Name: La detección de palmitoilación proteínas en neuronas del hipocampo cultivadas por inmunoprecipitación e Intercambio Acyl-Biotina (ABE) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 33 s
Description: Aprenda a detectar proteínas palmitoiladas en neuronas del hipocampo cultivadas mediante inmunoprecipitación e intercambio acil-biotina (ABE). Este ensayo bioquímico sensible permite estudiar el tráfico proteico intracelular.

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Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud MOP-81158.

1. Extracción de la proteína diana a partir de neuronas del hipocampo cultivadas primarias <ol><li> Antes de cosechar proteína endógena de las células primarias del hipocampo, preparar un tampón de lisis (LB, Tabla 1) con inhibidores de la proteasa. A 10 ml de tampón de lisis, añadir 0,1 ml solución de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) a una concentración final de 10 mM, y añadir 1 tableta de cóctel inhibidor de la proteasa. </li><li> Preparar N-etilmaleimida (NEM) solución (Tabla 1) a partir de polvo liofilizado. Disolver suavemente en 100% de EtOH a temperatura ambiente (RT). Siempre preparar la solución de NEM fresco para el día del experimento. </li><li> Siguiente combinar el tampón de lisis y NEM. Añadir 0,5 ml de solución de NEM 2 M a un nuevo tubo de 50 ml cónico. Añadir 20 ml de LB sobre la parte superior, y rápidamente LB lugar + NEM (concentración final de 50 mM) en una plataforma oscilante a 4 º C para mezclar completamente durante 5 min. Siempre añadir NEM / EtOH segunda solución primera y LB, así como para mezclar adecuadamente los dos. </li><li> Retire las neuronas cultivadas de incubadora y el lugar en * hielo. Retire con cuidado los medios de comunicación celular, y suavemente lavar dos veces con frío tampón fosfato salino (PBS) 1x. Añadir 300 ml de LB + 50 mM de NEM a la primera y de las neuronas del hipocampo, y células de rascado de utilizar una grúa móvil utilizable. Se recoge el lisado celular, luego se descarga el lisado en el pozo siguiente de ese grupo. Raspe las células dentro del segundo pozo de utilizar la grúa móvil, recoger y repetir con un tercer pozo, si es necesario concentrar aún más el lisado. </li><li> Recoger en un lisado de células pre-enfriada (en hielo), 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Repita el paso 1.4 con 100 l de LB + 50 mM NEM para recoger el lisado celular restante. Pase lisado celular total a través de una jeringa de calibre 26 ½ 5-6 veces para ayudar en la lisis mecánica, teniendo cuidado de no soplar burbujas en la solución. Una vez puede someter a ultrasonidos durante 15 s en hielo, si el equipo está disponible. Inclinar la cabeza lisado celular para ≥ 30 min a 4 ° C. </li><li> Aclarar la célula lysaTE por centrifugación a 16.000 xg / min 30, con el fin de pellets no lisados ​​células y el material insoluble en detergente. </li><li> Recoger aclaró lisado celular (sobrenadante) en una nueva pre-enfriado tubo de 1,5 ml en hielo. Repita el protocolo de la cosecha para todos los grupos de células. Medida de la concentración de proteínas en todas las muestras de lisado utilizando ensayo de BCA, y normalizar el volumen de todas las muestras de lisado de grupos de células que tienen la proteína total exactamente igual, con un mínimo recomendado de 500 g. Rellene todas las muestras con LB + 50 mM NEM a 500 l volumen total. </li><li> Añadir 1-5 g de anticuerpo primario dirigido contra la proteína diana para cada muestra de lisado. Inclinar la cabeza las muestras de lisado de anticuerpos mixtos durante la noche a 4 ° C. </li></ol> * Neuronas primarias de hipocampo de rata se cultivaron a una densidad de aproximadamente 250.000 células / pocillo en una placa de 6-así, en un medio libre de suero que contienen un suplemento B27 neuronal, como se ha descrito previamente 5, y se cultivaron durante el deseod longitud de tiempo, típicamente 14-16 días-in-vitro (DIV) para alcanzar la madurez. Un mínimo de 500 g de proteína total se recomienda con éxito inmunoprecipitar y biotinilar una proteína diana neuronal, que normalmente requiere de 2-3 pocillos de una placa de 6 pocillos. 2. La precipitación de proteína diana unida al anticuerpo <ol><li> Antes de la precipitación y la inmovilización de una proteína diana, preparar una suspensión al 50% de proteína A o proteína G-Sepharose perlas recubiertas. Específicamente, añadir ≥ 60 l de perlas de sepharose por muestra a tubos de 1,5 ml, asegurándose de que todas las muestras tienen la misma cantidad de perlas. Las perlas magnéticas también son adecuados si el equipo está disponible. </li><li> Añadir un volumen igual de suspensión al 50% a cada muestra de anticuerpo-lisado, y para inclinar la cabeza ≥ 1 hora a 4 ° C. </li></ol> 3. Acil-Biotina Exchange: hidroxilamina (HAM) Escisión <ol><li> Mientras se realiza el paso 2,2, preparar una serie de tubos con tampón de lisis (LB) de diferentes valores de pH. El pH es muy importante para estos pasos y siempre debe ajustarse utilizando un medidor de pH. Preparar 2 ml de LB pH 7,2 por muestra, y 0,5 ml de tampón de estrictos por muestra (Tabla 1). También preparar 0,5 ml de LB + 10 mM NEM por muestra, como en los pasos 1.1-1.3. Añadir PMSF y tabletas de inhibidores de proteasa a todos los tampones de lisis, como en el paso 1,1. </li><li><ol class="lalpha"><li> Hidroxilamina (HAM) es un potente agente reductor, cuya escisión de palmitato de cisteínas se requiere para la biotinilación (Figura 1), y la omisión de la escisión HAM sirve como un control negativo. Dividir cada muestra de perlas en dos muestras, una omitiendo la etapa de escisión HAM (-HAM), y uno que incluye la etapa HAM (+ HAM). Para normalizar la degradación de proteínas causada por el tratamiento HAM, se debe dividir cada muestra en tres partes, con 1/3 de las perlas usadas para el control de la HAM-, y los restantes 2/3 utilizado para el tratamiento HAM +. </li><li> Preparar adicional 1.Tubos de 5 ml en hielo, etiquetados como control de la HAM-para cada muestra. Tras el paso 2.2, suavemente centrifugar todas las muestras de granos &quot;a 0,5 ug / 1 min a 4 ° C (centrífuga a esta velocidad, la duración y la temperatura de todos los pasos que quedan a menos que se indique lo contrario), coloque los tubos en hielo, separar el sobrenadante, y volver a suspender las bolas en 600 l de LB + 10 mM NEM. </li></ol></li><li> Después de resuspender las perlas de muestras »en tampón de lisis + NEM 10 mM, inmediatamente recoger 200 l de lisado de suspensión de perlas de la muestra, y la descarga en la HAM-que muestra el tubo