Imágenes en directo de las respuestas de drogas en el microambiente tumoral en modelos de ratón de cáncer de mama

El objetivo general de este procedimiento es rastrear en tiempo real la penetración del fármaco y la respuesta terapéutica a la administración de un fármaco terapéutico. Esto se logra tratando primero al animal con el medicamento. A continuación, se expone la glándula mamaria inguinal que contiene el tumor mediante la creación de un colgajo de piel.

A continuación, el ratón se transfiere a la etapa microscópica y se mide la saturación de oxígeno en sangre y la frecuencia del pulso y se inserta una línea permanente para la administración de líquidos y fármacos o tintes. Finalmente, se adquieren imágenes time-lapse para su posterior análisis. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran cambios en la muerte celular o las interacciones del estroma tumoral en respuesta a un fármaco a través de la microscopía confocal de disco giratorio en vivo de tumores mamarios de ratón.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del microambiente tumoral, como la forma en que los diversos componentes del estroma de un tumor influyen en la respuesta al tratamiento. Antes de comenzar, consulte el protocolo escrito para conocer los horarios típicos de administración de medicamentos e imágenes. Encienda un esterilizador de perlas caliente y deje que alcance al menos 200 grados centígrados.

Después de lavar las herramientas quirúrgicas con agua y jabón, incluyendo un par de pinzas con dientes, un par de pinzas dentadas y dos pares de tijeras, use el esterilizador de perlas calientes para esterilizarlas durante al menos 30 segundos. Entonces déjalos. Fresco. Coloque un empapador de laboratorio encima de la tapa de espuma de poliestireno que se utilizará como plataforma quirúrgica.

Use cinta de laboratorio para fijar un cono de nariz con una línea al sistema de anestesia al empapador de laboratorio y cierta aguja de calibre 18 de una pulgada y media a través de la cinta en la tapa de espuma de poliestireno a cada lado del cono de la nariz para mantener el cono de la nariz asegurado en su lugar. Reserva la gasa estéril Betadine. Dos toallitas con isopropanol al 70%, un portaobjetos de microscopio, superpegamento y cuatro trozos de cinta de laboratorio de media pulgada de ancho.

Después de anestesiar al animal en una cámara de inducción, cuando esté respirando profunda y lentamente, transfiera el ratón a la plataforma quirúrgica, con el lado ventral hacia arriba. Para evitar la presión alta, abra la línea de anestesia a la plataforma quirúrgica y luego cierre la línea de anestesia a la cámara de inducción. Reducir la concentración de isoflurano del 4% al 2,5%Compruebe que la profundidad de la anestesia es suficiente para la cirugía realizando un pinzamiento de la almohadilla del pie.

Si el animal no reacciona, use cuatro pedazos de cinta de laboratorio para asegurar sus extremidades a la plataforma quirúrgica y use una maquinilla de afeitar eléctrica para quitar el pelo de la superficie ventral. Utilice toallitas de isopropanol al 70%, seguidas de Betadine aplicado a gasas estériles para desinfectar la superficie ventral del animal con tijeras y pinzas con dientes. Realizar una incisión subcutánea en la línea media ventral desde unos tres milímetros por encima de la uretra hasta la apófisis xifoides.

Tenga cuidado de evitar perforar o cortar el peritoneo con las tijeras y las pinzas dentadas. Se separa suavemente la piel de la cavidad peritoneal con la glándula mamaria inguinal que contiene el tumor que se va a fotografiar. Coloque un portaobjetos de microscopio de vidrio contra el colgajo de piel de modo que la mayor parte del tumor quede plana una vez que el ratón se coloca en la plataforma, y para que no quede obstruido por las extremidades traseras.

Una vez que el portaobjetos del microscopio se haya colocado correctamente, use superpegamento para unir el portaobjetos a la superficie externa de la piel. Retire la cinta de laboratorio que sujeta las extremidades del animal. Abra la línea de anestesia a la etapa del microscopio y luego cierre la línea de anestesia a la plataforma quirúrgica.

Transfiera rápidamente al animal a la etapa del microscopio Una vez que el animal haya sido transferido, coloque y asegure la línea de anestesia y el cono de la nariz para asegurarse de que el ratón permanezca anestesiado y esté en una posición cómoda. Reducir la concentración de isoflurano al 1,5%Exponga el tumor de modo que se coloque en la parte superior y en el centro de uno de los puertos de imagen cubiertos de vidrio en la platina del microscopio. Inserte la vía intraperitoneal permanente con equipo de infusión alado conectado a la jeringa de un mililitro que contiene solución salina PBS estéril o solución salina con yoduro de propidio.

Cuando se inserte la vía intraperitoneal, inyecte al animal 100 microlitros de solución salina con yoduro de propidio y continúe inyectando 50 microlitros de solución salina con yoduro de propidio cada hora hasta que se complete la sesión de imagen. Con las piezas oculares, verifique que el tumor esté correctamente colocado y que el portaobjetos del microscopio y la línea intraperitoneal estén suavemente pegados. El portaobjetos debe estar asegurado lo suficientemente suelto como para que el flujo sanguíneo al tejido no se obstruya.

Pegar el portaobjetos del microscopio ayuda a minimizar los artefactos de imagen introducidos por la respiración del animal para adquirir imágenes de lapso de tiempo. Utilice el software de código abierto micromanager, compile y analice los datos brutos utilizando IRIS u otro software de análisis de imágenes. Las hebras DExT conjugadas con fluorescencia se pueden utilizar como marcador sustituto para la administración de fármacos en los tejidos.

Aquí se muestra la llegada de dos megadalton dextrano IV conjugados fitzy inyectados en un ratón que expresa la proteína fluorescente azul en células de cáncer de mama. Tras la llegada del fármaco al tumor, se pueden obtener imágenes de la extravasación y la difusión para determinar la vida media intravascular y la distribución del fármaco. Aquí, se muestra la extravasación y distribución de 10 kilodalton dextran IV conjugado LOR inyectado en un ratón que expresa proteína fluorescente azul en células de cáncer de mama y proteína fluorescente verde en células mieloides.

Las imágenes pueden proporcionar información sobre el tipo de muerte celular que sufren las células cancerosas. Aquí, se observan cambios nucleares estructurales indicativos de necrosis o apoptosis en un ratón que expresa una proteína fluorescente verde conjugada con su dos b. Después del tratamiento con doxorrubicina, la muerte de las células cancerosas inducida por la quimioterapia con frecuencia resulta en un reclutamiento reactivo de células inmunitarias en los tumores.

Este es un ejemplo de esta respuesta estromal al tratamiento agudo con doxorrubicina en un ratón que expresa proteínas fluorescentes azules y verdes en células de cáncer de mama y mieloides, respectivamente. Además de visualizar la respuesta estromal general a la quimioterapia, aquí también se pueden visualizar las respuestas estromales especializadas. La fagocitosis del material celular necrótico por una célula vecina se muestra una vez dominada.

Esta técnica se puede realizar en 30 a 60 minutos y los animales se pueden fotografiar durante 12 a 40 horas si se realiza correctamente.