Name: Preparación de las células dendríticas maduras cargadas con antígeno del tumor para inmunoterapia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprende a preparar células dendríticas maduras de grado clínico para inmunoterapia oncológica mediante diferenciación de monocitos con GM-CSF e IL-4, seguida de carga antigénica y maduración con poli ICLC.

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Los autores desean agradecer a Andrés Salazar (Oncovir, Inc.) por el don de la poli-ICLC.

1. El aislamiento y la criopreservación de PBMC 4 <ol><li> Asépticamente pico de uno de los puertos de acceso en la bolsa de leucaféresis utilizando un conjunto de transferencia de plasma. Usando una jeringa de 60 ml, transferir la aféresis obtenidos de pacientes en un frasco estéril de 500 ml. </li><li> Ajustar el volumen de la leucaféresis a 2x su volumen original utilizando medio RPMI a temperatura ambiente. Mezclar bien. </li><li> Mezcle suavemente la botella de Ficoll-Paque PLUS. Añadir 12 ml de Ficoll-Paque PLUS en el tubo cónico estéril de 50 ml. </li><li> Suavemente capa de 30 ml del producto leucaféresis diluido a cada tubo cónico estéril de 50 ml que contiene Ficoll. Tenga cuidado de no molestar a la interfaz entre el Ficoll y la suspensión celular. </li><li> Repetir los pasos 1.3 y 1.4 hasta que todo el leucaféresis se ha acodado. </li><li> Centrifugar los tubos cónicos de 50 ml a 1000 × g durante 20 min a temperatura ambiente sin freno. </li><li> Cosechar cuidadosamente la capa turbia de PBMC de cada tubo y transfer para nuevos tubos estériles de 50 ml. </li><li> Añadir medio RPMI a cada tubo a un volumen final de 50 ml. Mezclar suavemente por inversión. </li><li> Centrifugar las células a 500 x g durante 10 min a 4 ° C con el freno completo. </li><li> Retirar los sobrenadantes de cada tubo. Resuspender los sedimentos de células de cada tubo y añadir medio RPMI a un volumen final de 50 ml. Mezclar suavemente por inversión. </li><li> Centrifugar las células a 500 x g durante 6 min a 4 ° C. </li><li> Retirar los sobrenadantes de cada tubo. Volver a suspender y poner en común las suspensiones de células en un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Llevar el volumen de las PBMC agrupados hasta 50 ml con medio RPMI más. Mezclar suavemente por inversión. </li><li> Centrifugar las células a 300 xg durante 6 min a 4 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular en 50 ml de RPMI. Mezclar con cuidado para asegurarse de suspensión celular uniforme. </li><li> Contar el número de células y determinar la viabilidad celular. Calcular el número total de células viables. </li><li> Centrifugar las células a 300× g durante 6 min a 4 ° C. Preparar los medios de congelación. Medios de congelación se compone de 10% dimetil sulfóxido (DMSO; Miltenyi Biotec) en el suero humano AB (Valle Biomédica). </li><li> Eliminar el sobrenadante. Resuspender las células a una concentración final de 2 x 10 8 células / ml en medio de congelación frío. </li><li> Hacer alícuotas de 1 ml en 1,8 ml crioviales. </li><li> Transfiera los crioviales en el congelador de velocidad controlada y comenzar la carrera de congelación, Programa 1. Al final de la carrera, la transferencia de los crioviales congelados inmediatamente en la fase de vapor del congelador de nitrógeno líquido. </li></ol> 2. Día 0: La diferenciación de las células dendríticas a partir de monocitos <ol><li> Añadir 30 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo a un tubo cónico de 50 ml estéril. </li><li> Descongelar las alícuotas de PBMC congelados por agitación suave en el baño de agua a 37 ° C. Cuando completamente descongelado, transferir el contenido de los viales al tubo cónico estéril de 50 ml. Mezclar bien. </li><li> Centrifugar las células durante 6 mina 500 x g a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células