La detección de palmitoilación proteínas en neuronas del hipocampo cultivadas por inmunoprecipitación e Intercambio Acyl-Biotina (ABE)

El objetivo general de este procedimiento es aislar y detectar proteínas neuronales relacionadas con poid a partir de neuronas cultivadas mediante un ensayo bioquímico simple y adaptable. Esto se logra extrayendo e inmovilizando la proteína objetivo en presencia de etilo o NEM para asegurar el bloqueo de todos los grupos tiol libres. El segundo paso es tratar la proteína diana inmovilizada con hidroxilo medio o jamón, para escindir el enlace tioéster entre el residuo de cisteína palmeada y la molécula de palmitato.

Esto libera el grupo de estilo de cistina palmeada y lo hace disponible para el etiquetado en el tercer paso. La proteína diana inmovilizada se incuba con biotina B-M-C-C-A fichero molécula específica marcada con biotina, esta biotina elates y marca, el grupo Thile que originalmente era pyl. El paso final es detectar el nivel de pación de la proteína diana mediante la página SDS y la transferencia occidental para Strp Aden.

En última instancia, el ensayo IP A BE se utiliza para mostrar los niveles del palmitato lipídico unido de forma reversible a una proteína diana neuronal, y también puede detectar cambios sutiles en las proteínas diana. Niveles de pación. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la detección de proteínas, la mutilación de la palma de la mano mediante el marcaje metabólico con el rasgo A palmado, es que el ensayo de intercambio de acil biotina es más sensible y requiere menos tiempo.

El ensayo A BE también permite estimaciones más cuantitativas de la mutilación de la palma y es óptimo para detectar pequeños cambios en los niveles de mutilación de la palma. Aunque este método puede proporcionar información sobre la identificación de proteínas palmeadas y neuronas del hipocampo cultivadas, también se puede aplicar a otros sistemas, como cultivos neuronales primarios de otras regiones cerebrales, líneas celulares heterólogas e incluso tejidos primarios. Para comenzar la extracción de la proteína diana de las neuronas primarias del hipocampo cultivadas, prepare el tampón de lisis y la solución de NEM como se describe en el procedimiento escrito que acompaña a este video.

A continuación, combine el tampón de lisis y la solución de NEM añadiendo 0,5 mililitros de solución de NEM de dos molares a un tubo cónico nuevo de 50 mililitros. Agregue 20 mililitros de tampón de lisis por encima. Siempre agregue primero la solución de etanol NEM y luego el tampón de lisis, para mezclar adecuadamente los dos en una cámara fría de cuatro grados centígrados, coloque rápidamente la mezcla en una plataforma oscilante para mezclar completamente durante cinco minutos.

Retire las neuronas primarias cultivadas del hipocampo de rata de la incubadora, instrucciones sobre cómo cultivar. Las neuronas se pueden encontrar en el texto después de colocar las neuronas cultivadas en hielo. Retire con cuidado los medios celulares.

Lave suavemente las neuronas dos veces con solución salina fría tamponada con fosfato. A continuación, agregue 300 microlitros de tampón de lisis más 50 milimolares NEM al primer pocillo de neuronas del hipocampo y raspe las células con un elevador de células desechable. Recoja el lisado celular y luego descargue el lisado en el siguiente pocillo de ese grupo.

Raspe las celdas dentro del segundo pocillo con el elevador de celdas. Recoja y repita usando un tercer pocillo si es necesario. Para concentrar aún más el lisado, recoja el lisado celular en un tubo de microcentrífuga preenfriado de 1,5 mililitros.

Agregue 100 microlitros de tampón de lisis más 50 milimolares NEM al primer pocillo y repita el proceso de raspado de soldadura para recolectar cualquier lisado celular restante. Pase el lisado celular total a través de una jeringa de calibre 26 y medio cinco o seis veces para ayudar en la lisis mecánica. Tenga cuidado de no soplar burbujas en la solución.

Mutar el lisado celular durante al menos 30 minutos a cuatro grados centígrados después de la centrifugación. Recoja el lisado celular aclarado en un nuevo tubo de preenfriamiento de 1,5 mililitros en hielo. Repita el protocolo de recolección demostrado para todos los grupos de células.

Mida la concentración de proteínas en todas las muestras de lisado utilizando el ensayo BCA. Según las instrucciones del fabricante. Normalice el volumen de todas las muestras de lisado de grupos de células para que tengan exactamente la misma proteína con un mínimo recomendado de 500 microgramos.

