Name: Imágenes en directo de las respuestas de drogas en el microambiente tumoral en modelos de ratón de cáncer de mama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprende a rastrear en tiempo real la penetración de fármacos y la respuesta terapéutica en tumores mamarios de ratón mediante microscopía confocal de disco giratorio. Este método permite visualizar cambios en la muerte celular y las interacciones del estroma tumoral con resolución de célula única.

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Damos las gracias a J. J. Qiu cappellani y de asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por fondos del Instituto Nacional del Cáncer (U01 CA141451), el Consorcio de Cáncer Starr, Susan G. Komen for the Cure, Long Island 2 Caminata Día de Lucha contra el Cáncer de Mama, Manhasset Coalición de Mujeres contra el Cáncer de Mama para mí, y una pre-doctoral de becas del Programa de Investigación del Cáncer de mama Dirigida el Congreso, a ESNESN EE.UU. es también el destinatario de la rápida Leslie C. y William Randolph Hearst Becas de la Fundación de la Escuela Watson de Ciencias Biológicas. HAA fue apoyado por fondos del Consejo de Investigación de Noruega (160698/V40 y 151.882) y del Sureste Autoridades Regionales de Salud (2007060).

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Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con protocolos aprobados IACUC.

Las respuestas de los tumores a terapias sistémicas in vivo puede ser drásticamente diferente a las de las células cancerosas in vitro, como el microambiente influye tanto en la respuesta aguda y la recaída 5. Uno de los mayores obstáculos para la explicación de quimio-resistencia en las vías in vivo es la complejidad de las interacciones entre las células cancerosas y su microentorno. En particular, porque los tumores sólidos han desarrollado un equilibrio entre el cáncer y las células estromales, las perturbaciones de un componente, tales como la muerte celular que se produce durante el tratamiento contra el cáncer, puede resultar en efectos dramáticos en la organización del tejido. La técnica de imagen intravital proporcionado aquí permite la visualización directa de cáncer de estroma de células interacciones dentro de los tumores de los ratones vivos, anestesiados durante el tratamiento con fármacos contra el cáncer. Utilizamos microscopía confocal disco giratorio, que tiene una profundidad de penetración relativa limitada (ver 17 </sup&gt;), pero nuestras técnicas quirúrgicas y el etiquetado puede ser utilizado con otros tipos de microscopía. Películas adquiridos a partir de estos experimentos se puede utilizar para el seguimiento de procesos que incluyen cambios en la intensidad de fluorescencia (por ejemplo, debido a la infiltración de una población marcada o la inducción de la muerte celular), la motilidad celular, la distribución de inyectables (por ejemplo, para el seguimiento de la pérdida vascular), y co- localización de las señales fluorescentes 5,12,17,20. En forma rutinaria ratones de imagen para más de 6 horas y las imágenes también se realizó hace más de 18 horas. Esto requiere el mantenimiento de los ratones continuamente bajo anestesia para estos períodos de tiempo largos. Con la anestesia adecuada, más del 90% de los animales a sobrevivir 6 horas, y aproximadamente el 80% sobrevive más de 18 horas. Los detalles sobre cómo llevar a cabo a largo plazo anestesia se han publicado previamente 19. En nuestra experiencia, los cinco factores son fundamentales: evitar la hipotermia, evitando la deshidratación, el mantenimiento de los niveles fisiológicos de saturación de oxígeno en sangre, ucantar gas portador humidificado para el isoflurano, y de mantenimiento de los animales en el nivel más bajo de la anestesia en los que no muestran signos de dolor. Para mantener la temperatura corporal, es mantener a los ratones bajo una manta calentada (a 38 ° C). Para evitar la deshidratación, se inyectan pequeños volúmenes de solución salina intraperitoneal a lo largo de todo el procedimiento de imagen. Para mantener los niveles fisiológicos de saturación de oxígeno en sangre, se comienza con 21% de oxígeno en el gas portador (en lugar de los de uso común 100%). Esto nos permite aumentar los niveles de oxígeno inhalado si un ratón - horas en un experimento - muestra una disminución en la saturación de oxígeno en sangre. En nuestra experiencia, el aumento de los niveles de oxígeno inhalado en ese momento (por ejemplo, 30-40%) casi siempre se estabilizará el animal lo que permite horas de imágenes adicionales. El nivel óptimo de anestesia es para la mayoría de los ratones obtenidos con isoflurano 1-1.5% y los resultados de las tasas de respiración de 60-65/min y frecuencias de pulso de 400-450/min. En nuestros experimentos de imagen, usamos principalmente modelo de ratón transgénicos (MMTV-PYMT y C3 [1]-Tag) en el que los tumores son multifocales, permitiendo la obtención de imágenes de lesiones múltiples en diferentes etapas de la progresión tumoral en paralelo en múltiples x, posiciones en Y durante una sola sesión de imagen. Esto disminuye preocupaciones