Name: Un In vivo Ensayo de prueba de permeabilidad Vasos Sanguíneos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprende a evaluar la permeabilidad vascular in vivo mediante inyección de azul de Evans en ratones. Este ensayo visualiza la difusión del colorante en tejidos para estudiar la integridad endotelial en condiciones fisiológicas y patológicas.

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Este trabajo fue apoyado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud, R01CA142928.

1. La inyección intravenosa de azul de Evans en la vena lateral de la cola de ratones <ol><li> Preparar una solución de 0,5% estéril de azul de Evans en PBS. Si es necesario, filtro-esterilizar la solución para eliminar cualquier material particulado que no se ha disuelto. </li><li> Aspirar 200 l Evans solución azul en una jeringa. Evitar todas las burbujas de aire que podrían haber escapado a la jeringa. </li><li> Coloque los ratones que son 8-12 semanas de edad en un dispositivo de retención para que el animal no es libremente móvil, pero la cola puede ser manejado. </li><li> Coloque el dispositivo de sujeción del ratón sobre su lado para que la vena lateral de la cola es fácilmente visible y están mirando hacia arriba. </li><li> Apóyese en la cola con la mano no dominante entre el pulgar y el índice. </li><li> Insertar la aguja (calibre pequeño, 27-30) en un avance 10-15 grados de ángulo, bisel hacia arriba, en la vena lateral de la cola hacia la dirección de la cabeza. Mantener la aguja y la jeringa paralela a la cola. </li><li> Do No se aplica la presión de retorno para confirmar la colocación adecuada, ya que podría colapsar la vena. </li><li> Inyecte lentamente 200 l solución Evans Blue en la vena de la cola del ratón. </li><li> Observar la facilidad con la que avanza el émbolo, ya que esta es la prueba de la colocación correcta de la aguja en la vena. </li><li> Ponga el ratón de nuevo en su jaula y observarla durante 30 min. </li></ol> 2. Colección de órganos y extracción de Evans Blue de los Órganos <ol><li> El sacrificio de los ratones mediante dislocación cervical. Para fines de ensayo Miles dislocación cervical se recomienda ya que limita la interferencia significativa con la permeabilidad vascular. Sacrificar todos los ratones al mismo tiempo, tan rápido como sea posible. Trabaja con cohortes de 6 ratones o menos, porque poco después de la muerte vasos sanguíneos se vuelven más permeables. </li><li> Coloque los ratones en sus espaldas y ponen sus pies sobre una superficie blanca. </li><li> Abra la cavidad abdominal y torácica para exponer thorACIC y órganos abdominales. </li><li> Tome fotografías representativas para mostrar las diferencias en Evans extravasación de azul. Incluyen todos los ratones en el mismo campo con el fin de tener idénticas condiciones de iluminación para todos los ratones. </li><li> Recoge los órganos de interés y los puso en tubos de 1,5 ml </li><li> Pesar un tubo vacío y llevar el valor del balance a cero. </li><li> Transferir la muestra de tejido y ponderar la misma. Repita para todas las muestras de tejido. Los tejidos pueden ser secadas al aire para eliminar la variabilidad del contenido de agua entre los diferentes órganos. </li><li> . Añadir 500 l de formamida a cada tubo de muestra de tejido. </li><li> Transferir todos los tubos a un baño de agua a 55 ° C o bloque de calor. Incubar durante 24-48 horas para extraer tejido de azul de Evans. </li></ol> 3. La cuantificación de azul de Evans extravasado en el tejido intersticial <ol><li> Centrifugar la formamida / mezcla de azul de Evans para sedimentar los fragmentos de tejidos restantes. </li><li> Medir la absorbancia a 610nm. Utilizar 500 l formamida como blanco. </li><li> Calcular ng azul de Evans extravasado por mg de tejido. </li><li> Trazar todos los datos en un gráfico. </li><li> Realizar análisis estadístico para determinar diferencias significativas. </li></ol>

<ol><li>Beck, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+NO+synthase%3A+role+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inducible NO synthase: role in cellular signaling.</a> J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).</li>
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<li>Le Guelte, A., Gavard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelial+cell-cell+junctions+in+endothelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability.</a> Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).</li>
<li>Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+system+for+in+vitro+detection+of+permeability+in+human+%22endothelium%22%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium".</a> Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflicto o competencia de los intereses financieros.