Rellene todas las muestras con tampón de lisis más 50 milimolares NEM hasta 500 microlitros de volumen total. A continuación, añada de uno a cinco microgramos de anticuerpo primario dirigido contra la proteína objetivo a cada muestra de lisado. Mutar las muestras mezcladas de lisado de anticuerpos durante la noche a cuatro grados centígrados antes de precipitar e inmovilizar una proteína objetivo.

Prepare una suspensión al 50% de proteína A o proteína G recubierta de SRO velocidades como se describe en el protocolo escrito. Como paso final, agregue un volumen igual de 50% de lodo a cada muestra de lisado de anticuerpos y mute durante al menos una hora a cuatro grados Celsius. Al realizar el ael, el intercambio de pH y temperatura adecuados de todos los tampones y reactivos, así como su frescura, son fundamentales.

Para asegurar el éxito del experimento. Comenzar el corte del jamón con la preparación de una serie de tubos con tampón de lisis de diferentes phs. El pH es muy importante para estos pasos y siempre debe ajustarse.

Usando un medidor de pH por muestra, prepare dos mililitros de tampón de lisis pH 7.2 y 0.5 mililitros de tampón estricto preparado en tampón de lisis. Prepare también 0,5 mililitros de tampón de lisis más 10 milimolares NEM por muestra. AGREGUE PMSF y tabletas inhibidoras de proteasa a todos los tampones de lisis.

La hidroxilo media o jamón se utiliza para escindir el enlace tioéster entre la cisteína palmeada y el ácido graso palmitato. Esto es esencial para liberar el grupo de estilo de cisteína palmeada y hacerlo disponible para el etiquetado con biotina. Por lo tanto, la omisión del escisión del jamón puede servir como un útil control negativo.

Prepare tubos adicionales de 1,5 mililitros en hielo etiquetados como control de jamón negativo para cada muestra después de la incubación del anticuerpo con el lisado celular. Y luego, con las perlas, centrifugar suavemente todas las perlas de muestra a 0,5 veces G durante un minuto a cuatro grados centígrados con los tubos en hielo. Retirar el sobrenadante y resus: suspender las perlas en 600 microlitros de tampón de lisis más 10 milimolares NEM.

Después de que Resus suspenda todas las perlas de muestra, recoja inmediatamente 200 microlitros de la suspensión de perlas de lisado de las muestras y descárguelas en el tubo de jamón negativo de esa muestra con hielo, dejando 400 microlitros de la suspensión de perlas de lisado de cada muestra en el tubo para la muestra de jamón plus. Esto se debe a la degradación limitada de la proteína objetivo causada por el tratamiento del jamón. Un tercio de las cuentas se utilizan para el tratamiento de jamón menos y los dos tercios restantes se utilizan para el tratamiento de jamón plus.

Agregue 300 microlitros adicionales de tampón de lisis más 10 milimolares NEM a la muestra de jamón negativo. Pipetear 100 microlitros adicionales a la muestra de jamón plus para un total de 500 microlitros en cada muestra. Incubar los tubos durante 10 minutos en hielo y luego proceder a lavar las muestras de jamón menos y más como se describe en el procedimiento escrito después del lavado de la muestra a 0,5 mililitros por muestra de tampón de lisis pH 7,2 a todas las muestras de jamón menos.

Agregue 0,5 mililitros por muestra de tampón de jamón a todas las muestras de jamón plus. A continuación, mute todas las muestras durante una hora a temperatura ambiente. No exceder de una hora después del tratamiento con jamón.

Realice el intercambio de acil biotina mediante el etiquetado de biotina BMCC como se discutió en el procedimiento escrito. Una vez que se complete el etiquetado de la biotina BMCC, lave suavemente las muestras como se describe en el texto. Retire el sobrenadante del lavado final, dejando las perlas peletizadas en una suspensión con tampón restante en el fondo del tubo.

Sumerja una pipeta con una punta de pequeño diámetro en el fondo del tubo a través de la suspensión y recoja rápidamente cualquier tampón restante. Teniendo cuidado de no coger ninguna cuenta. Agregue de 40 a 50 microlitros de dos tampones de muestra más cinco milimolares DTT a cada muestra.

Si es necesario. Agite las perlas para mezclarlas completamente con el tampón de muestra e inmediatamente centrifugar a alta velocidad para recoger todas las perlas en un gránulo sumergido en tampón de muestra. Después de hervir las muestras y centrifugar de nuevo, agregue el volumen completo de proteína eludida en el sobrenadante de cada muestra a un solo carril dentro de un gel de poliacrilamida adecuado para Western blot.