con respecto ratón-a-ratón de variación con respecto a los experimentos dirigidos a la identificación de fase dependientes de respuestas terapéuticas, y reduce el número de animales necesarios para la formación de imágenes. El modelo MMTV-PYMT (y otros modelos de cáncer espontáneo) pasan por etapas progresivas histopatológicos que pueden ser reconocidos durante la exploración intravital, a pesar de la puesta en escena patológica de las lesiones tumorales que se pueden realizar durante la exploración intravital es diferente y menos detallada que la de secciones histológicas 5,17. En contraste, los modelos de trasplante tienden a reflejar los tumores de etapa tardía mejor, como las células cancerosas generalmente están aislados de tumores avanzados. Tales modelos son por lo tanto más susceptibles a estudiar tumor-estromainteracciones de los tumores en estadios tardíos que diferencias en las interacciones entre las diferentes fases. Nos muestran ejemplos de cómo reproducir nucleares cambios estructurales que ocurren después de la muerte celular inducida por la terapia. En ausencia de tratamiento contra el cáncer, esta estrategia de etiquetado en lugar se puede utilizar para la división de la imagen celular in situ, elucidar, por ejemplo, cómo la proliferación celular y la latencia está influenciado por el microentorno. En el futuro, el marcaje fluorescente de los componentes mitocondriales pueden hacer posible cambios de imagen mitocondriales que se producen durante la muerte celular apoptótica. En este protocolo, también hemos demostrado ejemplos de cómo las interacciones de imágenes de células de cáncer de células inmunes después de la terapia, pero otros componentes microambientales también se pueden visualizar y formado la imagen. Existentes líneas transgénicas reportero para los componentes del estroma se encuentran las de los fibroblastos (por ej., FSP1-EGFP 17 de αSMA-RFP 21, COL1A1-EGFP 21) o las células de la vasculatura (por ejemplo, Tie2-GFP 22; VEGF-GFP 23). Intravital de imágenes permite la visualización en tiempo real de las interacciones y los procesos que se producen en la administración in vivo después de la quimioterapia. Con la tecnología disponible en la actualidad, se han logrado importantes avances en la comprensión de cómo las células mieloides influyen en la respuesta terapéutica, sin embargo, debido a que el microambiente tumoral es tan complejo, los avances más importantes siguen siendo necesarios para empezar a profundizar de manera mecánica en los procesos que subyacen entorno mediado resistencia a los medicamentos. Uno de los avances más importantes que aún se requieren es la identificación de mejores marcadores de poblaciones celulares específicas. La importancia de los mejores marcadores está bien ilustrado con dos de los componentes celulares más prominentes del estroma del microambiente del tumor de mama, fibroblastos y células inmunes. α-actina de músculo liso (αSMA) se utiliza frecuentemente para identificarfibroblastos, pero la proteína se expresa también por células musculares lisas vasculares y células mioepiteliales 24. Así, aunque αSMA-GFP reportero ratones existen, para determinar el tipo específico de célula es lo siguiente durante un experimento de imagen intravital es un reto. Del mismo modo, un único marcador fluorescente tal como EGFP expresa bajo el promotor c-fms menudo identificar subpoblaciones múltiples de células inmunes 12,17. Así, aunque, idealmente, le gustaría utilizar un solo marcador para identificar un tipo celular específico de la complejidad de la biología subyacente plantea un desafío importante en el uso de este enfoque. Una solución parcial a este problema es usar etiquetas inyectables para diferenciar las subpoblaciones de células que expresan el reportero fluorescente mismo. Por ejemplo, dextranos fluorescentes son captados por los macrófagos y se puede utilizar para etiquetar las subpoblaciones de macrófagos que están marcados por el c-fms-EGFP y FSP1-EGFP reportero ratones transgénicos <sup&gt; 17. Los anticuerpos conjugados con sondas fluorescentes también se han utilizado para identificar subpoblaciones específicas (por ejemplo, la población Gr1-positivo de las células mieloides marcadas por el reportero c-fms-EGFP 17). A diferencia de las curvas de respuesta de tumor generados por el calibrador de medición, que proporcionan poca información mecanicista sobre cómo o por qué los tumores responden a la terapéutica administrada, o una serie histológico derivadas de tejidos cosechados en diferentes puntos temporales que requieren grandes cohortes de animales, nuestra técnica proporciona información directa, cuantificable en la dinámica de la muerte de la célula y en las interacciones de células estromales con células cancerosas en cohortes pequeñas. Por lo tanto, la ventaja de utilizar la técnica aquí es que proporciona información dinámica sobre las respuestas de drogas en el contexto de un microambiente tumoral intacta en tiempo real. Dicha información puede conducir a importantes conocimientos sobre los procesos subyacentes que impulsan las respuestas terapéuticas 5 &lt;/ Sup&gt;.