sedimentadas en un pequeño volumen de RPMI / 1% de plasma autólogo. A continuación, añadir más RPMI / 1% de plasma autólogo a un volumen final de 50 ml. Mezclar bien. </li><li> Centrifugar las células de nuevo durante 6 min a 500 x g a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 50 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo. Mezclar bien. </li><li> Contar el número de células y determinar la viabilidad celular. Calcular el número total de células viables. </li><li> Placa de 1,40 x 10 8 células en 40 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo a 225 cm 2 EasYFlask. Repita hasta que todas las células se han plateado. </li><li> Incubar las EasyFlasks planas en su lado para 1 - 2 horas a 37 ° C en el incubador de cultivo tisular que contiene 5% de CO 2 para permitir que los monocitos se adhieran al matraz. </li><li> Cuando la incubación se completa, retire el EasYFlask de la incubadora y se lava dos veces para eliminar las células no adherentes USI30 ng ml de medio RPMI precalentado. </li><li> Después del segundo lavado, añadir 40 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo con 400-1.000 UI / ml de IL-4 y 100-1.000 UI / ml de GM-CSF 5-8. En este protocolo, estamos usando 400 UI / ml de IL-4 y 100 UI / ml de GM-CSF. </li><li> Incubar las EasyFlasks durante 2 días a 37 ° C en el incubador de cultivo de tejido que contenía 5% de CO 2. </li></ol> 3. Día 2: La alimentación de las células dendríticas con IL-4 y GM-CSF <ol><li> Añadir 4 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo con 400-1.000 UI / ml de IL-4 y 100-1.000 UI / ml de GM-CSF a cada EasYFlask. Mezclar por agitación y balanceándose de lado. </li><li> Incubar las EasyFlasks para 3 días más (hasta el día 5) a 37 ° C en el incubador de cultivo de tejido que contenía 5% de CO 2. </li></ol> 4. Día 5: La recolección de las células dendríticas inmaduras <ol><li> Recoger las culturas agitando vigorosamente los frascos y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para volver a suspender las células no adherentes y poco adheridos. Transferir elcélulas cosechadas a nuevos tubos cónicos de 50 ml. </li><li> Centrifugar los tubos a 500 xg durante 6 min a temperatura ambiente. Retirar los sobrenadantes y resuspender el sedimento celular en 50 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo. Mezclar bien. </li><li> Contar el número de células y determinar la viabilidad celular. Calcular el número total de células viables. </li><li> Centrifugar los tubos a 500 xg durante 6 min a temperatura ambiente. Placa de 1-2 x 10 6 células por pocillo en 3 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo con 400 UI / ml de IL-4 y 100 UI / ml de GM-CSF en placas de cultivo tisular de 6 pocillos. </li><li> Incubar las placas a 37 ° C en el incubador de cultivo tisular que contiene 5% de CO 2 durante la noche. </li></ol> 5. Día 6: Maduración y Antigen carga de las células dendríticas <ol><li> Añadir 10 g / ml de KLH a 1/3 de los pocillos en las placas de cultivo de 6 pocillos. Remolino de las placas para mezclar. KLH sólo se añade a 1/3 de los pozos debido a KLH sólo se utiliza para la primera vacuna DC. Tras DC vacunas conTain sólo los péptidos antigénicos tumorales. </li><li> DC puede ser estimulado para madurar el uso de diferentes estímulos. Los estímulos de maduración más comunes que se han utilizado en estudios clínicos ha sido un cóctel de citoquinas (IL-1 β, TNF, e IL-6) y la prostaglandina E2 (PGE2) 9,10. Más recientemente, el uso de agonistas de receptores de tipo Toll (TLR) han ganado popularidad 11,12. En este protocolo, agregue 2 mg / ml poliinosínico-policitidílico Carboximetilcelulosa ácido poli-L-lisina (poli-ICLC) a los pocillos y mezclar bien. Poli-ICLC es la formulación de grado clínico de poli-IC que se estabiliza con poli-L-*-lisina y carboximetilcelulosa (fabricado