Aplicación clínica de

Este protocolo modifica genéticamente las células T para introducir receptores de antígenos quiméricos específicos para los antígenos tumorales, y luego propaga cantidades clínicamente significativas en células presentadoras de antígenos artificiales de diseño. Comienza con la electro transferencia de la bella durmiente. Transponer y transponer plásmidos de ADN A en células mononucleares quiescentes aisladas de sangre periférica o de cordón umbilical.

A continuación, mida la eficiencia de la transfección mediante citometría de flujo. A continuación, se realizaron el cocultivo de las células T transfectadas durante siete días en células presentadoras de antígeno artificial derivadas de K 5 62 con la adición de citocinas exógenas en una estimulación de cuatro semanas. Los ciclos de proliferación proceden a analizar la criopreserva y liberar las células T car positivas electroporadas y propagadas para su aplicación en humanos.

El sistema de transposición de la bella durmiente ofrece una alternativa a los enfoques de transferencia de genes basados en virus para introducir un gen de manera estable en la célula elegida. Una de las principales ventajas del sistema de la bella durmiente es que se pueden integrar genes a un costo realmente reducido en comparación con los plásmidos de ADN que se integran a través de recombinaciones ilegítimas no homólogas. Por lo tanto, la ventaja es que el sistema de la bella durmiente se puede utilizar para expresar un gen a bajo costo y alta eficiencia.

En general, los individuos nuevos en este método inicialmente tendrán que superar la eficiencia de las células T electro en la propagación selectiva de células T car positivas en células presentadoras de antígenos artificiales. Ambos pasos son difíciles de dominar debido a la necesidad de co-cultivar. Células T modificadas genéticamente en células presentadoras de antígenos artificiales.

Este método es útil en el campo de la inmunoterapia adoptiva, particularmente en la administración efectiva de genes y en la producción de un número clínicamente significativo de células T. La aplicación más amplia se extiende hacia la terapia del cáncer porque las células T del sistema inmunitario pueden modificarse para que sean específicas del tumor. Los encargados de demostrar el procedimiento serán Margaret Dawson y Matthew Fiola.

Los técnicos de mi laboratorio primero diluyen la sangre periférica con un volumen igual de P-B-S-E-D-T-A y la sangre del cordón umbilical con cuatro volúmenes de P-B-S-E-D-T-A colocan lentamente 25 mililitros de sangre diluida sobre 12 mililitros de fial en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar el gradiente fial a 400 Gs durante 30 a 40 minutos sin interrupción. Ahora transfiera la fracción de la celda mononuclear a un tubo de centrífuga nuevo de 50 mililitros con P-B-S-E-D-T-A.

Aumente el volumen a 50 mililitros y recoja las células por centrifugación. Lave suavemente las células una vez en 50 mililitros de cultivo completo, medio y centrífuga a 400 Gs durante 10 minutos. A continuación, agrupe los gránulos de células en CCM para realizar un recuento de células.

Utilizando el método de exclusión triam blue. Las células mononucleares ahora se pueden utilizar para la electroporación o criopreservadas para su uso futuro. Si utiliza MNC criopreservada, descongele rápidamente dos veces 10 hasta la octava celda para una electroporación a gran escala, transfiera suavemente las celdas a un tubo de centrífuga de tamaño adecuado que contenga precalentamiento.

Medios de cultivo RPMI completos sin fenol y pellets las células por centrifugación, resuspender las células mononucleares En P-F-R-P-M-I, realizar un recuento de células y transferir las células a un recipiente de cultivo celular de tamaño adecuado a una concentración de 10 de las seis células por mililitro. Equilibre las células en una incubadora humidificada durante dos horas. Coseche la MNC por centrifugación, luego vuelva a suspender suavemente y combine los gránulos de celdas en P-F-R-P-M-I y enumere las celdas Ahora transfiera dos veces 10 a la octava MNC a un tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros y centrifugue a 200 Gs durante 10 minutos sin descansos.

Aspire el sobrenadante de modo que no queden medios residuales alrededor del gránulo de la célula. Prepare una placa estéril de 12 pocillos con 10 pocillos que contengan cuatro mililitros de P-F-R-P-M-I caliente y equilibre la placa en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. A continuación, reconstituya la solución efectora Lonzo Nucleo del kit de células T humanas según las instrucciones del fabricante para cada reacción.