Los tumores sólidos están compuestos de dos compartimentos principales: las células cancerosas y los componentes del estroma (tanto celulares y no celulares-) que ayudan en el mantenimiento de un ambiente adecuado para el crecimiento del tumor 1. Estos componentes del estroma desempeñan papeles críticos en el desarrollo, progresión y metástasis de muchos tipos de cánceres, incluyendo los de la mama 2-5. El medio estromal también influye en las respuestas terapéuticas 2,4,5. Por lo tanto, la determinación de cómo las células cancerosas responden a las terapias convencionales y nuevas en el contexto de la microambiente intacta es importante para avanzar en nuestro entendimiento de la biología del cáncer y la mejora de estrategias terapéuticas actuales. Por otra parte, la definición de cómo el cáncer de células del estroma interacciones cambiar después de la administración de la terapia es fundamental para la comprensión de la biología de la recidiva tumoral. Organotípicos co-cultivo de los sistemas han sido útiles para el estudio de las interacciones tumor-estroma <shasta&gt; 6, pero es evidente que los métodos actualmente disponibles no con éxito puede recapitular el microambiente del tumor intacto in vitro, en particular con respecto a la función vascular y reclutamiento de células inmunes. De hecho, las respuestas celulares de cáncer a las terapias que se observan in vitro a menudo son significativamente diferentes de los observados in vivo, donde el microambiente está intacta 5. Así, en modelos in vivo para el estudio de tumores del estroma interacciones y su impacto en la respuesta terapéutica puede reflejar mejor los mecanismos de relevancia clínica 7. Los medios principales de estudio de las respuestas a la terapia contra el cáncer in vivo han sido a través de mediciones del tamaño del tumor y la evaluación histológica de tejidos derivados de animales tratados o pacientes. Sin embargo, los avances en microscopía fluorescente y periodistas en las últimas dos décadas han permitido la visualización de los procesos inter e intracelularAlta resolución de animales vivos, anestesiados (intravital de imágenes) 8. Estas tecnologías de microscopía intravital han demostrado ser especialmente valioso para espacial y temporalmente en la disección de la dinámica in vivo de tumor-estroma interacciones en resolución celular y subcelular 8,9. Los procesos que se han descifrado por formación de imágenes intravital incluyen anti-tumor citotoxicidad de las células T 10,11, interacciones entre las células T y las células mieloides 12, la dinámica de los cambios en la composición y la organización de colágeno después del tratamiento terapéutico 13, macrófagos dependiente de la intravasación de células cancerosas y metástasis 14, y la permeabilidad vascular 15. Existen tres requerimientos principales para la formación de imágenes intravital. Estos incluyen la adecuada preparación y exposición de los tejidos de formación de imágenes, el marcaje fluorescente de los componentes del tejido de interés, y una s-cámara emparejado microscopíaistema capaz de adquirir imágenes 16. Las estrategias más comunes que se utilizan para hacer frente a estos requisitos incluyen: 1) los preparativos heterotópicas (por ejemplo, la inoculación de la oreja o el ojo orbital), permanente de imágenes de Windows, o preparaciones exteriorizadas (por ejemplo, la aleta dorsal piel), 2) los transgénicos fluorescentes y reporteros.. inyectables fluorescentes para etiquetar los componentes del tejido, y 3) los sistemas de microscopía confocal o multifotón emparejado con tubos fotomultiplicadores o dispositivo de acoplamiento de carga (CCD) cámaras, respectivamente 9. Se utilizó un modelo de colgajo de piel quirúrgicamente preparado para exponer la glándula mamaria inguinal para imágenes en los animales anestesiados que expresan transgenes que codifican los reporteros fluorescentes. Las imágenes se obtuvieron durante un período de 12 a 40 horas, usando un CCD