en hielo. Añadir un adicional de 300 l de LB + NEM 10 mM a la muestra de HAM-, y un adicional de 100 l a la muestra HAM + para un total de 500 l en cada muestra. Incubar los tubos durante 10 min en hielo. </li><li> Vuelva a suspender (lavar) el-HAM HAM + muestras y suavemente con 0,5 ml de tampón estrictas, por ejemplo. Realizar este paso rápidamente, como ya incubación SDS resultará en la eliminación del anticuerpo unido de laperlas. </li><li> Lave cuidadosamente todas las muestras tres veces en 0,5 ml / muestra de pH 7,2 LB, y girar hacia abajo entre los mismos, como en 3.2b paso. </li><li> Mientras se realiza el paso 3,5, preparar un tampón de HAM (Tabla 1). Añadir un volumen apropiado de solución de hidroxilamina a un nuevo tubo, para conseguir una concentración final de 1 M en un volumen de 0,5 ml de LB pH 7,2, por muestra + HAM. Siempre preparar el tampón de HAM fresco para el día del experimento. Añadir 0,5 ml / muestra de pH 7,2 a todos LB-HAM muestras, y 0,5 ml / muestra de tampón de HAM a todas las muestras + HAM. </li><li> Inclinar la cabeza todas las muestras durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). No exceda de 1 hora. </li></ol> 4. Acil-Biotina Exchange: Biotina-BMCC Etiquetado <ol><li> Mientras se realiza el paso 3,6, preparar 2 ml de LB pH 6,2 por muestra (Tabla 1), como en el paso 3,1. Coloque el pH 6,2 LB en hielo hasta su utilización. También preparar una solución madre de biotina-BMCC (Tabla 1) inmediatamente antes del uso. Pesar exatemente 2,1 mg de biotina BMCC, recoger en un tubo de 1,5 ml, y suavemente se disuelve en 0,5 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO) al colocar en una plataforma de agitación a temperatura ambiente, para lograr la concentración de 8 mM (no utilizar una pipeta para disolver el polvo ). </li><li> Una vez que se haya completado el paso 3.6, lave cuidadosamente las cuentas una vez en tampón de lisis pH 6,2, para eliminar el tampón HAM residual. Eliminar el sobrenadante y colocar las muestras en hielo. </li><li> Biotina-BMCC es una molécula maliemide biotina conjugado que tiene una alta afinidad por los grupos tiol libres de cisteínas (Figura 1). Mientras se realiza el paso 4,2, preparar 0,5 ml de biotina-BMCC Buffer (Tabla 1) por muestra, a una concentración de trabajo entre 0,5 mM a 5 mM. Las concentraciones en exceso de 5 mM probablemente saturar la proteína diana 6, y típicamente no se debe exceder, sin embargo, esto puede variar dependiendo de la proteína diana deseada. Añadir 0,5 ml de biotina-BMCC tampón a cada muestra, y para inclinar la cabeza exactamente 1 hora a 4 ygrados; C. No exceda de 1 hora. </li></ol> 5. La elución de la proteína diana conjugado con biotina y SDS-PAGE <ol><li> Una vez que se haya completado el paso 4.3, lave cuidadosamente todas las muestras una vez en LB pH 6,2. Mantenga todas las muestras en hielo entre lavados. Eliminar 2x tampón de muestra SDS sin agentes reductores (Tabla 1) de -20 ° C de almacenamiento y descongelar lentamente en hielo. </li><li> Lave cuidadosamente las muestras tres veces en LB pH 7,5 + PMSF / inhibidores y mantener las muestras en hielo entre lavados. </li><li> Eliminar el sobrenadante del tercer lavado, dejando las perlas sedimentaron en una suspensión con tampón que queda en el fondo del tubo. Sumerja una pipeta con una punta de diámetro pequeño (una punta de carga de gel o punta de pipeta P2 son suficientes) en la parte inferior del tubo a través de la suspensión, y rápidamente recoger el buffer restante, teniendo cuidado de no ocupar ningún perlas. </li><li> Complementa la 2x tampón de muestra SDS con DL-ditiotreitol (DTT) para conseguir una concentración final de 5 mM. Añadir40-50 l de tampón de muestra 2x + DTT 5 mM a cada muestra. Si es necesario, las perlas de vórtice para mezclar completamente con el tampón de muestra, e inmediatamente se centrifuga a alta velocidad para recoger todas las perlas en una pastilla, sumergidos en tampón de muestra. </li><li> Hervir todas las muestras durante 10 minutos a 75-80 ° C. Deje enfriar las muestras a temperatura ambiente durante ≥ 10 minutos sobre mesa de trabajo, y se centrifuga a 16.000 xg / 3 min a pellets totalmente las cuentas. </li><li> Añadir el volumen completo de la proteína eluida (sobrenadante) de cada muestra a un solo carril en un gel de poliacrilamida adecuado para el Western Blot, utilizando SDS-PAGE 7. Organizar todas las muestras de modo que el HAM-eluyente control y eluyente HAM + para una sola muestra se ejecutan inmediatamente adyacentes uno a otro durante SDS-PAGE (Fig. 2). Después de SDS-PAGE, transferencia a una membrana de nitrocelulosa o PVDF. </li></ol> 6. Transferencia de Western y detección de palmitoilación de la proteína diana <ol><li> Una vez que se haya completado el paso 5.6, lavar la membranados veces en tampón Tris-solución salina (TBS 1x) durante 10 min en una plataforma de agitación a TA. </li><li> Preparar un tampón de bloqueo para bloquear no específicas etiquetado pesando albúmina de suero bovino (BSA), para lograr 3% en peso en un volumen de TBS 1x + Tween-20 al 0,05% (TBS-T) que es suficiente para sumergir completamente la membrana . Para estreptavidina secante, siempre bloquear con BSA y no leche en polvo. Bloquear la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente en una plataforma oscilante. </li><li> Preparar una solución de anticuerpos de TBS-T + 0,3% BSA. Añadir estreptavidina-HRP anticuerpo reconstituido en 1 mg / ml en agua destilada, se diluyó en 1:5,000-1:10,000. Una vez que se ha completado el paso 6,2, lavar la membrana una vez en TBS-T durante 10 min, a continuación, incubar la membrana en solución de anticuerpo de estreptavidina en una plataforma oscilante, ya sea para durante 1 hora a RT, o durante la noche a 4 ° C. </li><li> Se lava la membrana tres veces en TBS-T durante 10 minutos en una plataforma oscilante. Con el fin de detectar la señal de palmitoilación, exponer la luminiscencia HRP utilizando un chemkit sustrato iluminescent. </li><li> Con el fin de normalizar los niveles de palmitoylation a la cantidad de la proteína de interés que se inmunoprecipitó, tira de la membrana utilizando tampón de extracción blot occidental durante 5-10 min en una plataforma de agitación a TA. Repita los pasos 6,1 a 6,4 utilizando el anticuerpo primario contra la proteína de interés que se utilizó originalmente para la inmunoprecipitación. </li><li> Cuantificar palmitoilación de la proteína de interés utilizando el software de análisis de imagen, y normalizar los niveles de palmitoylation a la cantidad de proteína inmunoprecipitada. </li></ol>

