Name: Aplicación clínica de La Bella Durmiente Artificial y células presentadoras de antígenos para modificar genéticamente las células T de la sangre del cordón umbilical y periférica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprende a modificar genéticamente células T con receptores de antígeno quiméricos usando el sistema Sleeping Beauty y células presentadoras de antígenos artificiales para inmunoterapia contra cáncer.

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Los autores desean agradecer al Dr. Carl June (Universidad de Pennsylvania) para generar y proporcionar ayuda clon AAPC º 4 y el Dr. Perry Hackett (Universidad de Minnesota) para obtener ayuda con el sistema de SB. Apoyo de la donación: Cancer Center Core Grant (CA16672); SR1 (CA124782, CA120956, CA141303), R33 (CA116127), P01 (CA148600); SPORE (CA136411), Albert J Ward Foundation; Burroughs Wellcome Fondo; Gillson Longenbaugh Foundation; Prevención del Cáncer y el Instituto de Investigación de Texas; CLL Global Research Foundation, el Departamento de Defensa, Bienes de Noelan L. Bibler, Harry T. Mangurian, Jr., el Fondo para la Inmunoterapia leucemia, el Instituto de la terapia del cáncer personalizado, Sociedad de Leucemia y Linfoma, Linfoma Fundación de Investigación; MDACC Hermana Institución Red Fondo; Miller Foundation; Sr. Herb Simons, el señor y la señora Joe H. Scales, el Sr. Thomas Scott, de la Fundación Nacional para la Investigación del Cáncer, la Fundación Pediátrica de Investigación del Cáncer; asistenc Produccióne de terapias celulares (PACT), William Lawrence y la Fundación Blanche Hughes para la Infancia.

