Procesamiento de mamoplastia de reducción y tejidos humanos Mastectomía para el cultivo celular

Este protocolo tiene como objetivo aislar las partes epiteliales de la glándula mamaria libres de células estromales mamarias asociadas. Comience con la disección acumulada del material de descarte quirúrgico para enriquecer las estructuras epiteliales mediante digestión enzimática. Separar los organoides epiteliales del material estromal fuera de la membrana basal.

Luego procese los organoides digeridos a través de filtros celulares de tamaño de poro fijo para obtener fracciones enriquecidas. Siembre los organoides para su cultivo inmediato o congele las existencias para su uso futuro. En última instancia, los organoides epiteliales se utilizan para generar cultivos a largo plazo de células epiteliales mamarias humanas normales.

Desarrollé este método por primera vez a finales de la década de 1970 con el fin de avanzar en el campo de la biología de las células epiteliales humanas y la carcinogénesis. Se disponía de abundante material de descarte quirúrgico de tejidos de memoria humana normales. Lo que se necesitaba era un método para procesar este material heterogéneo a granel para que fuera adecuado para el cultivo de células epiteliales puras y medios para respaldar el crecimiento a largo plazo.

La demostración visual de este método es útil, especialmente para notar cómo hacer la disección cruda. ¿Qué aspecto tienen los organoides bien digeridos? Filtrado de los organoides y recubrimiento de los organoides para el cultivo.

La ventaja de esta técnica es que proporciona fracciones epiteliales limpias para el estroma y las células epiteliales permanecen intactas. Los organoides, que hemos encontrado, dan el mejor crecimiento inicial y maximizan el número de células que se pueden obtener. Dos científicos del Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley, James Garvey y Mark LeBarge, demostrarán ahora este procedimiento a partir del material desechado de los procedimientos quirúrgicos.

Obtener tejido mamario humano en recipientes estériles que contengan tampón o medio completo más antibióticos a cuatro grados centígrados. Corta pedazos del pañuelo y colócalos en un plato grande de vidrio estéril. Separe las áreas epiteliales de la matriz estromal del tejido adiposo, el tejido conectivo y los vasos sanguíneos.

Disecciona suavemente las hebras blancas de las áreas epiteliales incrustadas en la matriz estromal más amarilla. Sujete el material con pinzas y raspe el material graso con un bisturí. Luego, con bisturíes opuestos, corte el tejido epitelial en trozos de aproximadamente cuatro milímetros para facilitar la digestión.

Transfiera el tejido epitelial disecado a un tubo centrífugo cónico de 50 o 15 mililitros en tejido muy fibroso. Habrá más material blanco sólido no epitelial. Si es difícil diseccionar las células epiteliales a partir de matrices tan fibrosas.

El tejido se puede cortar en trozos cuadrados de uno a tres milímetros y digerir por separado. Llene el tubo con los medios de digestión que contienen colagenasa cruda y días de alta aluminización, dejando un pequeño espacio de aire para permitir la mezcla durante la rotación. Incubar la muestra durante la noche a 37 grados centígrados en un rotador de 360 grados a ocho RPM después de la digestión.

Granular las muestras por centrifugación 600 G durante cinco minutos. Deseche la grasa sobrenadante y el medio siguiendo las pautas institucionales para la eliminación de tejido humano. Para controlar la digestión del tejido, diluya un pequeño Eloqua del pellet en medio y examine microscópicamente en organoides completamente digeridos para mostrar el estroma adjunto.

Repita la digestión enzimática hasta que el tejido esté completamente digerido en organoides puros. Si se necesita una segunda digestión durante la noche, es posible que sea necesario reducir la concentración de enzimas para evitar la digestión excesiva. Los organoides correctamente digeridos mostrarán estructuras alveolares ductales o alveolares ductales de apariencia suave libres de estroma adherido.

Una vez finalizada la digestión, resus suspender el pellet final en antibióticos de lugar medio. Pase la muestra digerida en cuartos a través de un colador estéril de 100 micras sobre un tubo estéril de 50 mililitros. Después de que el medio haya drenado en el tubo, lave los organoides con tres mililitros de medio.

Repita hasta que se haya transferido todo el pellet resuspendido. A continuación, voltee con cuidado el filtro sobre un tubo estéril y lave los organoides en el tubo con más medio. Se trata de la piscina de organoides de 100 micras.

Ahora pase el material que drenó en el tubo original de 50 mililitros a través de un colador de 40 micras para separar las estructuras alveolares del grupo de filtrado de células individuales y pequeños grupos de células mesenquimales y epiteliales y pequeños trozos de tejido vascular. Centrifugar las piscinas de 100 micras, 40 micras y filtrar a 600 G durante cinco minutos. Reconstituya cada muestra con un mililitro de ccpm.

Dos soluciones congeladas por 0,1 mililitros de paladar lleno. Manténgalo a cuatro grados centígrados. Coloque con cuidado 0,1 mililitros de cada una de las dos piscinas de organoides.