<ol><li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 161-175 (2010).</li>
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<li>Ho, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-Nitrosylation+and+S-Palmitoylation+Reciprocally+Regulate+Synaptic+Targeting+of+PSD-95%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">S-Nitrosylation and S-Palmitoylation Reciprocally Regulate Synaptic Targeting of PSD-95.</a> Neuron. 71, 131-141 (2011).</li>
<li>Iwanaga, T., Tsutsumi, R., Noritake, J., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+protein+palmitoylation+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic protein palmitoylation in cellular signaling.</a> Prog. Lipid Res. 48, 117-127 (2009).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El ensayo de IP-ABE se presenta aquí es un método simple y altamente sensible para la detección de proteínas palmitoiladas en neuronas del hipocampo cultivadas primarias, utilizando técnicas bioquímicas estándar en su mayoría. Esto hace que el ensayo fácilmente adaptable para los laboratorios ya equipados con Western Blot materiales. El ensayo de IP-ABE combina un protocolo de inmunoprecipitación estándar para aislar e inmovilizar la propia proteína diana, seguido por la química descrita anteriormente ABE 2-4 para detectar rápidamente los niveles de palmitato en una proteína sustrato. La técnica ABE tiene una amplia gama de aplicaciones para examinar las proteínas palmitoiladas en diversos tejidos y líneas celulares, incluyendo la gran palmitoil-proteómico de detección de perfiles palmitoylation globales, y la rápida detección de los niveles de palmitoylation de una proteína diana única. Descripciones anteriores de ABE química han utilizado métodos de lisis celular diferente y extracción con detergente de prot neuronaleins 2, 9, tiol libre bloqueo 10, 11, biotinilación, y la purificación de la proteína diana 4, dependiendo de la aplicación del experimento. La adición de palmitato a los resultados de proteínas neuronales en su orientación hacia las membranas celulares, y la detección de la fracción palmitoylated de una proteína diana requiere su extracción a partir de estas membranas. Metodologías previamente descritas ABE han utilizado una variedad de 9 iónico y detergentes no iónicos 8 para extraer las proteínas diana deseadas, y el uso de un detergente en particular depende de la proteína diana y su tráfico de membrana conocida. Aquí, utilizamos la no desnaturalizante y detergente no iónico Igepal CA-630 para extraer las proteínas palmitoiladas, que se han validado para la extracción y detección de la proteína neuronal palmitoylated δ-catenina (Figura 2). La estructura de IGEPAL CA-630 incluye una voluminosos y rígidos no polar grupo de cabeza que no seinterrumpir conformación de la proteína nativa o interacciones, pero que permite su asociación con las regiones hidrofóbicas de las proteínas asociadas a la membrana, lo que confiere a la miscibilidad, y permitir su extracción. Muchas proteínas neuronales localizado en la membrana sináptica o post-sináptica densidad de las sinapsis debe ser extraído por medio de IGEPAL CA-630, sin embargo, algunos no pueden solubilizar completamente, y puede requerir el uso de un diferente no desnaturalizante detergente como Triton X-100, que tiene sido previamente utilizado para ABE química 2, 8. Varias descripciones de ABE química también han utilizado un diferente reactivo con tiol reactivo de biotinilación de la molécula como se describe aquí, llamada biotina-HPDP (Thermo Scientific), que también requiere un medio diferente de la purificación de proteínas 4. Biotina-HPDP es otro reactivo con tiol, maliemide conjugado molécula de biotina que contiene un enlace disulfuro en el brazo de unión maliemide, estructuralmente differentiating que a partir de biotina-BMCC, que no contenga este enlace disulfuro. Después de tiol-biotinilación de cisteína libre o palmitoylated de una proteína por biotina-HPDP, el enlace disulfuro resultante entre la proteína diana y el grupo de biotina puede ser escindido por la reducción de los reactivos para liberar el grupo biotina y regenerar la proteína en su forma no modificada, haciendo biotinilación por biotina-HPDP transitoria y reversible. Por lo tanto, el uso de este reactivo de biotinilación requiere la purificación de una proteína diana por reactivos de avidina inmovilizada, tales como perlas recubiertas con estreptavidina. Sin embargo, tiol-biotinilación de una proteína diana por biotina-BMCC, como se describe aquí, es estable y relativamente permanente, y requiere la purificación de la proteína diana por un anticuerpo dirigido contra el objetivo, y se inmovilizó en perlas de sefarosa. Ambas técnicas de EBA han sido utilizados previamente para grandes pantallas, y la detección de palmitoilación de proteínas individuales 2, 8-10, 12, y elIP-ABE ensayo como se describe aquí es óptimo para la detección rápida de palmitoylation de un solo objetivo proteínas neuronales. Una abrumadora mayoría de palmitoilación celular implica la adición reversible de palmitato al grupo tiol de las cisteínas (denominado S-palmitoilación, que se generaliza como &quot;palmitoilación &#39;en este protocolo), sin embargo un grupo muy limitado de proteínas se someten a palmitoilación irreversible en glicina y residuos de cisteína a través de la formación de enlaces de amida estables, denominado N-palmitoilación 13. Una limitación de ABE química es su incapacidad para detectar N-palmitoilación debido a la estabilidad del enlace amida, y así que la revisión de una proteína nueva diana para palmitoilación debe confirmarse utilizando 3H-palmitato marcado metabólico 1. Como se mencionó previamente, el ensayo de IP-ABE puede adaptarse fácilmente para el examen de palmitoilación en extractos de proteínas a partir de múltiples fuentes, incluyendo transfected líneas celulares, tejidos heterólogos primaria y cultivos primarios de neuronas de regiones cerebrales múltiples. El ensayo de IP-ABE se ha utilizado para examinar la suficiencia de palmitoilación mutados cisteína-a-serina proteínas para identificar la ubicación de una cisteína palmitoylated a lo largo de una proteína diana 8, para el examen de rotación palmitato dinámica de las proteínas sinápticas en neuronas cultivadas bajo condiciones basales 10, y cambios en los niveles palmitoylation de proteínas neuronales después de la inducción de la actividad neuronal 9. La sensibilidad y la capacidad de adaptación de la prueba IP-ABE hacen ideal para el examen de los perfiles palmitoylation de las proteínas neuronales, y óptima para la detección de los cambios dinámicos en palmitoylation.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> IGEPAL CA-630 </td><td> Sigma </td><td> I8896 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Fluka </td><td> 93482 </td><td></td></tr><tr><td> Inhibidor de la proteasa Cocktail </td><td> Roche Complete Mini </td><td> 11 836 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> NEM </td><td> Sigma </td><td> E3876 </td><td></td></tr><tr><td> HAM solución </td><td> Sigma </td><td> 46780-4 </td><td></td></tr><tr><td> BCA Protein Assay Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td><td> Asegurar la compatibilidad con detergente elegido </td></tr><tr><td> Proteína G / A recubierto con perlas de sefarosa </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-6002-35 </td><td></td></tr><tr><td> Biotina-BMCC </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21900 </td><td></td></tr><tr><td> Estreptavidina-HRP </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21126 </td><td> Reconstituir a 1 mg / ml en agua </td></tr><tr><td> Western Blot Stripping Buffer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21059 </td><td></td></tr></tbody></table>