La permeabilidad vascular es un marcador crítico para el estado de los vasos sanguíneos. Aumento de la permeabilidad vascular se ha demostrado que está presente en varias enfermedades sistémicas, incluyendo la diabetes, la hipertensión y las enfermedades autoinmunes 6,7,8. Aumento de la permeabilidad vascular ha demostrado ser mediada por esfuerzo cortante, factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento endotelial vascular y el factor de crecimiento de fibroblastos, mediadores de la inflamación c...

Formación y mantenimiento de barreras permeables selectivas son esenciales para el desarrollo adecuado de los órganos y 1,2 rendimiento. Las células endoteliales recubren el lumen del vaso sanguíneo y forman una barrera semi-permeable que es esencial en el transporte selectivo entre la sangre y el espacio intersticial de todos los órganos. Una barrera de permeabilidad adecuada se mantiene a través de estrechos célula a célula uniones que están estrictamente controladas por factores de crecimiento, citoquinas y otras moléculas relacionadas con el estrés 3. La interrupción de la barrera de células endoteliales puede resultar en aumento de la permeabilidad vascular y las fugas. Estos efectos se observan en diversos estados de enfermedad y la comprensión de la señalización molecular subrayado requiere métodos multidisciplinarios 4,5. En este artículo, se describe un método in vivo para medir la permeabilidad de los vasos utilizando un modelo de ratón. El ensayo que se describe, también conocido como ensayo de Miles, es un bien establISHED método para probar la permeabilidad vascular in vivo. El ensayo se basa en el hecho de que, bajo condiciones fisiológicas basales, la albúmina no cruza la barrera endotelial. Evans Blue, un colorante azoico con alta afinidad para la albúmina, se inyecta en la corriente sanguínea de un animal experimental, y bajo condiciones fisiológicas, se espera a ser restringido dentro de los vasos sanguíneos. Cuando un estímulo permeabilidad vascular se añade, ya sea tópica o sistémica, los vasos sanguíneos comienzan a gotear proteína y, por tanto, también el azul de Evans que se une a la albúmina. Esto resulta en una coloración azulada rápida de los tejidos que tienen vasos permeables. Inyección exitosa del colorante en la vena lateral de la cola del ratón es crítica para el buen resultado del experimento. Vena de la cola técnica de inyección requiere una amplia práctica y debe ser dominado antes de iniciar el experimento. Permeabilidad de los vasos es altamente dependiente de la edad y el peso de la unaimal, por lo que cuando se comparan diferentes cepas de ratón, es imperativo que los ratones u otros sujetos de prueba tienen cerca de las fechas de nacimiento y el peso idénticas. Otros factores que influyen en la permeabilidad de la barrera endotelial son las condiciones ambientales tales como temperatura, humedad, y muy importante, el estrés del manejo del ratón. Debido a la multitud de factores que pueden influir en el resultado del experimento es siempre aconsejable que el experimento se repitió al menos tres veces y el análisis estadístico realizado. Este ensayo puede ser utilizado para comparar o permeabilidad de los vasos de ratones que han sido modificadas genéticamente, así como los ratones con diferentes fondos genéticos. La permeabilidad puede ser evaluada en presencia o ausencia de un estímulo, dependiendo de la función del gen que se modula. Este ensayo también se puede usar o para probar el efecto de diferentes compuestos sobre la permeabilidad de los vasos.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> REACTIVO </td></tr><tr><td> EVANS BLUE </td><td> SIGMA </td><td> E2129 </td><td></td></tr><tr><td> FORMAMIDA </td><td> INVITROGEN </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> Fosfato 0,2 M 1,5 M NaCl pH 7,4 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPO </td></tr><tr><td> ESPECTROFOTÓMETRO </td><td> EPPENDORF </td><td> 952000006 </td><td></td></tr><tr><td> RATÓN dispositivo de sujeción </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 340012 </td><td></td></tr><tr><td> JERINGA </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> AGUJAS </td><td> BD </td><td> 305106 </td><td> El calibre de la aguja depende del tamaño del animal. </td></tr><tr><td> BALANCE </td><td> DENVER INSTRUMENT </td><td> TP-64 </td><td></td></tr></tbody></table>