por Oncovir, Inc.). </li><li> Añadir 100 g / ml antígenos peptídicos largos (NY-ESO-1 y / o Melan-A/MART-1) a sus pocillos designados, cada pocillo recibe sólo un único péptido para evitar competencia cruzada 13. </li><li> Incubar las placas a 37 ° C en el incubador de cultivo tisular que contiene 5% de CO &lt;sub&gt; 2 O / N. </li></ol> 6. Día 7: La criopreservación de las células dendríticas <ol><li> Preparar la solución de congelación DC con plasma autólogo y 10% DMSO. Centrifugar la solución de congelación DC en 2000 × g durante 20 min a 4 ° C para eliminar cualquier material particulado. Transferir el sobrenadante a un nuevo marcado con 15 ml de tubo cónico. Almacenar a 4 ° C hasta su uso. </li><li> Cuando se termina la incubación durante la noche, la cosecha y la piscina todos los pocillos que contienen los DC pulsados ​​con los péptidos en tubos cónicos de 50 ml. </li><li> Centrifugar los tubos a 500 g durante 6 min. Eliminar el sobrenadante. Resuspender el sedimento de células en 5 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo. Llevar el volumen total hasta 50 ml con RPMI / 1% de plasma autólogo. Mezclar bien. </li><li> Contar el número de células y determinar la viabilidad celular. Calcular el número total de células viables. </li><li> Centrifugar los tubos a 500 xg durante 6 min a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante y resuspender cada pellet en 5 ml steriLe NaCl al 0,9%, USP y transferencia a nuevos tubos cónicos de 15 ml. Llevar a cada suspensión de células a 14 ml con más estéril de NaCl al 0,9%, USP. Tapar y mezclar por inversión. </li><li> Repita el paso anterior dos veces. Después de la última centrifugación, eliminar los sobrenadantes, conseguir lo más cerca posible a los gránulos de las células sin molestar a los gránulos. </li><li> Resuspender los sedimentos celulares en DC Solución congelación a 4 - 20 x 10 6 células / ml y la alícuota de 1 ml a cada uno 1,8 ml frasco CRIOTUBO. </li><li> Utilice el congelador de velocidad controlada, Programa 1, para congelar por las partes alícuotas de las vacunas de DC y transferir inmediatamente en la fase de vapor de un congelador de nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo. </li></ol> 7. Pruebas de liberación de lotes <ol><li> Cada lote de vacuna contra la DC debe ser evaluado y cumple con los criterios específicos de liberación de lotes (Tabla 1), antes de ser declarada apta para la inyección en los pacientes en el estudio, por lo general de 5 a 6 semanas después de la preparación de la vacuna. </li><li> Viabilidad:Evaluar la viabilidad de la vacuna DC a través de un contador de células automatizado. La especificación mínima viabilidad aceptable es&gt; 70%. </li><li> Identidad: Evaluar la identidad de la DC maduras (CD11c + CD14-CD83 +) por citometría de flujo. El porcentaje de células CD11c + debe ser&gt; 50%. El porcentaje de células CD11c + y CD14 + debería ser &lt;30% y el porcentaje de CD11c +, CD14-, CD83 + y células deben ser&gt; 50%. </li><li> Esterilidad: Prueba de la vacuna contra la DC para detectar la presencia de bacterias y hongos anaeróbicos y aeróbicos por cultivo directo y tinción de Gram. Evaluar la presencia de micoplasma utilizando un sistema de cultivo directo y ADN fluorocromo ensayo de tinción con la línea celular indicadora. Para estas pruebas, el conjunto de especificación mínima es que no se observa crecimiento de todas las culturas. </li><li> La endotoxina: Evaluar el contenido de endotoxina utilizando el ensayo cromogénico LAL cinético-Kinetic QCL y debe ser &lt;50 EU / ml para satisfacer los criterios mínimos. </li><li&gt; Función: Evaluar la función DC en una reacción mixta de linfocitos mediante la incubación con las células T alogénicas. Se ha informado de la presencia de la proliferación en comparación a los DC no estimuladas (Figura 3). </li></ol>