la detección de palmitoilación proteínas en neuronas del hipocampo cultivadas por inmunoprecipitación e intercambio acyl-biotina (abe)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoilación es una modificación post-traduccional de lípidos que implica la unión de un 16-carbono ácidos grasos saturados, palmitato, a residuos de cisteína de las proteínas sustrato a través de un enlace lábil tioéster [revisado en 1]. Palmitoilación de un sustrato de la proteína aumenta su hidrofobicidad, y típicamente facilita su tráfico hacia las membranas celulares. Estudios recientes han demostrado palmitoilación a ser una de las modificaciones lipídicas más comunes en las neuronas 1, 2, lo que sugiere que la rotación de palmitato es un mecanismo importante por el cual estas células regulan la focalización y el tráfico de proteínas. La identificación y detección de sustratos palmitoiladas por lo tanto puede mejorar nuestra comprensión de tráfico de proteínas en las neuronas. Detección de palmitoilación de proteínas en el pasado ha sido técnicamente impedida debido a la falta de una secuencia de consenso entre proteínas de sustrato, y la dependencia de la metabólico labeling de proteínas con palmitoil-3 H-palmitato, un ensayo bioquímico que consume tiempo con baja sensibilidad. Desarrollo de la acil-Biotina Exchange (ABE) de ensayo permite detectar sensibilidad más rápida y elevada de proteínas palmitoylated 2-4, y es óptimo para medir el volumen de negocios dinámico de palmitato de las proteínas neuronales. El ensayo de ABE se compone de tres pasos bioquímicos (Figura 1): 1) bloqueo irreversible de no modificados grupos cisteína tiol utilizando N-ethylmaliemide (NEM), 2) la escisión específica y desenmascaramiento del grupo tiol de la cisteína palmitoylated de por hidroxilamina (HAM), y 3) el etiquetado selectivo de la cisteína palmitoylated utilizando un reactivo de biotinilación reactivo con tiol, biotina-BMCC. La purificación de las proteínas tiol biotina siguiendo los pasos de EBA ha variado, dependiendo del objetivo general del experimento. Aquí se describe un método para purificar una proteína de interés en palmitoylated hippocamp primariaal neuronas por una inmunoprecipitación inicial (IP) paso utilizando un anticuerpo dirigido contra la proteína, seguido por el ensayo de ABE y el Western Blot para medir directamente los niveles de palmitoylation de que la proteína, que se denomina el ensayo de IP-ABE. Baja densidad cultivos de neuronas de hipocampo de rata embrionarias se han utilizado ampliamente para estudiar la localización, función, y el tráfico de proteínas neuronales, lo que hace que sean especialmente adecuados para el estudio de palmitoilación de proteínas neuronales utilizando el ensayo de IP-ABE. El ensayo de IP-ABE requiere principalmente IP estándar y reactivos occidentales secante, y sólo está limitado por la disponibilidad de anticuerpos contra el sustrato diana. Este ensayo puede ser fácilmente adaptado para la purificación y detección de proteínas palmitoiladas transfectadas en cultivos de células heterólogas, cultivos neuronales primarios derivados de los tejidos cerebrales distintas de ratón y de rata, y el tejido cerebral incluso primaria misma.