<html> Día 0 o antes 1. Aislamiento de células mononucleares (MNC) de PB y UCB <ol><li> Diluir PB con igual volumen, y UCB con cuatro volúmenes de PBS-EDTA. </li><li> Lentamente capa diluida de sangre (25 ml) sobre Ficoll (12 ml) en un tubo de centrífuga de 50 ml (s) y se centrifuga a 400 xg durante 30 - 40 min (sin freno). </li><li> Recoger y transferir la fracción de células mononucleares (interfaz) usando una pipeta de transferencia a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Llevar el volumen hasta 50 ml con PBS-EDTA y se centrifuga a 450 xg durante 10 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante, resuspender suavemente el sedimento celular (s) en 50 ml de medio de cultivo completo (CCM) y, centrifugar a 400 xg durante 10 min. </li><li> Suavemente resuspender piscina y los sedimentos celulares en CCM y llevar a cabo un recuento de células mediante el método de exclusión con azul de tripano (Cellometer, programa CMSP). </li><li> MNC se puede utilizar ahora para la electroporación (nucleofection) o criopreservados para su uso futuro. </li></ol>título &quot;2&gt;. Preparación de las células T para la electroporación en el Día 0 <ol><li> Si se utiliza criopreservados MNC, descongelar rápidamente un número suficiente de células para electroporación escala completa (2 x 10 8 añadiendo ~ 20% para tener en cuenta la pérdida de células durante la centrifugación y 2 horas de incubación) en 37 ° C baño de agua. Si se utiliza recién aisladas MNC vaya al paso 2.3. </li><li> Volver a suspender suavemente y transferir las células a un tubo de centrífuga de tamaño apropiado (s) contenida pre-calentado completa de fenol RPMI libre de medio de cultivo (RPMI-PF) y se centrifuga a 200 xg durante 10 min (sin freno), el sobrenadante aspirado. </li><li> Se resuspende el MNC en RPMI-PF, realizar un recuento de células (Cellometer) y transferir las células a un recipiente de cultivo de células de tamaño apropiado (s) a una concentración de 10 6 células / ml. </li><li> Incubar en un humidificado 37 ° C / 5% de CO 2 incubadora durante 2 h ± 30 min. </li><li> Transferir el MNC para tubo de centrífuga estéril (s), centrifugado a 200 xg durante 5 min (sin frenos), aspirar el sobrenadante y suavemente re-suspender y combinar el sedimento celular (s) en el PF-RPMI. </li><li> Realizar un recuento de células (Cellometer) y calcular el volumen de la suspensión celular requerida (2 x 10 8 MNC). </li><li> Transferir el volumen calculado a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml y centrifugar a 200 xg durante 10 min (sin freno). </li><li> Aspirar el sobrenadante de manera que no queden residuos de medios de comunicación y resuspender suavemente tocando el lado del tubo. </li></ol> 3. Electroporación (nucleofection) de MNC (proceso a escala completa mediante cubetas de 10) en el Día 0 <ol><li> Preincubar un estéril 12-así placa con 10 pocillos que contenían 4 ml de RPMI-PF caliente en un humidificado 37 ° C / 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Preparar y pre-caliente el Lonza Solución Nucleofector Human T kit celular (reconstituido según las instrucciones del fabricante, <a href="http://www.lonza.com" target="_blank">www.lonza.com</a> ) a temperatura ambiente en un gabinete de bioseguridad (BSC). </li><li> Preparar la solución Nucleofector / mezcla maestra de ADN por adding 100 l de solución de Nucleofector suplementado, 15 g de transposón (ADN superenrollado plásmido designado como CD19RCD28/pSBSO) y 5 g de transposasa (ADN superenrollado plásmido designado como pCMV-SB11) por reacción / cubeta. </li><li> Dispersar el sedimento celular (del paso 2,8) golpeando suavemente el lateral del tubo de centrífuga y volver a suspender en solución de mezcla maestra nucleofection / ADN (concentración final de células: 2 x 10 7 células/100 l). </li><li> Transfiera cuidadosamente 100 l de la suspensión celular (del paso 3,4) a cada uno de diez (10) cubetas nucleofection Lonza, teniendo cuidado de evitar burbujas. </li><li> Pulse la cubeta una vez, y electroporar utilizando el programa U-014 (para las células T no estimuladas). </li><li> Transferir las cubetas y la placa de 12-pocillos (Paso 3,1) a la BSC. </li><li> Recoger las células electroporadas de cada cubeta utilizando un Amaxa fina punta de pipeta de transferencia, mediante la adición de ~ 500 l de medio de cultivo pre-calentado desde el pocillo correspondiente (12-así placa preparado en Step 3,1) y devolver la placa a un humidificado 37 ° C / 5% de CO 2 incubadora durante 2 h ± 30 min. </li><li> Después de la 2-hr de incubación, la cosecha y transferir las células de todos los pocillos a un tubo de centrífuga estéril. </li><li> Lavar las células por centrifugación a 140 xg durante 8 min, temperatura ambiente, sin freno y aspirar y descartar el sobrenadante de modo que no hay ningún medio residual cubre el sedimento celular. </li><li> Dispersar el sedimento celular por golpeando suavemente el lateral del tubo de centrífuga y volver a suspender suavemente en CCM para lograr una única suspensión celular. </li><li> Realizar el recuento de células y ajustar la concentración celular a 10 6 células / ml en CCM. </li><li> Transferir la suspensión celular a un matraz de cultivo celular (s) y lugar en la incubadora durante la noche. </li><li> Las etapas del proceso desde 2,1 hasta 3,8 se repitieron para el control de: EGFP transfectadas las células (5 x 10 6 células / cubeta con 5 g Amaxa de control EGFP plásmido superenrollado, pmaxGFP). </li></ol> Día 1 de 1 ° y subsiguientesCiclos de estimulación 4. Análisis de la expresión CAR por citometría de flujo en el día 1 <ol><li> Recoger las células electroporadas y realizar un recuento de células utilizando Trypan método de exclusión de azul (hemocitómetro). </li><li> Células de tinción (1 a 2 x 10 6) con anticuerpo específico para CD3, CD4, CD8, y humano IgG Fc gamma (como una medición de la expresión de CAR). </li><li> Adquirir las células en FACS Calibur y analizar los datos utilizando FCS software Express para calcular la expresión de CAR. <ol><li> Calcular las células Coche + en cultivo mediante la fórmula: (Número de células viables totales) x (CAR% + células) = No. de CAR + células </li></ol></li></ol> 5. Preparación de AAPC (clon n º 4) en el Día 1. AAPC (clon # 4) se obtuvieron a partir de células K562 (línea parental Obtenidos a partir de American Type Culture Collection) para Co-express Deseado células T co-estimuladoras molécula <ol><li> Descongelar una alícuota de congelados 100 AAPC Gy irradiados en un 37 °; C baño de agua. </li><li> Las células se lavaron dos veces por centrifugación a 400 xg, 10 min en CCM y se contaron utilizando Cellometer (exclusión de azul de tripano). </li><li> Calcular el número de AAPC viable necesario para la estimulación: (No. de CAR + células) x 2 = Número de la AAPC irradiado requiere </li></ol> 6. AAPC mediada por la estimulación de las células T CAR + 1 que comienza el día de 1 º y subsiguientes ciclos de estimulación <ol><li> Mezclar las células electroporadas (que expresan CAR) y γ-irradiado AAPC (clon n º 4) en un recipiente estéril en una proporción de 1:2 (CAR + celular: viable AAPC) en CCM. <ol><li> Tenga en cuenta la relación de AAPC se ajusta para la expresión de CAR basado en citometría de flujo el día después de la electroporación. </li></ol></li><li> Añadir IL-21 (30 ng / ml) a la suspensión celular. </li><li> Dividir en partes alícuotas en T-75 cm 2 frasco (s) y / o bolsas de Vue Cultura Vida en una concentración de 10 6 células / ml y volver a la incuo. </li></ol> Días 3, 5 7. Cultura Continuación de CAR + células T <ol><li> Realizar un cambio de medio de comunicación, reponer IL-21, y mantener las células T en una concentración de 10 6 células / ml. </li></ol> Día 7 8. Fin del primer ciclo de estimulación mediada por AAPC <ol><li> Cosecha de células, contar y mancha para CD3, CD4, CD8 y Fc gamma (CAR) y vaya al paso 10.1. </li></ol> 9. El agotamiento de las células CD56 + (normalmente entre 7 y 14 días después de la electroporación) <ol><li> Realizar un agotamiento CD56 usando perlas paramagnéticas si CD56 + CD3 neg linfocitos ≥ 10%. </li></ol> Ciclos de estimulación # 2, # 3 y # 4, correspondientes a los días 8 → 14 → 15 días, 21 días, y 22 → 28 10. La adición recursiva de AAPC para propagar las células T a los Números de vista clínico-suficientes <ol><li> Repita el stimulatioproceso de n (4 veces) como se describe en los pasos 4.3-8.1. </li><li> Añadir IL-2 (50U/ml) a los cultivos que comienzan en los días 7, 14 y 21, y después de cada cambio de medio (tres veces por semana, en un horario de lunes, miércoles y viernes). </li><li> Criopreservar (archivo) las células T en exceso como sea necesario. <ol><li> Células T congelada utilizando congelador de velocidad controlada. </li></ol></li></ol> Día 28 11. Fin del último ciclo de estimulación mediada por AAPC: Las células T Cosecha <ol><li> Criopreservar las células T para la aprobación e infusión. </li></ol>