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Los autores han recibido apoyo financiero de las siguientes opciones: NIH (AI061684, AI071078, AI044628 y AI084578 K08 (Miller)), la Fundación Bill y Melinda Gates, la Fundación Doris Duke Charitable, Instituto de Investigación del Cáncer, la Alianza para la Investigación de Lupus y la Esmeralda Fundación. Nina Bhardwaj es un co-inventor de patentes relacionadas con la preparación y el uso de células dendríticas para manipular la inmunidad. Los autores no tienen otras relaciones relevantes o de activos financieros con ninguna organización o entidad que tenga un interés financiero en o conflicto financiero con el tema o materiales discutidos en el manuscrito, aparte de los descritos.

Fase I y II de los ensayos clínicos de los DC derivadas de monocitos he demostrado que inducen la respuesta inmune en los pacientes sin embargo el éxito clínico ha sido limitado 1. Esto puede deberse en parte a la falta de consenso sobre la forma de generar los países en desarrollo óptimos para el uso de inmunoterapia tumoral. Aunque hay numerosas maneras de generar los DC de grado clínico, estos métodos varían en términos de la utilización de citoquinas usados ​​para diferenciar los monocitos, los estímulos ...

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 medio con L-glutamina</td><td>BioWhittaker</td><td>12-702F</td><td></td></tr><tr><td>1M solución salina tamponada HEPES</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>BioWhittaker</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina humana, solución al 25% USP</td><td>Aventis Behring</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Hypaque PREMIUM</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>Suero AB humano</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina estéril USP</td><td>Hospira</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoMACS DMSO </td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-303</td><td></td></tr><tr><td>Leukine GM-CSF, 0,5 mg/ml</td><td>Berlex</td><td>A02266</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP IL-4</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-101</td><td></td></tr><tr><td>Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml</td><td>Oncovir</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>VACMUNE KLH</td><td>Biosyn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>225 cm² EasyFlask</td><td>Nalgene Nunc</td><td>159934</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos</td><td>Becton Dickinson</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>1,8 ml Viales CryoTube</td><td>Nalgene Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Congelador de velocidad controlada</td><td>Thermo</td><td>CryoMed</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de las células dendríticas maduras cargadas con antígeno del tumor para inmunoterapia

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Mientras que los estudios clínicos han establecido que las vacunas de DC cargadas con antígeno son seguros y prometedora terapia para los tumores 1, su eficacia clínica queda por establecer. El método descrito a continuación, preparado de conformidad con las Buenas Proceso de Fabricación (GMP) directrices, es una optimización del procedimiento de preparación ex vivo más común para la generación de un gran número de países en desarrollo para los estudios clínicos 2. Nuestro método utiliza el TLR 3 agonista sintético poliinosínico-policitidílico Carboximetilcelulosa-ácido poli-L-lisina (poli-ICLC) para estimular los países en desarrollo. Nuestro estudio anterior estableció que poli-ICLC es el más potente estímulo de maduración individual para países en desarrollo humano según lo evaluado por una regulación positiva de CD83 y CD86, la inducción de la interleucina-12 (IL-12), factor de necrosis tumoral (TNF), interferón gamma inducida proteína 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), y los interferones tipo I (IFN), y la interleucina mínima 10 (IL-10) de producción. </p&gt; Países en desarrollo se diferencian a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs congeladas) obtenidos por leucoféresis. PBMC se aíslan mediante centrifugación en gradiente de Ficoll y se congelaron en alícuotas. En el Día 1, las PBMC se descongelan y se sembraron en matraces de cultivo tisular para seleccionar para los monocitos que se adhieren a la superficie de plástico después de 1-2 horas de incubación a 37 ° C en el incubador de cultivo de tejido. Después de la incubación, los linfocitos se eliminan mediante lavado y los monocitos adherentes se cultivaron durante 5 días en presencia de interleucina-4 (IL-4) y el factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF) para diferenciar a los DC inmaduras. En el día 6, las DC inmaduras son pulsadas con la proteína hemocianina de lapa californiana (KLH), que sirve como control para la calidad de la vacuna y puede aumentar la inmunogenicidad de la vacuna 3. Los países en desarrollo son estimulados a madurar, cargados de antígenos de péptido, y se incubaron durante la noche. En el día 7, las células se lavaron, y se congelaron en alícuotas de 1 ml que contienen4-20 x 10 6 células usando un congelador de velocidad controlada. Pruebas de liberación del lote para los lotes de centros de datos se lleva a cabo y debe cumplir con las especificaciones mínimas antes de ser inyectadas en pacientes.

Entre el 10 - 20% de PBMCs de partida se diferencian en países en desarrollo al final del periodo de cultivo. DC maduras son CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 +, y CCR7 + (Figura 1). Ellos expresan altos niveles de MHC de clase I y II y las moléculas de moléculas coestimuladoras CD80 y CD86. Poli-ICLC también indujo niveles más bajos de PDL-1 en comparación con otros agonistas de TLR 14. Además, estos poli-IC-DCs maduradas segregan grandes cantidades de IL-12 (Figura 2 y 15,1...