El ensayo de IP-ABE detecta específicamente tiol palmitoilación de residuos de cisteína a lo largo de proteínas de sustrato, y se puede utilizar para detectar palmitoilación de inmunoprecipitadas proteínas neuronales de una manera representada en la figura 1. Tratamiento de la proteína inmunoprecipitada neuronal con HAM (Figura 1) escinde el enlace tioéster entre el palmitato y el grupo tiol de una cisteína, permitiendo la incorporación específica de biotina-BMCC en el grupo tiol disponible recientemente, que puede ser detectado posteriormente utilizando el Western Blot. La omisión de HAM (minus-HAM) escisión evita la incorporación de biotina-BMCC y funciona como un control negativo para específico palmitoil-biotinilación de la muestra más el HAM-, y por lo tanto debe ser siempre de forma adyacente a la de la muestra más-HAM para el oeste secante por SDS-PAGE (Figura 2). En un experimento optimizado (Figura 2A), la palmitoilaciónseñal de la proteína neuronal δ-catenina 2 puede ser fácilmente detectado por inmunotransferencia para la biotina-BMCC a una concentración de 1 mM, utilizando estreptavidina conjugada con HRP, contra muestras paralelas minus-plus y HAM-. La señal de palmitoilación específico para δ-catenina aparece con el tamaño predicho de 160kD, sólo en la muestra más-HAM. La especificidad de esta señal fue confirmada por reprobing para δ-catenina con el anticuerpo específico que se usó inicialmente para inmunoprecipitar, resulta en una señal en ambos tratamientos Ham en el mismo tamaño predicho. Optimización del ensayo de IP-ABE (Figura 2A) dará lugar a un perfil de transferencia de Western de una muestra menos HAM-que es fácilmente distinguible de la de la muestra más-HAM, y exhibe mínima a ninguna señal de palmitoilación. La concentración de biotina-BMCC utiliza para etiquetar cisteínas palmitoiladas requiere la optimización cuidadosa, y si una super-saturación concentración de biOtin-BMCC se utilizan durante las etapas de química ABE (Figura 2B), el fondo excesivo y las señales no específicas serán visibles. Una curva de respuesta lineal para la biotinilación de una proteína palmitoylated neuronal, el receptor nicotínico de la acetilcolina α7, usando biotina-BMCC ha sido determinado previamente 6, y muestra cerca de la saturación completa a una concentración de 5-10 mM. Aunque la concentración óptima de biotina-BMCC se desviará ligeramente en función de la proteína diana neuronal, el tratamiento con biotina-BMCC en una concentración en exceso de 5 mM probablemente super-saturar la proteína diana, y el resultado en un perfil de transferencia de western con el fondo visible y señales no específicas. Una concentración de 0,5 mM para la biotina-BMCC se utilizó anteriormente para detectar palmitoilación de otras proteínas neuronales incluyendo SNAP-25, huntingtina, subunidades del receptor de AMPA y GluA2 Glu-A1, y paralemmin 8, y la determinación de la concentración óptima para una novelaproteína diana puede realizarse por ensayo y error en forma lineal, comenzando en el intervalo de 0.5-5 mM que describimos aquí. Los perfiles resultantes estreptavidina mancha occidental entre las muestras menos y más para HAM-δ-catenina palmitoylation parecen similares cuando se trataron con 4 BMCC biotina (Figura 2B), m con señales de fondo adicionales en diferentes tamaños, lo que indica que biotinilación inapropiado ocurrido. La hidroxilamina es un potente agente reductor que resulta en la degradación limitada de la proteína diana, además de su escisión eficaz de tioéster de ligamiento. Por consiguiente, la optimización de ABE química requiere una a normalizar la cantidad de proteína inmunoprecipitada utilizado para las muestras minus-plus y HAM-(pasos desde 3,2 hasta 3,3). La normalización implica el uso de la doble de la cantidad de la proteína diana inmovilizada en la plus-vs la muestra minus-HAM, que da lugar realmente a wester indistinguiblesn secante perfiles para la proteína diana, como se muestra para δ-catenina (Figura 2A, B). Sin embargo, si la cantidad de proteína diana inmovilizada no se normaliza entre muestras minus-plus y HAM-, la señal resultante de Western blot para la proteína diana en la muestra más-HAM puede perderse, como se muestra para δ-catenina cuando cantidades iguales de proteína se utilizaron en ambos tratamientos Ham (Figura 2C). La especificidad de la ABE química para el etiquetado de proteínas palmitoylated es muy sensible y requiere de la optimización. Las trampas comunes encontradas durante el ensayo de IP-ABE incluyen los resultados sub-óptimos que se muestran en las Figuras 2B y 2C, y la degradación de la proteína diana, independientemente del tratamiento HAM, que son causadas típicamente por mayores reactivos y tampones, y pH correctos. Con el fin de evitar estos problemas y para corregir sub-óptima química ABE, la frescura y la concentración de los reactivos necesarios para labuffers listados en la Tabla 1 siempre debe ser examinado, y los ajustes del pH de todas las memorias intermedias siempre se debe comprobar antes de ejecutar el experimento. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Buffer </td><td> Concentración de Trabajo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Lysis Buffer (LB) </td><td> En destilada H 2 O: 1% IGEPAL CA-630 50 mM Tris-HCl pH 7,5 150 mM NaCl Glicerol 10% </td><td> N / A </td><td> Preparar antes del experimento y se almacenan a 4 ° C </td></tr><tr><td> NEM Solution </td><td> En EtOH al 100%: polvo liofilizado NEM </td><td> 2 M </td><td> Preparar fresco, inmediatamente antes de su uso. </td></tr><tr><td> Buffer estricta </td><td> En LB: 10 mM MEM 0,1% de SDS </td><td> N / A </td><td> Prepare poco antes de su uso, mantener en hielo. </td></tr><tr><td> LB pH 7,2 </td><td> En LB: Ajustar el pH a 7,2 exactamente </td><td> N / A </td><td> Use un medidor de pH para ajustar el pH inmediatamente antes de su uso. </td></tr><tr><td> HAM Buffer </td><td> En LB pH 7.2: Solución madre HAM </td><td> 1 M (concentración final de HAM) </td><td> Preparar inmediatamente antes de su uso. </td></tr><tr><td> LB pH 6,2 </td><td> En LB: Ajustar el pH a 6,2 exactamente </td><td> N / A </td><td> Igual que para pH 7,2 LB </td></tr><tr><td> De la biotina BMCC Solution </td><td> En DMSO: 2,1 mg Biotina-BMCC solución </td><td> 8 mM </td><td> Preparar inmediatamente antes de su uso. </td></tr><tr><td> Biotina-BMCC Buffer </td><td> En LB pH 6,2: Añadir biotina BMCC solución </td><td> 1 a 5 M (final de biotina-BMCC concentración) </td><td> Preparar inmediatamente antes de su uso. </td></tr><tr><td> 2x SDS muestra de amortiguación, sin agentes reductores </td><td> En destilada H 2 O: 5% SDS 5% Glicerol 125 mM Tris-HCl pH 6,8 0,01% azul de bromofenol </td><td> N / A </td><td> Preparar antes del experimento, y se almacena a -20 ° C hasta su uso. Suplemento con DTT 5 mM antes de su uso. </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Los tampones y reactivos requeridos para el ensayo de IP-ABE. Muchos de los tampones de lisis se pueden preparar antes de comenzar el experimento, sin embargo el pH debe comprobarse y ajustarse inmediatamente antes de su uso con un medidor de pH, para asegurar el éxito de la química ABE. La mayoría de las soluciones madre deben prepararse de nuevo para cada experimento, inmediatamente antes de su uso. Muchos de los tampones requieren reactivos comunes a la mayoría de los laboratorios equipados para la bioquímica, y reactivos de la especialidad con la información del proveedor se enumeran en la tabla de reactivos y equipos. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1highres.jpg" /> Figura 1. Esquema de la inmunoprecipitación y acil-Biotina análisis de intercambio (IP-ABE) para purificar y detectar palmitoilación de proteínas neuronales. Neuronas del hipocampo cultivadas son lisadas, (1) una proteína diana se purifica a continuación usando un anticuerpo específico de diana, y inmovilizada sobre Sepharose perlas recubiertas con proteína G o A. La proteína diana purificada es entonces (2) se trató con N-ethylmaliemide (NEM) para unirse irreversiblemente y bloquear libres tiol (-SH) a lo largo de cisteínas no modificado (C). La proteína diana es entonces (3) sometido a tratamiento con hidroxilamina (HAM), resultando en la escisión específica de enlaces tioéster en cisteínas palmitoiladas y el desenmascaramiento de un grupo libre de palmitoylated tiol (-SH). A continuación, la proteína diana es (4) treated con una molécula de biotina reactivo con tiol, biotina-BMCC, resultando en la biotinilación específica de la cisteína palmitoilada. Por último, (5) la proteína diana biotinilado se eluye y se elimina del anticuerpo y el talón. La proteína diana con su palmitoylated cisteína (s) marcado con biotina ahora es adecuada para electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) y Western Blot con estreptavidina para detectar por palmitoylation de la proteína purificada neuronal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2highres.jpg"/> Figura 2. Detección de palmitoilación de la proteína neuronal δ-catenina usando el ensayo de IP-ABE. Neuronas primarias de hipocampo de rata se cultivaron como antesriormente descrito 5, a una densidad de 130 células / mm 2 hasta la madurez a los 14DIV, se lisaron entonces, y se sometió al ensayo de IP-ABE para detectar palmitoilación de un sustrato recientemente identificado palmitoilada neuronal, δ-catenina 2. Purificada inmunoprecipitados (IP) de δ-catenina (proteína diana) se aislaron utilizando 5 g de δ-catenina anticuerpo por muestra (BD Transducción Laboratories), y se sometieron luego a SDS-PAGE en paralelo minus-y más-hidroxilamina (HAM) muestras. Palmitoilación se detectó por Western Blot (WB) con estreptavidina-HRP (palmitoilación), y la membrana fue despojado y se sometió a un WB reprobe para δ-catenina. (A) Un representante optimizado IP-ABE resultado para palmitoylated δ-catenina (punta de flecha) tratados con 1 mM biotina-BMCC, que ilustra la especificidad de ABE química para la detección de tiol-palmitoiladas proteínas a partir de muestras de PI. (B) Un representante sub-óptimasentante IP-ABE resultado de δ-catenina, en el que se utiliza un exceso de concentración de 4 mM biotina-BMCC, resultando en señales no específicas y el fondo en ambas muestras minus-plus y HAM-(flechas). (C) Otro representante sub-óptima IP-ABE WB para δ-catenina, donde se utilizó una excesiva concentración de 4 mM de biotina-BMCC, y la cantidad de proteína utilizada para la muestra más el IP-HAM no se normalizó para la HAM mediada la degradación de proteínas, resultando en una pérdida de señal en el WB para reprobe δ-catenina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> .