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Transposón y sistemas de transposasa, tales como de piggyBac 12,19 y SB 18,20-22, son no virales enfoques de terapia génica que son una alternativa a viral mediada por la transducción de grado clínico CAR + células T. El SB fue elegido como el sistema de transferencia génica basado en su potencial para la terapia génica humana 1,6,23. Hemos desarrollado las tecnologías duales de transposición SB (para introducir un coche) y la adición recursiva de γ-irradiado AAPC (para recuperar células T modificadas genéticamente que expresan establemente un CAR) para servir como tecnologías de la plataforma en la fabricación de células T específicas de TAA en cumplimiento con cGMP para la Fase I / II de ensayos (Figura 4). Después de 28 días (cuatro días-7 ciclos de estimulación) de co-cultivo sobre γ-irradiado AAPC, que generalmente son capaces de generar por lo menos ~ 10 10 modificados genéticamente las células T adecuadas para aplicaciones en seres humanos. Según sea necesario, ciclos adicionales de estimulación pueden ser emprendido to generar un mayor número de células T modificadas genéticamente. Además, si menos CAR + células T son necesarios, el enfoque de la electroporación y la propagación puede ser reducido empleando un menor número de cubetas y llevar adelante sólo una sub-conjunto de las células T expandidas numéricamente para las siguientes rondas de proliferación en AAPC al comienzo de cada Estimulación ciclo. La mayoría de la electroporación y se propagan las células T recolectadas para perfusión expresan de manera estable el CAR. La extensión de las células CD4 + y CD8 + células T que expresan nuestra 2 ª generación CAR incluyen las células con un fenotipo de memoria / ingenua y presentan tres características de la re-dirigido especificidad. En primer lugar, las células genéticamente modificadas T específicamente lisar objetivos CD19 +, en segundo lugar, producir IFN-γ en respuesta a células estimuladoras CD19 + y en tercer lugar, proliferan en respuesta a CD19 + células alimentadoras, todas en una manera dependiente del automóvil 13,18. Nuestro enfoque integrcomió un transgén CAR por electro-transferencia de plásmidos de ADN no virales del sistema SB puede llevarse a cabo en las células T quiescentes primarios derivados de PB y UCB. Nosotros y otros han modificado genéticamente células K562 para servir como AAPC para propagar eficazmente números clínicamente suficiente de células T para la infusión 24,25. La AAPC y el medio ambiente de cultivo de tejidos (por ejemplo, la adición de IL-21) se han se han modificado para generar el paciente y el donante derivado de CD19 de células T específicas para perfusión después de células madre hematopoyéticas trasplante (Tabla 1) 13,18. Podemos producir CAR + células T de PB simplemente obtenida por punción venosa que evita el coste, el malestar y molestias de obtener MNC de PB por aféresis. La posibilidad de obtener un gran número de CAR + células T de un pequeño número de empresas multinacionales es especialmente atractivo para la infusión de las células T después de trasplante alogénico trasplante UCB. El pequeño tamaño y el anonimato del donante neonatal se opone a re-Acceder a este individuo en un punto de tiempo más tarde y sólo un número limitado de cosechada MNC están disponibles como material de partida para la fabricación de células T para evitar la interferencia con la hematopoyesis. Otros avances en el proceso de fabricación en curso para incluir un dispositivo de electroporación de alto rendimiento junto con un biorreactor WAVE completamente cerrada para minimizar la manipulación. En total, el SB y AAPC son atractivas plataformas para generar CD19 específico de CAR + células T que pueden ser adaptados para generar grandes números de células T modificadas genéticamente que pueden reconocer alternativas de la superficie celular TAA en el cumplimiento de cGMP.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivos </td><td> Vendedor </td><td> Número de catálogo </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reactivos </td></tr><tr><td> ADN de plásmido que expresa GFP (pmaxGFP) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 (kit) </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS PBS-EDTA </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 70026 </td><td></td></tr><tr><td> HyQ RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30096.01 </td><td></td></tr><tr><td> Fenol libre RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30605.01 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone suero fetal bovino </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH3007003HI </td><td></td></tr><tr><td> GlutaMAX(100x) </td><td> Gibco </td><td> 3505-061 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque </td><td> GE Healthcare Biosciences </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> IL-21 recombinante humana </td><td> PeproTech </td><td> AF-200-21 </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 humana recombinante (Proleukin) </td><td> Novartis </td><td> NDC 65483-116-07 </td><td></td></tr><tr><td> Human T Kit celular (Solución Nucleofector) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS CD56 reactivo </td><td> Miltenyi </td><td> 70206 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-conjugado con mAb de ratón específico para CD3 humano </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td></td></tr><tr><td> APC-ratón conjugado con mAb específico para CD4 humanos </td><td> BD Biosciences </td><td> 340443 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5-conjugadopara ratón mAb específico para CD8 humana </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td><td></td></tr><tr><td> PE-conjugado con F (ab &#39;) 2 fragmento de anticuerpo de cabra específico para Fc gamma humana </td><td> Invitrogen </td><td> H10104 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio azida </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Desechables </td></tr><tr><td> 12-así placa </td><td> Corning </td><td> 3513 </td><td></td></tr><tr><td> T-75 cm 2 frasco </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Bolsas de cultivo </td><td> Vue Vida </td><td> 290C, 750C </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml tubo de centrífuga </td><td> BD Biosciences </td><td> 352098 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><strong&gt; Equipos </td></tr><tr><td> Amaxa Nuceleofector II </td><td> Lonza </td><td> AAB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer </td><td> Bioscience Nexcelom </td><td> Visión Cellometer </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga Sorvall Legend RT </td><td> Sorvall </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td> Congelador de velocidad controlada </td><td> Planer </td><td> Kryo 750 </td><td></td></tr><tr><td> Irradiador </td><td> CIS bio international </td><td> IBL-437 C # 09433 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> La expresión de moléculas (endógena e introducidos) </td></tr><tr><td> Línea celular </td> &lt;Nombre td&gt; Común </td><td> Tipo de célula </td><td> Moléculas expresadas </td></tr><tr><td> CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 </td><td> Clon 4 </td><td> K562 </td><td> CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP co-expresada con membrana unida IL-15 </td></tr></tbody></table> Medios completos Cultura (CCM) (almacenado a 4 º C durante hasta 30 días) HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640 FBS 10% 1% GlutaMAX Citometría de flujo de tampón (almacenado a 4 º C durante hasta 30 días) PBS FBS 2% 0,1% de azida de sodio </td></tr></tbody></table>

