Formación de imágenes pHluorin-etiquetados Inserción del receptor a la membrana plasmática en neuronas primarias de ratón en cultivo

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar los receptores neuronales a medida que se insertan en la membrana plasmática en neuronas primarias de ratón cultivadas. Para ello, los GL de ratón se obtienen de la corteza cerebral de ratones embrionarios o neonatos y se cultivan en insertos de cultivo semipermeables recubiertos de colágeno. Los cultivos gliales se suspenden sobre las neuronas embrionarias primarias del hipocampo en cubreobjetos.

Luego, después de siete días de acondicionamiento, las neuronas se transfectan con un receptor de dopamina D dos marcado con flúor súper eclíptico. El receptor marcado se localiza en las vesículas intracelulares, pero permanece no fluorescente dentro del ambiente ácido de las vesículas. Sin embargo, cuando la vesícula se fusiona con la membrana plasmática, el florín se expone al pH neutro del entorno extracelular y emite fluorescencia brillante, lo que permite la detección mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del tráfico de proteínas de membrana, lo que nos permite visualizar el tráfico de cualquier proteína de membrana que pueda marcarse con flúor, como los receptores de glutamato y los receptores acoplados a gpro. La demostración del procedimiento junto conmigo hoy será la cría en seco y, y nosotros, otros dos miembros de nuestro grupo de investigación El día antes del procedimiento de disección, matraces T 75 con solución de colágeno, colocan los matraces en posición vertical y los dejamos secar durante la noche. El día del cultivo glial, calentar el medio glial durante al menos 30 minutos en un baño de agua a 37 grados centígrados después de la eutanasia, diseccionar las cortezas cerebrales de ratones embrionarios o neonatos bajo un microscopio de disección.

Coloque las cortezas extraídas en un tubo cónico de 15 mililitros lleno de hielo, líquido cefalorraquídeo artificial frío o líquido cefalorraquídeo A. A continuación, retire todos menos dos mililitros del líquido cefalorraquídeo A y agregue 100 microlitros de solución de pepano y 20 microlitros de 1% de ADN. Coloque el tubo en un baño de agua a 37 grados centígrados y deje que el tejido se digiera durante 20 minutos.

Después de la digestión, lave cuidadosamente los tejidos cerebrales eliminando cuidadosamente la solución de propano y agregando 10 mililitros de medio glial precalentado. A continuación, teniendo cuidado de no alterar el tejido. Retire la mayor cantidad posible de medio glial.

Agregue dos mililitros de medio glial fresco y, usando un vidrio pulido al fuego, pase la pipeta a tres velocidades hasta que el tejido ya no sea visible. Evite formar burbujas una vez que el tejido esté completamente disociado. Agregue ocho mililitros adicionales de medio glial fresco y pipetee la suspensión a través de un colador de celdas de 70 micras.

Recoja el flujo en un tubo cónico de 50 mililitros. Transfiera las células disociadas de dos a tres embriones a un matraz T 75 recubierto de colágeno y cultive a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos durante la noche del día siguiente para aspirar el medio. Enjuague las celdas una vez con 10 mililitros de PBS.

A continuación, añada de 10 a 15 mililitros de medio glial fresco a cada matraz. Incubar los cultivos durante 10 a 12 días, cambiando el medio cada tres o cuatro días. Una vez confluentes, enjuague las células gliales con PBS.

A continuación, añada cinco milímetros de 0,05% en el matraz y deje que las células se desprendan durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Después de la breve incubación, agregue medio glial y pipetea para separar el GL del fondo del matraz. Divida las células en dos nuevos matraces T 75 recubiertos de colágeno.

Una vez que estos alcanzan la confluencia, los tripos se anizan como antes y siembran el contenido de cada matraz en seis placas de pocillos que contienen insertos de cultivo recubiertos de colágeno. Se colocan sobre dos mililitros de medio glial de cultivo, las células durante uno a siete días. Estos insertos de cultivo glial se utilizarán para acondicionar los cultivos neuronales.

Agregue cuatro mililitros de medio de siembra a cada pocillo de una placa de seis pocillos que contenga cubreobjetos recubiertos de polilisina limpios y coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados durante la noche. Este paso aumenta la probabilidad de supervivencia neuronal, muy probablemente mediante la eliminación de la polilisina residual al día siguiente. Retire el medio de recubrimiento y reemplácelo con dos mililitros de recubrimiento fresco.

Medio que contiene el 2% del medio. Suplemento B 27 para el cultivo de neuronas del hipocampo Bajo un microscopio de disección, diseccione los campos del hipopótamo del tejido cerebral de cuatro ratones embrionarios E 15 a 18. Coloque el hipopótamo en un tubo cónico de 15 mililitros con tampón de disección helado.

A continuación, diseccione el cuerpo estriado del tejido cerebral de tres ratones embrionarios E 15 a 18 y colóquelos en un tubo cónico separado de 15 mililitros con tampón de disección helado. Digiere el tejido con pepano como antes. A continuación, utilizando un hemocitómetro.