El método más comúnmente utilizado para la generación de un gran número de células dendríticas autólogas (DC) para su uso en inmunoterapia tumoral se describe. El método utiliza la IL-4 y GM-CSF para diferenciar países en desarrollo a partir de monocitos. Las CD inmaduras son estimuladas para maduro y luego se cargan con antígenos antes de que se inyectan de nuevo en el paciente.

Preparación de las células dendríticas maduras cargadas con antígeno del tumor para inmunoterapia

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la preparación de células dendríticas de grado clínico para inmunoterapia. Esto se logra primero congelando células mononucleares sanguíneas periféricas aisladas de leucoaféresis. En el segundo paso, se descongelan las alícuotas congeladas de pbmc y los monocitos se diferencian en células dendríticas en presencia de G-M-C-S-F e IL-4 durante cinco días.A continuación, se recolectan las células dendríticas, se estimulan con péptidos y se maduran durante la noche con el agonista del TLR tres, poli ICLC. Durante el paso final, se recolectan las células dendríticas maduras y se congelan en alícuotas. Estas alícuotas congeladas de células dendríticas maduras pueden descongelarse, transferirse a jeringas e inyectarse nuevamente en los pacientes como parte de su inmunoterapia.El procedimiento será demostrado por Merited Sedia y Farra Hassan, ambos técnicos de investigación en mi laboratorio. Utilizando un conjunto de transferencia de plasma, comience por insertar asépticamente uno de los puertos de acceso en la bolsa de leucoaféresis. Luego, use una jeringa de 60 mililitros para transferir la leucoaféresis a una botella estéril de 500 mililitros. A continuación, usando RPMI a temperatura ambiente, ajuste el volumen de la leucoaféresis a dos veces su volumen original y mezcle bien. Después de mezclar suavemente un frasco de Ficoll-Paque, agregue 12 mililitros de la solución en tubos cónicos estériles de 50 mililitros, y luego cúbra cuidadosamente 30 mililitros del producto de leucoaféresis diluido en cada tubo de Ficoll.Tenga cuidado de no perturbar la interfase entre el medio FI y la suspensión celular. Centrifugue los tubos durante 20 minutos a 1000 ×g y temperatura ambiente sin frenado. Luego, recoja cuidadosamente la capa turbia de MNC de cada tubo y transfiérala a nuevos tubos estériles de 50 mililitros.A continuación, agregue RPMI a cada tubo hasta un volumen final de 50 mililitros, y luego mezcle suavemente las suspensiones celulares por inversión. Después de centrifugar las células durante 10 minutos a 500 G y 4 grados Celsius, retire los sobrenadantes de cada tubo y resuspenda los pellets celulares de cada tubo en RPMI hasta un volumen final de 50 mililitros. Tras mezclar suavemente los tubos por inversión, determine el número y la viabilidad de las células.A continuación, centrifugue las células y resuspenda el precipitado en medio de congelación recién preparado a una concentración final de dos veces 10 a la ocho células por mililitro. Transfiera un mililitro de la solución celular a viales criogénicos de 1,8 mililitros. Luego, transfiera los viales criogénicos a un congelador de velocidad controlada e inicie el programa de congelación. Al finalizar el programa, transfiera inmediatamente los viales criogénicos congelados a la fase de vapor de un congelador de nitrógeno líquido.Al día siguiente, descongele las alícuotas de pBMC congeladas en un baño de agua a 37 grados Celsius mediante agitación suave. Una vez completamente descongeladas, transfiera el contenido de los viales a tubos cónicos estériles de 50 mililitros que contengan 30 mililitros de RPMI y plasma autólogo, y centrifugue. Las células, suspenda cuidadosamente el sedimento celular en un pequeño volumen de RPMI más plasma autólogo.Luego, agregue más RPMI más plasma autólogo hasta un volumen final de 50 mililitros. Después de mezclar completamente las suspensiones, siembre 1,4 × 10⁸ células en 40 mililitros de RPMI más plasma autólogo en un frasco Easy de 225 centímetros cuadrados. Incube el frasco Easy en posición horizontal durante una a dos horas a 37 grados Celsius en el incubador de cultivo celular que contiene 5 % CO₂, para permitir que los monocitos se adhieran al frasco. Una vez finalizada la incubación, lave el frasco Easy dos veces con 30 mililitros de RPMI precalentado para eliminar las células no adherentes.Después del segundo lavado, agregue 40 mililitros de RPMI más plasma autólogo con IL-4 y G-M-CSF