aplicación clínica de<em&gt; la bella durmiente</em&gt; artificial y células presentadoras de antígenos para modificar genéticamente las células t de la sangre del cordón umbilical y periférica

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

La potencia de grado clínico células T se puede mejorar mediante la combinación de la terapia génica con inmunoterapia para diseñar un producto biológico con potencial para la superior (i) el reconocimiento de antígenos asociados a tumores (TAA), (ii) la persistencia después de la infusión, (iii) potencial para la migración a los sitios tumorales, y (iv) la capacidad para reciclar funciones efectoras en el microambiente tumoral. La mayoría de los enfoques para la manipulación genética de las células T diseñadas para aplicación en seres humanos han utilizado retrovirus y lentivirus para la expresión estable de CAR 1-3. Este enfoque, aunque compatible con la práctica actual de fabricación (NCF), puede ser costoso ya que se basa en la fabricación y liberación de grado clínico virus recombinante a partir de un número limitado de instalaciones de producción. La transferencia electro-de plásmidos no virales es una alternativa atractiva a la transducción desde especies de ADN puede ser producido a grado clínico a aproximadamente 1/10 de los costes de recombinhormiga GMP-grado virus. Para mejorar la eficiencia de la integración nos adaptamos Bella Durmiente (SB) transposón y transposasa humano para 4-8 aplicaciones. Nuestro sistema SB utiliza dos plásmidos de ADN que constan de un transposón que codifica para un gen de interés (por ejemplo, 2 ª generación CD19 específico de transgén CAR, designado CD19RCD28) y una transposasa (por ejemplo SB11) que se inserta el transgén en dinucleótido TA repite 9-11 . Para generar números clínicamente suficiente de células T modificadas genéticamente que utilizamos K562-derivados de las células presentadoras de antígeno artificiales (AAPC) (clon n º 4) modificadas para expresar un TAA (por ejemplo, CD19), así como las moléculas coestimuladoras de células T CD86, CD137L, una unida a la membrana versión de la interleucina (IL) -15 (péptido fusionado a modified IgG4 región Fc) y CD64 (Fc-γ receptor 1) para la carga de anticuerpos monoclonales (mAb) 12. En este informe, demuestran los procedimientos que se pueden realizar en compliance con cGMP para generar CD19 específico CAR + células T adecuadas para aplicación humana. Esto se logró mediante la síncrono electro-transferencia de dos plásmidos de ADN, un transposón SB (CD19RCD28) y una transposasa SB (SB11), seguido por la recuperación de los integrantes estables por las adiciones cada-7-días (ciclo de estimulación) de γ-irradiado AAPC (clon n º 4) en presencia de IL-2 soluble recombinante humano y 13 IL-21. Típicamente 4 ciclos (28 días de cultivo continuo) se llevan a cabo para generar números clínicamente atractivas de las células T que expresan de manera estable el CAR. Esta metodología para la fabricación de grado clínico CD19 específico de células T se pueden aplicar a las células T derivadas de sangre periférica (PB) o sangre de cordón umbilical (UCB). Por otra parte, este enfoque puede ser aprovechada para generar células T a diversos tipos de tumores por el emparejamiento de la especificidad de la CAR introdujo con la expresión de la TAA, reconocida por la CAR, en la AAPC.