Gota a gota en una distribución uniforme sobre uno o 2 platos de 35 milímetros. Evite rascar la superficie del plato después de unos minutos de permitir que los organoides se adhieran. Agregue medios de crecimiento lentamente para evitar desalojar los organoides.

A continuación, incubar los cultivos primarios a 37 grados centígrados en una incubadora de CO2 humidificada. También siembre 0,1 mililitros de la piscina de filtrado directamente sobre el plástico de cultivo de tejidos con medio de fibroblastos. Incubar los cultivos primarios a 37 grados centígrados en una incubadora de CO2 humidificada.

Después de 24 a 48 horas, verifique la migración celular de los organoides y después de dos a tres días, controle el cultivo de crecimiento mitótico. Las células casi en confluencia reponen el medio cada dos o tres días. Pequeños trozos de la vasculatura pueden adherirse y dar lugar al crecimiento de células de fibroblastos.

En casos de crecimiento significativo de fibroblastos. Realizar trippin ización diferencial para eliminar los fibroblastos de los grandes parches epiteliales. Lave las células una vez en el tampón STE.

A continuación, añade 0,5 mililitros de STE frescos para cubrir el plato con una observación microscópica continua y golpes suaves pero bruscos del plato contra una superficie dura. Busque el desprendimiento de fibroblastos mientras las células epiteliales aún están adheridas. Los cultivos primarios cuando los parches de excrecencia epitelial están a punto de confluir.

Para conservar el cultivo primario y generar varios cultivos secundarios, utilice tripsina parcial. Lave las celdas una vez en el tampón STE, luego agregue STE fresco para cubrir el plato. Vigile que aproximadamente el 50% de las células se hayan desprendido.

A continuación, añade dos mililitros de suero que contenga medio de crecimiento y cosecha las células. Luego, transfiera las células a un tubo estéril de 15 mililitros después de dos lavados. La parcialización parcial puede repetirse alrededor de cuatro a ocho veces con un buen recrecimiento celular de las placas primarias y con un crecimiento equivalente a largo plazo de las subculturas o secundarias congeladas.

Recomendamos congelar las células de la primera tripsinización parcial para su conservación y utilizar las células del segundo PT para el subcultivo. Cuando el tejido se digiere y filtra adecuadamente, se pueden ver organoides, estructuras ductales y alveolares con bordes lisos libres de estroma adherido. Si se digiere poco, habrá material adherido y más contaminación de fibroblastos; si se digiere en exceso, los bordes serán ásperos y la unión será menos eficiente después de la unión de organoides.

El crecimiento epitelial comienza dentro de las 48 a 72 horas a las 48 horas. Todavía no hay división celular activa con mitosis visible a las 72 horas. La mitosis debería hacerse más visible.

Pequeños trozos de vasculatura pueden ser una fuente de crecimiento de células mesenquimales después de cuatro días. Las excrecencias epiteliales muestran poblaciones morfológicamente heterogéneas aquí, la tinción con anticuerpos contra la queratina 14 y la queratina 19 marca los linajes luminales verdes K 19 positivos y rojos K 14 positivos, y también las células progenitoras amarillas K 14 positivas K 19 positivas. El HMEC se puede cultivar en diferentes formulaciones de medios.

Los medios de bajo estrés, como el M 87 a, suplementado con toxina del cólera y oxitocina, favorecerán el crecimiento superior a largo plazo de la HMEC preestasis normal, así como el crecimiento de múltiples linajes de HMEC. Los resultados del análisis de hechos ilustran la diversidad de linaje en los organoides no cultivados y en el cuarto pasaje, HMEC cultivado en M 87, medio A. Aquí, las poblaciones luminales y mioepiteliales se identifican por la expresión de los marcadores luminales, EPCA y CD 2 27 y los marcadores mioepiteliales CD 49 F y CD 10 replateados.

Cuarto pasaje, HMEC. Los hechos enriquecidos para los marcadores luminales y mioepiteliales anteriores tienen su linaje confirmado mediante análisis de inmunofluorescencia para la queratina K 14 y K 19 HMEC. Cultivadas en plástico al pasaje cuatro son capaces de formar estructuras organizadas con relaciones de linaje in vivo de células luminales y mioepiteliales cuando se colocan en CD 2 y CD 10 apropiados se utilizan para enriquecer para estos dos linajes.

Las HMC conservan su capacidad de formar una organización celular 3D adecuada en micropocillos 3D micro patrones con células luminales interiores a células mioepiteliales. Las células progenitoras enriquecidas también pueden formar estructuras 3D robustas cuando se colocan en matrigel que imita estructuras ductoras y alveolares. Las estructuras 3D de Matrigel también exhiben una autoorganización 3D adecuada.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar las partes epiteliales de la glándula mamaria para liberarlas del estroma mamario asociado. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en el transcurso de dos o tres días. La técnica de procesamiento de tejidos es generalmente sencilla.

Es importante recordar que hay que detener la digestión en el punto correcto.