, describimos un protocolo que combina la inyección de virus adenoasociados con la implantación de ventana craneal para obtener imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos

Aprende a visualizar la inserción de receptores dopaminérgicos D2 en la membrana plasmática de neuronas primarias de ratón usando pHluorin y microscopía TIRF. Este método permite estudiar dinámicas de tráfico de proteínas en tiempo real.

Formación de imágenes pHluorin-etiquetados Inserción del receptor a la membrana plasmática en neuronas primarias de ratón en cultivo (Video) | JoVE Journal

Formación de imágenes pHluorin-etiquetados Inserción del receptor a la membrana plasmática en neuronas primarias de ratón en cultivo

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