Se reporta que la electro-transferencia de plásmidos de ADN y la propagación de las células T en γ-irradiado AAPC se puede utilizar para generar números clínicamente atractivas de las células T derivadas de PB y UCB para aplicaciones humanas. Estas células modificadas genéticamente T expresan un CAR introducido que reconoce el TAA CD19, independiente del complejo mayor de histocompatibilidad. Los plásmidos de ADN SB-derivados de expresar el transposón (i), un coche de 2 ª generación (CD19RCD28) que señales a través de CD28 y CD3-ε 14, y (ii) de la transposasa, SB11 15, se han descrito previamente 13, 16,17 . Los plásmidos utilizados en este estudio fueron producidos comercialmente, por servicio Waisman biofabricación Clínica (Madison, WI). La AAPC (clon n º 4), derivado de células K562 (línea parental obtuvo de la Colección Americana de Cultivos Tipo), co-expresar deseados moléculas coestimuladoras de células T-(cada molécula introducida en 3 90% en la superficie celular de AAPC),como se ha descrito previamente 12. Aquí nos muestran que CD19 específicos de las células T podrían ser generados a partir de células mononucleares (MNC) derivados de PB o UCB utilizando transposición SB para introducir el coche seguido de la adición de AAPC numéricamente para expandir las células T en una manera dependiente del automóvil (Figuras 1 , 4) 13,18. Diez cubetas (2x10 7 MNC / cubeta) se someten a electroporación para cada destinatario utilizando 15 mg de ADN plásmido (CD19RCD28/pSBSO) de codificación para transposón (CAR) y 5 g de ADN plásmido (pCMV-SB11) que codifica para la transposasa (SB11). El número de cubetas se puede reducir si MNC están limitando o reducido para el trabajo de laboratorio. El día de la electroporación se define como &quot;0&quot; Día del ciclo de estimulación # 1. Como controles para citometría de flujo y las condiciones de cultivo, células T autólogas son Mock electroporada (sin ADN plásmido) y numéricamente expandido en γ-irradiado AAPC (clon n º 4) que había sido pre-cargado con OKT3 para reticular CD3 para sostener las células T proliferación. Nos routinely evaluar la eficiencia de electrotransferencia y la viabilidad de las células T el día después de la electroporación (Figura 2B). La expresión de EGFP a partir de ADN plásmido de control (designado pmaxGFP) y CAR en este punto temporal inicial refleja la expresión de proteínas a partir del plásmido integrado y episomal. Típicamente, el día después de la electroporación se mide la expresión de EGFP en ~ 60% y la expresión de CAR en ~ 40% (Figura 2A) con la viabilidad de células T entre 40-50%. Adiciones recursivas de γ-irradiado AAPC en presencia de IL-2 soluble recombinante humana y de IL 21-recuperar las células T que expresan establemente CAR (CD19RCD28). CD3 neg CD56 + células NK se agotan a partir del cultivo utilizando CD56-específicos perlas paramagnéticas si el porcentaje de estas células NK es ≥ 10% y especialmente si el porcentaje de CAR se expresa en las células T es baja. Este agotamiento rápido evita el crecimiento excesivo de las células NK, que interfiere con la capacidad de AAPC para sostener la proliferation de CAR + T cells. En ocasiones, el agotamiento de células NK de CAR + células T se lleva a cabo durante los ciclos de estimulación dos últimos, pero esto introduce una pérdida de células deseadas debido a la co-expresión de CD56 en algunos CAR + células T. Las células T se cultivaron en un sistema funcionalmente cerrado usando Vue bolsas de cultivo Vida pasado día 14. Un subconjunto de las células genéticamente modificadas y reproducidas T son típicamente criopreservado en día 14 o el día 21 (fin de los ciclos de estimulación # 2 o # 3) de co-cultivo en AAPC para servir como una fuente de material archivado para futuros análisis y para ser descongelados si los problemas no anticipados posteriormente se producen durante el proceso de fabricación. Las células T se recogen típicamente en o alrededor del día 28 de cultivo (Figura 3) que habitualmente expresan CAR&gt; 90% y son&gt; 80% viable (figura 2c, d). Anteriormente hemos demostrado que, después de cuatro semanas de co-cultura en la AAPC media veces la expansión de células CD3 + células T es 19.800 ± 11.313 con CA<html> R expresión + ser del 90% ± 7,5 13. Estas células T son criopreservados y someterse en proceso y de las pruebas de liberación que informa sobre la seguridad y el potencial terapéutico del producto acabado. Las pruebas de lanzamiento se lleva a cabo de acuerdo con las modificaciones de laboratorio clínico mejora (CLIA) para generar un certificado de análisis antes de la infusión en los destinatarios de los ensayos clínicos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1.jpg" /> Figura 1. Pasos que describen el proceso de electroporación y propagar CAR + células T de PB y UCB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . upload/50070/50070fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Caracterización de cultivos modificados genéticamente las células T de PB. (A) Expresión de EGFP en el Día 0 de primer ciclo de estimulación para evaluar la eficacia de la transferencia génica. Expresión de CD19 específico de CAR (CD19RCD28) como se evaluó por citometría de flujo en células CD3 +, CD8 + y CD4 + células T en (B) aproximadamente 24 horas después de la electroporación y (C) 28 días después de co-cultivo en AAPC. Similar expresión de CAR se observó con células T derivadas de UCB. (D) Cinética de expresión de CAR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3.jpg" /> Figura 3. Propagación de PB derivados CAR+ T células. Tasa de expansión numérico de CD3 + y CAR + células T derivadas de PB por repitió el co-cultivo de γ-irradiado en presencia de AAPC soluble recombinante humano IL-2 e IL-21-. Flechas hacia arriba indican las adiciones de γ-irradiado AAPC que marcan el comienzo de cada ciclo de estimulación. UCB-derivados de turismos + células T presentan tasas similares de expansión numérica. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4.jpg" /> Figura 4. Esquema del proceso de fabricación utilizando SB y sistemas de AAPC para modificar genéticamente y propagar CAR + células T derivadas de PB y UCB. CD19 específico de coche + células T se generaron mediante electro-transferencia de SB-derivados plásmidos de ADN superenrollado y posteriores de co-cultivo en K562 derivado de AAPC (clon n º 4) en presencia of IL-2 recombinante humana soluble e IL-21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <table border="1"><tbody><tr><td width="5"> Fuente de células T </td><td width="9"> Transposón * </td><td width="9"> Transposasa </td><td width="26"> Infusión de las células T </td><td width="1"> IRB # </td><td width="1"> NIH-OBA # </td><td width="1"> IND # </td></tr><tr><td> Autóloga (paciente derivado) ** </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Después autólogo de células madre hematopoyéticas trasplante </td><td> 2007-0635 </td><td> 0804-922 </td><td> 14193 </td></tr><tr><td> Alogénico (donante-derivado) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Después alogénico de células madre hematopoyéticas trasplante </td><td> 2009-0525 </td><td> 0910-1003 </td><td&gt; 14577 </td></tr><tr><td> Alogénico (donante-derivado) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Después del trasplante alogénico de sangre de cordón umbilical </td><td> 2010-0835 </td><td> 1001-1022 </td><td> 14739 </td></tr></tbody></table> * Tabla 1. Los ensayos clínicos bajo los auspicios de la FDA en MDACC para infundir CD19 específico CAR + células T propagada en AAPC. Las células T son prestados específico para CD19 a través de la expresión forzada de transposón SB codificación para un coche de 2 ª generación, CD19RCD28 designado, que las señales a través de CD28 y CD3 ε. ** Prueba descrito en la referencia 5.