Determina el número de células en cada suspensión neuronal y semilla. Cada cubrimiento se desliza con 0,4 veces 10 a la sexta célula y las cultiva en una incubadora a 37 grados centígrados durante la noche. Para preparar los insertos de cultivo glial para acondicionar los cultivos neuronales, aspire el medio de los insertos y la placa de cultivo glial, y reemplace cada uno con dos mililitros de placa fresca.

Al día siguiente, coloque las hojas de cobertura con las neuronas en cada pocillo de la placa debajo de los insertos de cultivo glial. Continúe incubando a 37 grados centígrados cada tres o cuatro días. Reemplace la mitad del medio con alimentación fresca precalentada, medio que contenga B 27 hasta que estén listos para la transfección y los experimentos de imagen.

Las neuronas se transfectarán al séptimo día y se tomarán imágenes al octavo día de cultivo. El cultivo neuronal consistente es la clave para el éxito de los experimentos de imágenes en vivo. Esta figura muestra neuronas del hipocampo de ratón cultivadas con este protocolo desde 11 días in vitro hasta 18 días in vitro.

De las imágenes se desprende que las neuronas han desarrollado procesos extensos y que los procesos dendríticos están densamente cubiertos de espinas dendríticas. Indicaciones de que estas neuronas están sanas en cultivo para cada cultivo neuronal. Se combinaron dos microlitros de lipectomía en 2001, microgramos de ADN y codificando el receptor de dopamina D dos marcados con Florin súper eclíptico.

Mezclar e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Durante la incubación, retire y transfiera un mililitro del medio desde abajo y un mililitro desde el interior de cada inserto de cultivo glial al mismo tubo cónico. A continuación, añada el mismo volumen de medio de alimentación con B 27 al medio guardado e incube a 37 grados centígrados.

Este medio se utilizará para el cultivo neuronal después de la transfección después de la incubación de ADN media de 20 minutos por efecto labial. Retire los insertos de cultivo glial de las seis placas de pocillos. Agregue la mezcla de ADN de lipectomía de 200 microlitros a cada cubreobjetos con neuronas.

Evite generar burbujas debajo de la membrana del cultivo. Vuelva a colocar los insertos de cultivo glial e incube a 37 grados centígrados durante dos a cuatro horas. Después de la incubación, retire nuevamente los insertos gliales y aspire la solución de transfección de cada pocillo, luego agregue los dos mililitros de medio que se guardó previamente a las neuronas y reemplace los insertos de cultivo glial.

Por último, retire el medio glial de cada inserto y añada dos mililitros del medio guardado a cada cultivo. Las células durante 24 a 72 horas adicionales para permitir la expresión del CD NA transfectado. El sistema de imágenes TIRF utilizado en este video es una configuración personalizada con un láser cian de 100 milivatios para la excitación y una cámara de dispositivo acoplado a la carga multiplicadora de electrones para un detector 30 minutos antes del inicio de la imagen, calentar un LCR a 37 grados Celsius en un baño de agua. Además, encienda el láser y la cámara y el inserto calefactor y coloque el inserto calefactor en la platina del microscopio.

Coloque un cubreobjetos con neuronas transfectadas en una cámara de imágenes en vivo y agregue rápidamente un líquido cefalorraquídeo A precalentado. Coloque la cámara en el inserto de calentamiento en la etapa del microscopio en el modo de imagen epifluorescente, identifique las neuronas transfectadas. Luego, en el modo de imagen TIRF, fotoblanquee las neuronas durante un minuto para eliminar cualquier fluorescencia de flúor preexistente en la membrana plasmática.

A continuación, establezca la configuración de ganancia del multiplicador de electrones en la cámara E-M-C-C-D al máximo y comience a tomar imágenes durante un minuto a 10 hercios. Cada grabación contendrá 600 imágenes una vez que se hayan completado todas las imágenes. Analice los datos utilizando la imagen J para determinar la inserción en la membrana del receptor dos de dopamina D.

Una neurona espinosa mediana de sal de ratón fue transfectada con súper eclíptica. A continuación, se realizaron imágenes de dopamina D marcadas con dopamina D, dos receptores PDR D, dos TIRF vivos, en las que se tomaron 600 imágenes a una velocidad de una imagen cada 100 milisegundos. Esta imagen muestra la proyección de intensidad máxima de la punta de flecha blanca de grabación de lapso de tiempo que indica dónde las vesículas individuales que contienen pH DD dos se han fusionado con la membrana plasmática.

Esta imagen muestra la proyección de intensidad máxima de YT en la que la pila XYT se gira 90 grados alrededor del eje Y, y el píxel máximo en cada línea del eje X se proyecta en un solo píxel del eje Y. Para dar información sobre la línea de tiempo de la inserción, estos datos demuestran que este método se puede emplear con éxito para examinar la regulación de la inserción de receptores en la membrana plasmática en neuronas de ratón cultivadas después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del tráfico de receptores neuronales exploraran las regulaciones de otros receptores, canales y transportadores de membrana neuroplasmática.