Q Vet prepara 100 microlitros de mezcla maestra de ADN que contiene una solución efectora nuclear de NU suplementada. 15 microgramos de la transposición en el plásmido y cinco microgramos del plásmido transpuesto. A continuación, disperse la pelletza de células T y vuelva a suspender una mezcla maestra de ADN de solución de afección nuclear NU a una concentración final de células dos veces la décima de la séptima célula por cada 100 microlitros.

Transfiera con cuidado 100 microlitros de la suspensión celular a cada una de las 10 cubetas de afección de tronza nucleo, teniendo cuidado de evitar burbujas. Ahora toque el qve una vez y electro usando el programa U 0 1 4 para células T no estimuladas. Transfiera las cubetas y la placa de equilibrio de 12 pocillos a la campana de cultivo utilizando un amox de pipeta de transferencia de punta fina a 500 microlitros del medio de cultivo precalentado desde el pocillo correspondiente a cada veta.

Transfiera las células electroporadas a la placa y deje que las células se recuperen en la incubadora de cultivos celulares durante dos horas. Luego, transfiera las células de todos los pocillos a un tubo de centrífuga estéril y granule las células después de un lavado, disperse la pelletización celular suavemente y vuelva a suspender en CCM para lograr una suspensión de una sola célula. Después de realizar un recuento de células, ajuste la concentración de células para atender a las seis células por mililitro en CCM.

A continuación, transfiera la suspensión celular a un matraz de cultivo y colóquela en la incubadora durante la noche para generar células transfectadas con EGFP. Repita el protocolo de electroporación utilizando cinco veces 10 de las seis celdas por vete con cinco microgramos de plásmido EGFP de control amox. Recoja las células electroporadas y, a continuación, realice un recuento de células utilizando el método de exclusión de trien azul.

A continuación, tiñir una o dos veces 10 de las seis células con anticuerpos específicos para CD tres, CD cuatro, CD ocho e IgG FC gamma humana como medida de la expresión de coches. Adquiera las celdas en calibre de fax. Analice los datos utilizando el software FCS express para determinar la expresión del automóvil.

A continuación, calcule las células car positivas en cultivo. El clon A PC número cuatro derivaría de las células K 5 62 a moléculas coestimuladoras deseadas de células T coexpresadas Descongelar una alícuota de células T congeladas irradiadas, A A PC en un baño de agua a 37 grados Celsius. A continuación, lavar las células y CCM, enumerar las células viables por exclusión de color azul y calcular el número de A A PC viables necesarias para la estimulación.

Mezcle las células electroporadas que expresan car y el A A PC irradiado con rayos gamma en un recipiente estéril en una proporción de uno a dos. Ajuste la relación A PC para la expresión de car en función de la citometría de flujo al día siguiente de la electroporación Agregue 30 nanogramos por mililitro de IL 21 a la suspensión de la celda. A continuación, Eloqua atendió las seis células por mililitro en matraces T 75 o bolsas de cultivo de vida y devolvió a la incubadora de cultivo, la electrotransferencia de plásmidos de ADN y la propagación de células T en radiación gamma.

A A PC se puede utilizar para generar cantidades clínicamente atractivas de células T derivadas de sangre periférica y sangre de cordón umbilical para aplicaciones humanas. En esta caracterización de linfocitos T modificados genéticamente a partir de sangre periférica, la expresión de EGFP en el día cero del primer ciclo de estimulación, los controles para la eficiencia de la expresión de transferencia génica de CD-19 específico se evalúan mediante citometría de flujo en linfocitos T CD tres positivos, CD ocho positivos y CD cuatro positivos aproximadamente 24 horas después de la electroporación. Y luego, 28 días después del cocultivo en A PC, cinética de la expresión de CAR en células T cultivadas en un sistema funcionalmente cerrado.

La propagación de las células T carpositivas derivadas de la sangre periférica a lo largo del tiempo puede generar un número clínicamente atractivo de células T que expresan el car de forma estable. Después de cuatro semanas de cocultivo en A A PC, la expansión media del pliegue de las células T CD tres positivas es de aproximadamente 19.800 con una expresión de coche del 90%. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo elegir desfilar y propagar células T que expresan un automóvil deseado.

Recuerde controlar el crecimiento excesivo de células NK. La electroporación y propagación de las células T se lleva a cabo normalmente a lo largo de cuatro ciclos de estimulación de siete días. Se pueden realizar investigaciones adicionales, como ensayos de liberación de citocinas y citotoxicidad, para evaluar la especificidad redirigida de las células T modificadas genéticamente en el campo de la inmunoterapia adoptiva.

Esta técnica nos ayuda a entender el potencial terapéutico de las células T que se infunden en los seres humanos.