La adición de palmitato reversible a las proteínas es un importante regulador de tráfico intracelular de proteínas. Esto es de particular interés en las neuronas donde muchas proteínas sinápticas se palmitoilada. Nosotros utilizamos un método simple bioquímico para detectar proteínas palmitoiladas en las neuronas cultivadas, que pueden ser adaptados para múltiples tipos de células y tejidos.

La detección de palmitoilación proteínas en neuronas del hipocampo cultivadas por inmunoprecipitación e Intercambio Acyl-Biotina (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar y detectar proteínas neuronales relacionadas con poid a partir de neuronas cultivadas mediante un ensayo bioquímico simple y adaptable. Esto se logra extrayendo e inmovilizando la proteína objetivo en presencia de etilo o NEM para asegurar el bloqueo de todos los grupos tiol libres. El segundo paso es tratar la proteína diana inmovilizada con hidroxilo medio o jamón, para escindir el enlace tioéster entre el residuo de cisteína palmeada y la molécula de palmitato.Esto libera el grupo de estilo de cistina palmeada y lo hace disponible para el etiquetado en el tercer paso. La proteína diana inmovilizada se incuba con biotina B-M-C-C-A fichero molécula específica marcada con biotina, esta biotina elates y marca, el grupo Thile que originalmente era pyl. El paso final es detectar el nivel de pación de la proteína diana mediante la página SDS y la transferencia occidental para Strp Aden.En última instancia, el ensayo IP A BE se utiliza para mostrar los niveles del palmitato lipídico unido de forma reversible a una proteína diana neuronal, y también puede detectar cambios sutiles en las proteínas diana. Niveles de pación. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la detección de proteínas, la mutilación de la palma de la mano mediante el marcaje metabólico con el rasgo A palmado, es que el ensayo de intercambio de acil biotina es más sensible y requiere menos tiempo.El ensayo A BE también permite estimaciones más cuantitativas de la mutilación de la palma y es óptimo para detectar pequeños cambios en los niveles de mutilación de la palma. Aunque este método puede proporcionar información sobre la identificación de proteínas palmeadas y neuronas del hipocampo cultivadas, también se puede aplicar a otros sistemas, como cultivos neuronales primarios de otras regiones cerebrales, líneas celulares heterólogas e incluso tejidos primarios. Para comenzar la extracción de la proteína diana de las neuronas primarias del hipocampo cultivadas, prepare el tampón de lisis y la solución de NEM como se describe en el procedimiento escrito que acompaña a este video.A continuación, combine el tampón de lisis y la solución de NEM añadiendo 0,5 mililitros de solución de NEM de dos molares a un tubo cónico nuevo de 50 mililitros. Agregue 20 mililitros de tampón de lisis por encima. Siempre agregue primero la solución de etanol NEM y luego el tampón de lisis, para mezclar adecuadamente los dos en una cámara fría de cuatro grados centígrados, coloque rápidamente la mezcla en una plataforma oscilante para mezclar completamente durante cinco minutos.Retire las neuronas primarias cultivadas del hipocampo de rata de la incubadora, instrucciones sobre cómo cultivar. Las neuronas se pueden encontrar en el texto después de colocar las neuronas cultivadas en hielo. Retire con cuidado los medios celulares.Lave suavemente las neuronas dos veces con solución salina fría tamponada con fosfato. A continuación, agregue 300 microlitros de tampón de lisis más 50 milimolares NEM al primer pocillo de neuronas del hipocampo y raspe las células con un elevador de células desechable. Recoja el lisado celular y luego descargue el lisado en el siguiente pocillo de ese grupo.Raspe las celdas dentro del segundo pocillo con el elevador de celdas. Recoja y repita usando un tercer pocillo si es necesario. Para concentrar aún más el lisado, recoja el lisado celular en un tubo de microcentrífuga preenfriado de 1,5 mililitros.Agregue 100 microlitros de tampón de lisis más 50 milimolares NEM al primer pocillo y repita el proceso de raspado de soldadura para recolectar cualquier lisado celular restante. Pase el lisado celular total a través de una jeringa de calibre 26 y medio cinco o seis veces para ayudar en la lisis mecánica. Tenga cuidado de no soplar burbujas en la solución.Mutar el lisado celular durante al menos 30 minutos a cuatro grados centígrados después de la centrifugación. Recoja el lisado celular aclarado en un nuevo tubo de preenfriamiento de 1,5 mililitros en hielo. Repita el protocolo de recolección demostrado para todos los grupos de células.Mida la concentración de proteínas en todas las muestras de lisado utilizando el ensayo BCA. Según las instrucciones del fabricante. Normalice el volumen de todas las muestras de lisado de grupos de células para que tengan exactamente la misma proteína con un mínimo recomendado de 500 microgramos.Rellene todas las muestras con tampón de lisis más 50 milimolares NEM hasta 500 microlitros de volumen total. A continuación, añada de uno a cinco microgramos de anticuerpo primario dirigido contra la proteína objetivo a cada muestra de lisado. Mutar las muestras mezcladas de lisado de anticuerpos durante la noche a cuatro grados centígrados antes de precipitar e inmovilizar una proteína objetivo.Prepare una suspensión al 50% de proteína A o proteína G recubierta de SRO velocidades como se describe en el protocolo escrito. Como paso final, agregue un volumen igual de 50% de lodo a cada muestra de lisado de anticuerpos y mute durante al menos una hora a cuatro grados Celsius. Al realizar el ael, el intercambio de pH y temperatura adecuados de todos los tampones y reactivos, así como su frescura, son fundamentales.Para asegurar el éxito del experimento. Comenzar el corte del jamón con la preparación de una serie de tubos con tampón de lisis de diferentes phs. El pH es muy importante para estos pasos y siempre debe ajustarse.Usando un medidor de pH por muestra, prepare dos mililitros de tampón de lisis pH 7.2 y 0.5 mililitros de tampón estricto preparado en tampón de lisis. Prepare también 0,5 mililitros de tampón de lisis más 10 milimolares NEM por muestra. AGREGUE PMSF y tabletas inhibidoras de proteasa a todos los tampones de lisis.La hidroxilo media o jamón se utiliza para escindir el enlace tioéster entre la cisteína palmeada y el ácido graso palmitato. Esto es esencial para liberar el grupo de estilo de cisteína palmeada y hacerlo disponible para el etiquetado con biotina. Por lo tanto, la omisión del escisión del jamón puede servir como un útil control negativo.Prepare tubos adicionales de 1,5 mililitros en hielo etiquetados como control de jamón negativo para cada muestra después de la incubación del anticuerpo con el lisado celular. Y luego, con las perlas, centrifugar suavemente todas las perlas de muestra a 0,5 veces G durante un minuto a cuatro grados centígrados con los tubos en hielo. Retirar el sobrenadante y resus: suspender las perlas en 600 microlitros de tampón de lisis más 10 milimolares NEM.Después de que Resus suspenda todas las perlas de muestra, recoja inmediatamente 200 microlitros de la suspensión de perlas de lisado de las muestras y descárguelas en el tubo de