a las células, e incube el matraz EASI durante dos días a 37 °C y 5 % de dióxido de carbono. Cinco días después, agite enérgicamente los matraces y pipetee arriba y abajo para resuspender. Transfiera las células no adherentes y las adherentes débilmente a nuevos tubos cónicos de 50 mililitros.Después de centrifugar las células, suspendemos los sedimentos celulares en 50 mililitros de RPMI más plasma autólogo. Después de mezclar y lavar las células, se siembran nuevamente una a dos veces 10 de las seis células por pocillo en tres mililitros de RPMI más plasma autólogo con IL-4 y G-M-CS-F en placas de cultivo celular de seis pocillos. Luego, se incuban las placas a 37 grados Celsius en el incubador de cultivo celular que contiene 5 % de dióxido de carbono durante la noche. Al día siguiente, se añaden 10 microgramos por mililitro de KLH a un tercio de los pocillos en las placas de cultivo de seis pocillos y se mezclan las placas agitándolas suavemente.Luego, agregue dos microgramos por mililitro de poli ICLC a los pocillos y mezcle bien. A continuación, agregue 100 microgramos por mililitro de antígenos peptídicos largos a los pocillos designados, colocando en cada pocillo un solo péptido para evitar la competencia cruzada. Incube las placas durante la noche a 37 grados Celsius en un incubador de cultivo celular que contenga un 5% de dióxido de carbono el día siete, luego recolecte y agrupe todos los pocillos que contengan células dendríticas.Pulso con los péptidos el día seis en nuevos tubos cónicos de 50 mililitros. Después de centrifugar las células, resuspender, suspender los pellets celulares aspirados en cinco mililitros de RPMI más plasma autólogo, y luego llevar el volumen total a 50 mililitros con RPMI más plasma autólogo y mezclar bien las suspensiones celulares. Después de calcular el número total de células viables, centrifugar los tubos, resuspender cada pellet en cinco mililitros de cloruro de sodio estéril y luego lavar cada suspensión celular dos veces más con 14 mililitros de cloruro de sodio estéril.Después de cada lavado, mezcle los tubos tras el segundo lavado. Reuspenda los pellet celulares en solución de congelación para células dendríticas a una concentración de cuatro a veinte veces 10⁶ células por mililitro y alícuote un mililitro de cada suspensión celular en viales criogénicos de 1,8 mililitros. Finalmente, utilizando el congelador de velocidad controlada, congele las alícuotas de vacunas de células dendríticas y luego transfiera inmediatamente las alícuotas a la fase de vapor de un congelador de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.Entre el 10 y el 20 % de las células mononucleares de sangre periférica iniciales se diferencian en células dendríticas al final del período de cultivo. La maduración de las células dendríticas en respuesta a poli ICLC, representada por las líneas en negrita, se evaluó según la expresión de CD83, CD40 y CCR7, y se comparó con células dendríticas no estimuladas, representadas por los tonos grises. Como se muestra en estos gráficos de barras, las células dendríticas maduras inducidas con poli ICLC en este experimento, derivadas de tres donantes sanos, secretan grandes cantidades de IL-6, IL-8, IL-12 y TNF-α. Estas células maduras con poli ICLC también inducen la proliferación de linfocitos T alógenos, evidenciada por la expresión de CFSE, así como la producción de interferón gamma tras su desarrollo.Esta técnica abrió un camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploraran el uso de células dendríticas en inmunoterapia contra el cáncer y las enfermedades infecciosas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra el procedimiento para la diferenciación de células dendríticas mieloides de la médula ósea de ratón. El aislamiento de la tibia y el fémur de ratón, y el procesamiento de la médula ósea se demuestran. Imágenes que demuestran la morfología celular, antes y después de la diferenciación, y figuras que representan el fenotipo celular y la IL-12 después de la maduración de la producción con CpG se muestran.

Cultura de células dendríticas mieloides a partir de precursores de médula ósea

La presentación de antígenos en los órganos linfoides secundarios por las células dendríticas es fundamental para el inicio de la célula T mediada por la respuesta inmune adaptativa. Aquí se demuestra la cultura de la médula ósea procedentes de células dendríticas murinas, la activación, y el etiquetado de dos fotones de imágenes.