Las células T que expresan un receptor CD19 específico de antígeno quimérico (CAR) se infunden como tratamiento de investigación de células B malignas en nuestros primero en humanos ensayos de terapia génica. Se describe la modificación genética de las células T utilizando el<em&gt; La Bella Durmiente</em&gt; (SB) sistema para introducir CD19-CAR específico y selectivo en la propagación diseñador CD19 + células presentadoras de antígeno artificiales.

Aplicación clínica de<em&gt; La Bella Durmiente</em&gt; Artificial y células presentadoras de antígenos para modificar genéticamente las células T de la sangre del cordón umbilical y periférica

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Este protocolo modifica genéticamente las células T para introducir receptores de antígenos quiméricos específicos para los antígenos tumorales, y luego propaga cantidades clínicamente significativas en células presentadoras de antígenos artificiales de diseño. Comienza con la electro transferencia de la bella durmiente. Transponer y transponer plásmidos de ADN A en células mononucleares quiescentes aisladas de sangre periférica o de cordón umbilical.A continuación, mida la eficiencia de la transfección mediante citometría de flujo. A continuación, se realizaron el cocultivo de las células T transfectadas durante siete días en células presentadoras de antígeno artificial derivadas de K 5 62 con la adición de citocinas exógenas en una estimulación de cuatro semanas. Los ciclos de proliferación proceden a analizar la criopreserva y liberar las células T car positivas electroporadas y propagadas para su aplicación en humanos.El sistema de transposición de la bella durmiente ofrece una alternativa a los enfoques de transferencia de genes basados en virus para introducir un gen de manera estable en la célula elegida. Una de las principales ventajas del sistema de la bella durmiente es que se pueden integrar genes a un costo realmente reducido en comparación con los plásmidos de ADN que se integran a través de recombinaciones ilegítimas no homólogas. Por lo tanto, la ventaja es que el sistema de la bella durmiente se puede utilizar para expresar un gen a bajo costo y alta eficiencia.En general, los individuos nuevos en este método inicialmente tendrán que superar la eficiencia de las células T electro en la propagación selectiva de células T car positivas en células presentadoras de antígenos artificiales. Ambos pasos son difíciles de dominar debido a la necesidad de co-cultivar. Células T modificadas genéticamente en células presentadoras de antígenos artificiales.Este método es útil en el campo de la inmunoterapia adoptiva, particularmente en la administración efectiva de genes y en la producción de un número clínicamente significativo de células T. La aplicación más amplia se extiende hacia la terapia del cáncer porque las células T del sistema inmunitario pueden modificarse para que sean específicas del tumor. Los encargados de demostrar el procedimiento serán Margaret Dawson y Matthew Fiola.Los técnicos de mi laboratorio primero diluyen la sangre periférica con un volumen igual de P-B-S-E-D-T-A y la sangre del cordón umbilical con cuatro volúmenes de P-B-S-E-D-T-A colocan lentamente 25 mililitros de sangre diluida sobre 12 mililitros de fial en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar el gradiente fial a 400 Gs durante 30 a 40 minutos sin interrupción. Ahora transfiera la fracción de la celda mononuclear a un tubo de centrífuga nuevo de 50 mililitros con P-B-S-E-D-T-A.Aumente el volumen a 50 mililitros y recoja las células por centrifugación. Lave suavemente las células una vez en 50 mililitros de cultivo completo, medio y centrífuga a 400 Gs durante 10 minutos. A continuación, agrupe los gránulos de células en CCM para realizar un recuento de células.Utilizando el método de exclusión triam blue. Las células mononucleares ahora se pueden utilizar para la electroporación o criopreservadas para su uso futuro. Si utiliza MNC criopreservada, descongele rápidamente dos veces 10 hasta la octava celda para una electroporación a gran escala, transfiera suavemente las celdas a un tubo de centrífuga de tamaño adecuado que contenga precalentamiento.Medios de cultivo RPMI completos sin fenol y pellets las células por centrifugación, resuspender las células mononucleares En P-F-R-P-M-I, realizar un recuento de células y transferir las células a un recipiente de cultivo celular de tamaño adecuado a una concentración de 10 de las seis células por mililitro. Equilibre las células en una incubadora humidificada durante dos horas. Coseche la MNC por centrifugación, luego vuelva a suspender suavemente y combine los gránulos de celdas en P-F-R-P-M-I y enumere las celdas Ahora transfiera dos veces 10 a la octava MNC a un tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros y centrifugue a 200 Gs durante 10 minutos sin descansos.Aspire el sobrenadante de modo que no queden medios residuales alrededor del gránulo de la célula. Prepare una placa estéril de 12 pocillos con 10 pocillos que contengan cuatro mililitros de P-F-R-P-M-I caliente y equilibre la placa en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. A continuación, reconstituya la solución efectora Lonzo Nucleo del kit de células T humanas según las instrucciones del fabricante para cada reacción.Q Vet prepara 100 microlitros de mezcla maestra de ADN que contiene una solución efectora nuclear de NU suplementada. 