jamón negativo de esa muestra con hielo, dejando 400 microlitros de la suspensión de perlas de lisado de cada muestra en el tubo para la muestra de jamón plus. Esto se debe a la degradación limitada de la proteína objetivo causada por el tratamiento del jamón. Un tercio de las cuentas se utilizan para el tratamiento de jamón menos y los dos tercios restantes se utilizan para el tratamiento de jamón plus.Agregue 300 microlitros adicionales de tampón de lisis más 10 milimolares NEM a la muestra de jamón negativo. Pipetear 100 microlitros adicionales a la muestra de jamón plus para un total de 500 microlitros en cada muestra. Incubar los tubos durante 10 minutos en hielo y luego proceder a lavar las muestras de jamón menos y más como se describe en el procedimiento escrito después del lavado de la muestra a 0,5 mililitros por muestra de tampón de lisis pH 7,2 a todas las muestras de jamón menos.Agregue 0,5 mililitros por muestra de tampón de jamón a todas las muestras de jamón plus. A continuación, mute todas las muestras durante una hora a temperatura ambiente. No exceder de una hora después del tratamiento con jamón.Realice el intercambio de acil biotina mediante el etiquetado de biotina BMCC como se discutió en el procedimiento escrito. Una vez que se complete el etiquetado de la biotina BMCC, lave suavemente las muestras como se describe en el texto. Retire el sobrenadante del lavado final, dejando las perlas peletizadas en una suspensión con tampón restante en el fondo del tubo.Sumerja una pipeta con una punta de pequeño diámetro en el fondo del tubo a través de la suspensión y recoja rápidamente cualquier tampón restante. Teniendo cuidado de no coger ninguna cuenta. Agregue de 40 a 50 microlitros de dos tampones de muestra más cinco milimolares DTT a cada muestra.Si es necesario. Agite las perlas para mezclarlas completamente con el tampón de muestra e inmediatamente centrifugar a alta velocidad para recoger todas las perlas en un gránulo sumergido en tampón de muestra. Después de hervir las muestras y centrifugar de nuevo, agregue el volumen completo de proteína eludida en el sobrenadante de cada muestra a un solo carril dentro de un gel de poliacrilamida adecuado para Western blot.Usando la página SDS, organice todas las muestras de modo que el menos jamón control elu y más jamón elu para una sola muestra se ejecuten inmediatamente adyacentes entre sí. Durante la página de la SDS tras la página de la SDS transferida a la membrana A-P-V-D-F o NITROCELULOSA, comience el Western blot con lavado y bloqueo como se describe en el procedimiento escrito, prepare una solución de anticuerpos de TBST más 0.3% de BSA, agregue el anticuerpo estreptavidina HRP, que se ha reconstituido a un miligramo por mililitro en agua destilada. Lave la membrana una vez en TBST durante 10 minutos.A continuación, incubar la membrana en una solución de anticuerpos STREPTAVIDIN en una plataforma oscilante durante una hora a temperatura ambiente o toda la noche a cuatro grados centígrados. Lave la membrana tres veces en TBST durante 10 minutos en una plataforma mecedora. Con el fin de detectar la señal de pación, se exponga la luminiscencia HRP utilizando un kit de sustrato quimioluminiscente con el fin de normalizar los niveles de pación a la cantidad de la proteína de interés que se inmunoprecipitó.Pele la membrana con un tampón de extracción Western blott durante cinco a 10 minutos en una plataforma mecedora a temperatura ambiente. Repita los pasos de Western blot utilizando el anticuerpo primario contra la proteína de interés que se utilizó originalmente para la inmunoprecipitación. Cuantifique la pación de la proteína de interés utilizando un software de análisis de imágenes y normalice los niveles de pación a la cantidad de proteína inmunoprecipitada.El ensayo I-P-A-B-E detecta específicamente la filtración de residuos de cistina a lo largo de las proteínas del sustrato y puede utilizarse para detectar la pación de proteínas neuronales inmunoprecipitadas. Tratamiento de la proteína neuronal inmunoprecipitada con cortes de jamón, el enlace tioéster entre el palmitato y el grupo Sixtine Thal permite la incorporación específica de biotina BMCC en el nuevo grupo de archivos disponible, que puede detectarse posteriormente mediante Western blot. La omisión de la escisión del jamón impide la incorporación de biotina BMCC y funciona como un control negativo para la biotina específica de la muestra de jamón plus.Por lo tanto, el control de jamón negativo siempre debe ejecutarse junto a la muestra de jamón positivo para la transferencia de Western blot por página SDS. En un experimento optimizado, la señal de pación de la proteína neuronal delta catenina se puede detectar fácilmente mediante transferencia de biotina BMCC a una concentración de un micromolar utilizando estreptavidina conjugada con HRP contra muestras paralelas de jamón menos y más. La señal de pación específica para delta Kain aparece en su tamaño previsto de 160 kilodaltons solo en la muestra de mano plus.La especificidad de esta señal se confirmó mediante el resondeo de delta CATENINA con el anticuerpo específico que se utilizó inicialmente para inmunoprecipitar, lo que resultó en una señal en ambos tratamientos con el mismo tamaño predicho. La optimización del ensayo I-P-A-B-E dará como resultado un perfil de Western blot de una muestra de jamón negativo que se distingue fácilmente de la muestra de jamón plus y exhibe una señal de pación mínima o nula. La concentración de biotina BMCC utilizada para marcar las CISTINAS PALMADAS requiere una optimización cuidadosa y si se utiliza una concentración supersaturante de BMCC de biotina durante los pasos químicos de A BE, se verán señales de fondo excesivas e inespecíficas.Los perfiles de ávido rayado en manchas occidentales resultantes entre las muestras de jamón menos y más para la mutilación de delta catine y palma parecen similares cuando se tratan con cuatro micromolares de biotina BMCC con señales de fondo adicionales en diferentes tamaños, lo que indica que se produjo una biotina inapropiada. Debido a que la hidroxilamina es un potente agente reductor que da como resultado una degradación limitada de la proteína objetivo, es necesario normalizar la cantidad de proteína inmunoprecipitada utilizada para muestras de jamón menos y más. La normalización requiere el uso del doble de la cantidad de proteína diana inmovilizada en la muestra de jamón más que en la muestra de jamón menos, lo que da lugar a perfiles de Western blot indistinguibles para la proteína objetivo, como se muestra para la catenina delta.Sin embargo, si la cantidad de proteína diana inmovilizada no se normaliza entre las muestras de jamón menos y más, la señal de Western blot resultante para la proteína objetivo en la muestra de jamón más puede perderse, como se muestra para la catenina delta cuando se utilizaron cantidades iguales de proteína en ambos tratamientos con jamón. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer la proteína neuronal elegida de las neuronas del hipocampo cultivadas. Utilizar una química BE para detectar si se trata de un sustrato para la mutilación de la palma en un tiempo mínimo y ser capaz de adaptar este protocolo para su uso en otras líneas celulares y tejidos.