un<em&gt; in vivo</em&gt; ensayo de prueba de permeabilidad vasos sanguíneos

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

Este método se basa en la inyección intravenosa de azul de Evans en ratones como modelo animal de ensayo. El azul de Evans es un colorante que se une a la albúmina. En condiciones fisiológicas el endotelio es impermeable a la albúmina, por lo azul de Evans albúmina permanece unido restringidos dentro de los vasos sanguíneos. En condiciones patológicas que promueven el aumento de la permeabilidad células endoteliales vasculares pierden parcialmente sus contactos estrechos y el endotelio se vuelve permeable a pequeñas proteínas tales como albúmina. Esta condición permite la extravasación de azul de Evans en los tejidos. Un endotelio sano previene la extravasación del colorante en los tejidos vascularizados vecinos. Los órganos con aumento de la permeabilidad mostrará coloración azul aumentó significativamente en comparación con los órganos con endotelio intacto. El nivel de permeabilidad vascular se puede evaluar por simple visualización o por medición cuantitativa del colorante incorporado por miligramo de tejido de control versus animal experimental / tejido. Dos Powerful aspectos de este ensayo son su simplicidad y características cuantitativas. Colorante azul de Evans se puede extraer de los tejidos mediante la incubación de una cantidad específica de tejido en formamida. Evans Blue es el máximo de absorción a 620 nm y la absorbancia es mínimo a 740 nm. Mediante el uso de una curva estándar para el azul de Evans, medidas de densidad óptica se puede convertir en colorante capturado miligramo por miligramo de tejido. El análisis estadístico se debe utilizar para evaluar las diferencias significativas en la permeabilidad vascular.

Hemos utilizado un ensayo de permeabilidad in vivo para probar las fugas buque en ratones 8-12 semanas de edad. Esta prueba es útil para comparar la permeabilidad relativa vascular entre los animales del fondo genético diferente o en una sola cepa de ratones sometidos a tratamientos que afectan a la vasculatura. Nuestros resultados muestran que una cepa de ratones genéticamente modificados que hemos creado en nuestro laboratorio cuenta con un endotelio más permeable en comparación con ratones de tipo s...

Estamos presentando un<em&gt; In vivo</em&gt; Ensayo para probar la permeabilidad de los vasos sanguíneos. Este ensayo se basa en la inyección intravenosa de un colorante y la posterior visualización de su difusión en espacios intersticiales.