Generación de médula ósea procedentes de células murinas dendríticas para su uso en dos fotones de imágenes

Presentamos nuestra optimizado de alto rendimiento protocolo nucleofection como una forma eficiente de la transfección de primaria monocitos humanos derivados de células dendríticas, ya sea con el ADN de plásmido o siRNA sin causar la maduración celular. Nos proporcionan evidencia adicional para silenciar siRNA éxito de gen diana RIG-I tanto en el mRNA y los niveles de proteína.

Protocolo optimizado para la transfección eficiente de células dendríticas, sin maduración de las células

Evaluada en huéspedes inmunocompetentes singenéticos, la vacuna de células dendríticas (DC) basada en células madre cancerosas (CSC) demostró una inmunidad antitumoral significativamente mayor que las vacunas tradicionales de DC pulsadas con células tumorales a granel heterogéneas.

Generación de una nueva vacuna de células dendríticas usando melanoma y células madre escamosas del cáncer

Las células dendríticas inmaduras pueden diferenciarse selectivamente en células dendríticas tolerogénicas o maduras para regular el equilibrio entre inmunidad y tolerancia. Este trabajo presenta un medio para generar a partir de células dendríticas inmaduras derivadas de monocitos (moDCs), in vitro tolerogénicas y moDCs maduras que difieren en fenotipos metabólicos.

Generación de inmaduras, maduras y tolerogénico células dendríticas con diferentes fenotipos metabólico

Derivados de monocitos DC (MoDC) puede detectar pequeñas cantidades de moléculas asociadas de peligro y por lo tanto son fácilmente preparada. Proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento de MoDC de sangre y los tumores y su activación con complejos inmunes mientras destacando medidas claves que deben considerarse para evitar su activación prematura.

Protocolo de aislamiento de células dendríticas derivadas de monocitos de ratón y su activación posterior In Vitro con complejos inmunes Tumor

Aquí, presentamos un protocolo para desarrollar y caracterizar células dendríticas tolerogénicas (TolDCs) y evaluar su utilidad de la inmunoterapia.

Desarrollo y caracterización funcional de células dendríticas tolerogénicas murino

El dispositivo o placa de transimmunización (TI) y los protocolos relacionados se han desarrollado para replicar las características clave de la fotoquimioterapia extracorpórea (ECP), en un entorno experimental, lo que permite la producción de células (DCs) para la inmunoterapia oncológica.

Nuevo protocolo para la generación de células dendríticas inmunogénicas fisiológicas

El protocolo presenta un modelo de inmunoterapia contra el cáncer utilizando la vacunación tumoral basada en células con melanoma B16-F10 que expresa Flt3L. Este protocolo demuestra los procedimientos, incluida la preparación de células tumorales cultivadas, la implantación del tumor, la irradiación celular, la medición del crecimiento tumoral, el aislamiento de las células inmunitarias intratumorales y el análisis de citometría de flujo.

Modelo experimental de inmunoterapia de melanoma utilizando vacunación tumoral con una citocina hematopoyética

Se presenta un protocolo único y completo para generar células dendríticas derivadas de monocitos humanos desialiladas (mo-DC) a partir de células mononucleares aisladas de sangre periférica (PBMC) utilizando un tratamiento con siaridasa. Además, se describen métodos para evaluar la caracterización fenotípica y funcional de las mo-DC y evaluar cómo el tratamiento con sialidasa mejora el nivel de maduración de las mo-DC.

Generación de células dendríticas derivadas de monocitos con diferentes fenotipos sialilados

Este protocolo describe la reprogramación in vivo de células cancerosas de ratón en células dendríticas tipo 1 dentro del microambiente tumoral a través de la expresión forzada de los factores de transcripción PU.1, IRF8 y BATF3.

Reprogramación intratable in vivo de células tumorales a células dendríticas convencionales tipo 1

Aprende a preparar células dendríticas maduras de grado clínico para inmunoterapia oncológica mediante diferenciación de monocitos con GM-CSF e IL-4, seguida de carga antigénica y maduración con poli ICLC.

Preparación de las células dendríticas maduras cargadas con antígeno del tumor para inmunoterapia

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