15 microgramos de la transposición en el plásmido y cinco microgramos del plásmido transpuesto. A continuación, disperse la pelletza de células T y vuelva a suspender una mezcla maestra de ADN de solución de afección nuclear NU a una concentración final de células dos veces la décima de la séptima célula por cada 100 microlitros.Transfiera con cuidado 100 microlitros de la suspensión celular a cada una de las 10 cubetas de afección de tronza nucleo, teniendo cuidado de evitar burbujas. Ahora toque el qve una vez y electro usando el programa U 0 1 4 para células T no estimuladas. Transfiera las cubetas y la placa de equilibrio de 12 pocillos a la campana de cultivo utilizando un amox de pipeta de transferencia de punta fina a 500 microlitros del medio de cultivo precalentado desde el pocillo correspondiente a cada veta.Transfiera las células electroporadas a la placa y deje que las células se recuperen en la incubadora de cultivos celulares durante dos horas. Luego, transfiera las células de todos los pocillos a un tubo de centrífuga estéril y granule las células después de un lavado, disperse la pelletización celular suavemente y vuelva a suspender en CCM para lograr una suspensión de una sola célula. Después de realizar un recuento de células, ajuste la concentración de células para atender a las seis células por mililitro en CCM.A continuación, transfiera la suspensión celular a un matraz de cultivo y colóquela en la incubadora durante la noche para generar células transfectadas con EGFP. Repita el protocolo de electroporación utilizando cinco veces 10 de las seis celdas por vete con cinco microgramos de plásmido EGFP de control amox. Recoja las células electroporadas y, a continuación, realice un recuento de células utilizando el método de exclusión de trien azul.A continuación, tiñir una o dos veces 10 de las seis células con anticuerpos específicos para CD tres, CD cuatro, CD ocho e IgG FC gamma humana como medida de la expresión de coches. Adquiera las celdas en calibre de fax. Analice los datos utilizando el software FCS express para determinar la expresión del automóvil.A continuación, calcule las células car positivas en cultivo. El clon A PC número cuatro derivaría de las células K 5 62 a moléculas coestimuladoras deseadas de células T coexpresadas Descongelar una alícuota de células T congeladas irradiadas, A A PC en un baño de agua a 37 grados Celsius. A continuación, lavar las células y CCM, enumerar las células viables por exclusión de color azul y calcular el número de A A PC viables necesarias para la estimulación.Mezcle las células electroporadas que expresan car y el A A PC irradiado con rayos gamma en un recipiente estéril en una proporción de uno a dos. Ajuste la relación A PC para la expresión de car en función de la citometría de flujo al día siguiente de la electroporación Agregue 30 nanogramos por mililitro de IL 21 a la suspensión de la celda. A continuación, Eloqua atendió las seis células por mililitro en matraces T 75 o bolsas de cultivo de vida y devolvió a la incubadora de cultivo, la electrotransferencia de plásmidos de ADN y la propagación de células T en radiación gamma.A A PC se puede utilizar para generar cantidades clínicamente atractivas de células T derivadas de sangre periférica y sangre de cordón umbilical para aplicaciones humanas. En esta caracterización de linfocitos T modificados genéticamente a partir de sangre periférica, la expresión de EGFP en el día cero del primer ciclo de estimulación, los controles para la eficiencia de la expresión de transferencia génica de CD-19 específico se evalúan mediante citometría de flujo en linfocitos T CD tres positivos, CD ocho positivos y CD cuatro positivos aproximadamente 24 horas después de la electroporación. Y luego, 28 días después del cocultivo en A PC, cinética de la expresión de CAR en células T cultivadas en un sistema funcionalmente cerrado.La propagación de las células T carpositivas derivadas de la sangre periférica a lo largo del tiempo puede generar un número clínicamente atractivo de células T que expresan el car de forma estable. Después de cuatro semanas de cocultivo en A A PC, la expansión media del pliegue de las células T CD tres positivas es de aproximadamente 19.800 con una expresión de coche del 90%. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo elegir desfilar y propagar células T que expresan un automóvil deseado.Recuerde controlar el crecimiento excesivo de células NK. La electroporación y propagación de las células T se lleva a cabo normalmente a lo largo de cuatro ciclos de estimulación de siete días. Se pueden realizar investigaciones adicionales, como ensayos de liberación de citocinas y citotoxicidad, para evaluar la especificidad redirigida de las células T modificadas genéticamente en el campo de la inmunoterapia adoptiva.Esta técnica nos ayuda a entender el potencial terapéutico de las células T que se infunden en los seres humanos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un protocolo de forma rápida, sencilla y rentable para la generación de donantes de origen multivirus CTL específicos (RCTL) para la perfusión del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas de trasplante (HSCT) con riesgo de desarrollar infecciones por CMV, EBV o Adv. Este proceso de fabricación es conforme a las GMP y debe garantizar la aplicación más amplia de células T inmunoterapia más allá de los centros especializados.