Usando la página SDS, organice todas las muestras de modo que el menos jamón control elu y más jamón elu para una sola muestra se ejecuten inmediatamente adyacentes entre sí. Durante la página de la SDS tras la página de la SDS transferida a la membrana A-P-V-D-F o NITROCELULOSA, comience el Western blot con lavado y bloqueo como se describe en el procedimiento escrito, prepare una solución de anticuerpos de TBST más 0.3% de BSA, agregue el anticuerpo estreptavidina HRP, que se ha reconstituido a un miligramo por mililitro en agua destilada. Lave la membrana una vez en TBST durante 10 minutos.

A continuación, incubar la membrana en una solución de anticuerpos STREPTAVIDIN en una plataforma oscilante durante una hora a temperatura ambiente o toda la noche a cuatro grados centígrados. Lave la membrana tres veces en TBST durante 10 minutos en una plataforma mecedora. Con el fin de detectar la señal de pación, se exponga la luminiscencia HRP utilizando un kit de sustrato quimioluminiscente con el fin de normalizar los niveles de pación a la cantidad de la proteína de interés que se inmunoprecipitó.

Pele la membrana con un tampón de extracción Western blott durante cinco a 10 minutos en una plataforma mecedora a temperatura ambiente. Repita los pasos de Western blot utilizando el anticuerpo primario contra la proteína de interés que se utilizó originalmente para la inmunoprecipitación. Cuantifique la pación de la proteína de interés utilizando un software de análisis de imágenes y normalice los niveles de pación a la cantidad de proteína inmunoprecipitada.

El ensayo I-P-A-B-E detecta específicamente la filtración de residuos de cistina a lo largo de las proteínas del sustrato y puede utilizarse para detectar la pación de proteínas neuronales inmunoprecipitadas. Tratamiento de la proteína neuronal inmunoprecipitada con cortes de jamón, el enlace tioéster entre el palmitato y el grupo Sixtine Thal permite la incorporación específica de biotina BMCC en el nuevo grupo de archivos disponible, que puede detectarse posteriormente mediante Western blot. La omisión de la escisión del jamón impide la incorporación de biotina BMCC y funciona como un control negativo para la biotina específica de la muestra de jamón plus.

Por lo tanto, el control de jamón negativo siempre debe ejecutarse junto a la muestra de jamón positivo para la transferencia de Western blot por página SDS. En un experimento optimizado, la señal de pación de la proteína neuronal delta catenina se puede detectar fácilmente mediante transferencia de biotina BMCC a una concentración de un micromolar utilizando estreptavidina conjugada con HRP contra muestras paralelas de jamón menos y más. La señal de pación específica para delta Kain aparece en su tamaño previsto de 160 kilodaltons solo en la muestra de mano plus.

La especificidad de esta señal se confirmó mediante el resondeo de delta CATENINA con el anticuerpo específico que se utilizó inicialmente para inmunoprecipitar, lo que resultó en una señal en ambos tratamientos con el mismo tamaño predicho. La optimización del ensayo I-P-A-B-E dará como resultado un perfil de Western blot de una muestra de jamón negativo que se distingue fácilmente de la muestra de jamón plus y exhibe una señal de pación mínima o nula. La concentración de biotina BMCC utilizada para marcar las CISTINAS PALMADAS requiere una optimización cuidadosa y si se utiliza una concentración supersaturante de BMCC de biotina durante los pasos químicos de A BE, se verán señales de fondo excesivas e inespecíficas.

Los perfiles de ávido rayado en manchas occidentales resultantes entre las muestras de jamón menos y más para la mutilación de delta catine y palma parecen similares cuando se tratan con cuatro micromolares de biotina BMCC con señales de fondo adicionales en diferentes tamaños, lo que indica que se produjo una biotina inapropiada. Debido a que la hidroxilamina es un potente agente reductor que da como resultado una degradación limitada de la proteína objetivo, es necesario normalizar la cantidad de proteína inmunoprecipitada utilizada para muestras de jamón menos y más. La normalización requiere el uso del doble de la cantidad de proteína diana inmovilizada en la muestra de jamón más que en la muestra de jamón menos, lo que da lugar a perfiles de Western blot indistinguibles para la proteína objetivo, como se muestra para la catenina delta.

Sin embargo, si la cantidad de proteína diana inmovilizada no se normaliza entre las muestras de jamón menos y más, la señal de Western blot resultante para la proteína objetivo en la muestra de jamón más puede perderse, como se muestra para la catenina delta cuando se utilizaron cantidades iguales de proteína en ambos tratamientos con jamón. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer la proteína neuronal elegida de las neuronas del hipocampo cultivadas. Utilizar una química BE para detectar si se trata de un sustrato para la mutilación de la palma en un tiempo mínimo y ser capaz de adaptar este protocolo para su uso en otras líneas celulares y tejidos.