Un<em&gt; In vivo</em&gt; Ensayo de prueba de permeabilidad Vasos Sanguíneos

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Este video presenta un ensayo in vivo para evaluar la permeabilidad de los vasos sanguíneos. En ratones, las células endoteliales revisten los vasos sanguíneos y forman una barrera semipermeable. En condiciones fisiológicas, el endotelio es impermeable a la mayoría de las proteínas, de modo que estas se mantienen restringidas al flujo sanguíneo.En condiciones patológicas que favorecen el aumento de la permeabilidad vascular, las células endoteliales pierden parcialmente el contacto entre sí. El endotelio se vuelve permeable a proteínas pequeñas como la albúmina. En este ensayo, inyectamos por vía intravenosa un colorante azul que se une a la albúmina en condiciones de permeabilidad endotelial aumentada.El D atraviesa la barrera endotelial y se difunde hacia el espacio intersticial. Esto provoca finalmente una coloración azulada del tejido afectado antes de comenzar el experimento. Prepare todos los materiales necesarios, así como pipetas y puntas estériles.Azul de Evans, espátula estéril, PBS estéril, jeringa y agujas estériles. Ratones, sujetador para ratón, instrumentos de disección, tablero y alfileres para disección. Balanza de precisión, bloque calefactor para baño de agua a 55 grados Celsius.Pese en un espectrofotómetro C.Vet el polvo de azul de Evans y transfiéralo a un tubo estéril. Añada PBS estéril para obtener una concentración de trabajo del 0,5%. Aspire lentamente 200 microlitros de la solución de azul de Evans en la jeringa.Evite todas las burbujas de aire y elimine cualquier burbuja que haya quedado atrapada en la jeringa. Coloque el ratón en un dispositivo de sujeción de manera que el animal no pueda moverse mucho, pero su cola pueda manipularse. Coloque el dispositivo de sujeción de lado, de modo que la vena lateral de la cola sea fácilmente visible y quede orientada hacia arriba.Sujete la cola con la mano no dominante entre el pulgar y el índice. Aplique presión en la base de la cola para que funcione como un torniquete. Inserte la aguja con un ángulo de 10 grados.Incline la aguja hacia arriba y avance dentro de la vena. Mantenga la aguja y la jeringa paralelas a la cola. No aplique presión retrógrada para confirmar la colocación adecuada de la aguja en la vena.Dado que esto podría colapsar la vena, inyecte lentamente 200 microlitros de solución azul de Evans en la cola. Observe con qué facilidad avanza el émbolo, ya que esto es prueba de una colocación correcta dentro de la vena. Si la aguja está colocada correctamente, aparece una pequeña gota de sangre tras retirar la aguja.Aplique presión en el sitio de eyección hasta que deje de sangrar. Devuelva al ratón a la jaula y obsérvelo durante 30 minutos. Sacrifique al ratón y fíjelo sobre una pizarra blanca.En este video estamos presentando tanto un ratón control como un ratón modificado genéticamente para carecer de un gen que controla la integridad endotelial. Abra la cavidad abdominal y torácica para exponer los órganos, recoja los órganos de interés y colóquelos en tubos EEND DPH. Haga esto antes de desechar el cadáver del ratón.Asegúrese de tener imágenes representativas de todos los órganos de interés. Etiquete un nuevo conjunto de tubos, pese un tubo vacío. Lleve el valor de la balanza a cero y luego transfiera la muestra de tejido al tubo y pésela.Repetir para todas las muestras. Añadir 500 microlitros por ácaro a cada tubo. Transferir todos los tubos a un bloque térmico o baño de agua a 55 Celsius.Incubar durante 24 a 48 horas para extraer el azul de Evans de todo el tejido y medir la absorbancia a una longitud de onda de 600 nanómetros. Utilice 500 microlitros de IDE como blanco. Mida la densidad óptica para cada muestra.Se pueden observar fácilmente diferencias significativas en la permeabilidad vascular en esta etapa. Calcule nanogramos de azul Evans extravasado por miligramo de tejido.Represente todos los datos en una gráfica; el método que presentaron, también conocido como ensayo M, se utiliza para probar la permeabilidad del vaso en ratones antes de comenzar el experimento. Se debe dominar la inyección en la vena de la cola, ya que esta técnica requiere una práctica extensa. Los resultados deben registrarse como imágenes fijas y mediciones cuantitativas, y siempre deben acompañarse de un análisis molecular.La permeabilidad del vaso depende en gran medida de la edad y el peso del animal, además de las condiciones ambientales. Por lo tanto, el experimento debe repetirse al menos tres veces y debe realizarse un análisis estadístico.

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