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Ubiquitinación es una modificación postraduccional clave llevadas a cabo por un conjunto de tres enzimas. Las mutaciones de los genes implicados en esta modificación se asocian con muchas enfermedades humanas diferentes. Aquí se describen los protocolos para detectar la ubiquitinación de proteínas en las células...

La detección de ubiquitinación de proteínas

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En este informe se presentan dos métodos basados ​​en la biotinilación, diseñados para determinar la expresión de la superficie celular y la tasa endocítica de proteínas expresadas en la membrana plasmática.

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Investigando múltiples, modificaciones post-traduccionales endógenas para una proteína de la blanco pueden ser extremadamente difíciles. Técnicas descritas aquí utilizan un sistema de buffer y filtro de lisis optimizado desarrollado con metas específicas de PTM, matrices de afinidad para detectar las modificaciones de fosforilación de tirosina, acetilación, ubiquitinación y sumoilación 2/3 para un objetivo proteína mediante un sistema único y aerodinámico.

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La palmitoylación implica la incorporación de una mitad de palmitato de 16 carbonos a los residuos de cisteína de proteínas diana de una manera reversible. Aquí, describimos un enfoque bioquímico, el ensayo de cambio de gel de intercambio acilo-PEGyl (APEGS), para investigar el estado de palmitoylación de cualquier proteína de interés en los cascos cerebrales de ratón.

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Incorporación optimizada de análogos de ácidos grasos alquilinos para la detección de proteínas aciladas grasas utilizando Click Chemistry

Aquí se describe un protocolo proteómico de etiquetado de proximidad de lisosomas neuronales para caracterizar el microambiente lisosomal dinámico en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos. Las proteínas de membrana lisosomal y las proteínas que interactúan con los lisosomas (de forma estable o transitoria) se pueden cuantificar con precisión en este método con una excelente resolución espacial intracelular en neuronas humanas vivas.

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La detección de palmitoilación proteínas en neuronas del hipocampo cultivadas por inmunoprecipitación e Intercambio Acyl-Biotina (ABE) (Video) | JoVE Journal

La detección de palmitoilación proteínas en neuronas del hipocampo cultivadas por inmunoprecipitación e Intercambio Acyl-Biotina (ABE)

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