Generación de células T Multivirus específicos para prevenir / tratar las infecciones virales después de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas

Un nuevo método de CC independiente para la inducción y la expansión de células T específicas de antígeno se describe. HLA A2-Ig células antígeno artificial basada en la presentación (AAPC) se cargan con el HLA-A2 péptidos restringidos a expandirse de manera eficiente CTL del antígeno específico diverso. Esta tecnología tiene un gran potencial para el CTL basado inmunoterapia adoptiva.

HLA-Ig celdas en función de antígeno artificiales presentación para mejorar la eficiencia Ex vivo Ampliación de los Derechos Humanos CTL

Aquí se describe la primera práctica de fabricación (GMP)-cumple método de producción de virus específicos de los linfocitos T citotóxicos (CTL) de la sangre del cordón umbilical, una fuente de células T predominantemente ingenuo.

La expansión de los linfocitos T citotóxicos sangre del cordón umbilical que Citomegalovirus Target, Virus de Epstein-Barr, adenovirus y

Generación de linfocitos T de madre pluripotentes inducidas (iPS) a las células da un enfoque alternativo de la utilización de células madre embrionarias para células T basada en la inmunoterapia. El método muestra que mediante la utilización de...

Diferenciación dirigida de células madre pluripotentes inducidas hacia los linfocitos T

Presentamos aquí un método para desarrollar células T reguladoras (Tregs) específicas de antígeno funcional (Ag) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) para la inmunoterapia de la artritis autoinmune en un modelo murino.

Desarrollo de derivados de células madre Las células T reguladoras específicas de antígeno contra la autoinmunidad

Linfocitos T antígeno específicos son difíciles de caracterizar o utilizar en terapias debido a su extremadamente baja frecuencia. Aquí proporcionamos un protocolo para desarrollar una partícula magnética que puede atar a las células T antígeno específicas para enriquecer estas células y luego ampliarlas varias centenas para caracterización y tratamiento.

Enriquecer y ampliar las células T específicas de antígeno raro con nanopartículas magnéticas

Este artículo describe un método novedoso para generar antígenos tumorales inducidos por células madre pluripotentes inducidas por antígenos timáticos (iTE) por un sistema de cultivo timico tridimensional (3D). iTE son un subconjunto homogéneo de células T estrechamente relacionadas con células T ingenuas con la capacidad de proliferación, formación de la memoria y supresión tumoral.

Un sistema de cultivo timático tridimensional para generar emigrantes timémicos específicos de células madre pluripotentes inducidos por la murino

El objetivo de este protocolo es aislar a primates no humanos CD34 de las células+ de cebada la médula ósea, estas células con vectores lentivirales de modificar genes y para preparar un producto para infusión en el huésped autólogo. La longitud del protocolo total es aproximadamente de 48 h.

Preparación y modificación genética de primates no humanos tallo hematopoyéticas y células progenitoras

Aquí se presenta un protocolo para la supresión efectiva de la replicación del virus de la hepatitis B (VHB) en ratones mediante la utilización de la transferencia de células adoptivas (ACT) de linfocitos T específicos de antígeno viral derivado de células madre (Ag). Este procedimiento puede adaptarse para una posible inmunoterapia basada en ACT de infección por VHB.

Linfocitos T virales derivados de células madre suprimen la replicación del VHB en ratones

El presente protocolo describe un procedimiento optimizado de cultivo de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) para el injerto robusto de células editadas genéticamente in vivo.

Edición génica CRISPR/Cas9 de células madre y progenitoras hematopoyéticas para aplicaciones de terapia génica

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo optimizado para generar y probar células T reguladoras del receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Generación de linfocitos T reguladores del receptor de antígeno quimérico humano

Aprende a modificar genéticamente células T con receptores de antígeno quiméricos usando el sistema Sleeping Beauty y células presentadoras de antígenos artificiales para inmunoterapia contra cáncer.

Aplicación clínica de La Bella Durmiente Artificial y células presentadoras de antígenos para modificar genéticamente las células T de la sangre del cordón umbilical y periférica (Video) | JoVE Journal

Aplicación clínica de

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