intensificada (ICCD) de la cámara se combina con un sistema láser de cuatro hilado disco microscopio confocal 17. Imágenes de esta manera nos ha permitido estudiar procesos como la distribución de drogas en vivo, dependiente de la etapa chrespuestas emotherapeutic, tipo de muerte celular inducida por la quimioterapia, y el comportamiento celular mieloide 5. Proporcionamos un protocolo para la formación de imágenes intravital de respuestas celulares de cáncer a la terapia anti-cáncer y tumor-estroma interacciones en modelos de ratón de cáncer de mama. Este protocolo se puede utilizar para realizar un seguimiento de los comportamientos y la muerte de las células cancerosas y las componentes del estroma con una amplia variedad de marcadores fluorescentes transgénicos e inyectables, tanto en modelos transgénicos y trasplante durante periodos de hasta 40 horas en una sola sesión de imágenes.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reactivo </td></tr><tr><td> MMTV-PYMT ratones </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 2374 </td><td></td></tr><tr><td> C3 (1)-Tag ratones </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 13591 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-ECFP ratones </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 3773 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-H2B-EGFP ratones </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 5418 </td><td></td></tr><tr><td> 1 x PBS </td><td> Hecho en casa </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 MD dextrano, conjugados con fluoresceína </td><td> Invitrogen </td><td> D-7137 </td><td> Reconstituir en dH 2 O (4 mg / ml, almacenar a -20 ° C); diluido a 1 mg / ml en 1 x PBS </td></tr><tr><td> 10 kD dextrano, Alexa Fluor 647-conjugado </td><td&gt; Invitrogen </td><td> D-22914 </td><td> Reconstituir en dH 2 O (4 mg / ml, almacenar a -20 ° C); diluido a 1 mg / ml en 1 x PBS </td></tr><tr><td> Clorhidrato de doxorubicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 44583 </td><td> Reconstituir en dH 2 O y se almacena a 4 º C, se diluye en 1 x PBS </td></tr><tr><td> Isothesia (isoflurano) </td><td> Mayordomo Animal Health Supply </td><td> 029450 </td><td> 250 ml </td></tr><tr><td> De yoduro de propidio </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td><td> 1 mg / ml; diluido 1:15 en 1 x PBS </td></tr><tr><td> Nitrógeno </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oxígeno </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipo </td></tr><tr><td> 18G x 1 ½ &quot;aguja de bisel normal </td><td> BD </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> μManager </td><td> Vale Lab, UCSF </td><td> <a href="www.micro-manager.org" target="_blank">www.micro-manager.org</a> </td><td> Software de código abierto </td></tr><tr><td> Alcohol hisopo </td><td> BD </td><td> 326895 </td><td> Isopropílico al 70% torundas con alcohol </td></tr><tr><td> Anestesia sistema </td><td> Productos Molecular Imaging Co., </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cubierta de vidrio </td><td> Corning </td><td> 2940-245 </td><td> No. 1 ½, 24x50 mm; desinfectar con toallitas isopropanol al 70% </td></tr><tr><td> Esponjas de gasa Curity (estériles) </td><td> Kendall </td><td> 6939 </td><td></td></tr><tr><td> Portaobjetos de vidrio </td><td> Corning </td><td> 2948-75x25 </td><td> Limpieza previa, y si no previamente limpiada, desinfectar con toallitas isopropanol al 70% </td></tr><tr><td> Templados tijeras finas </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 14090-11 </td><td> 2 pares, el acero inoxidable, afilado afilados como puntas, punta recta, de 26 años de vanguardia mm, 11 cm de longitud </td></tr><tr><td> Manta climatizada </td><td> Industrias Gaymar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hot talón esterilizador </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 18000-45 </td><td> Girar en aproximadamente 30 min antes de su uso; esterilizar los instrumentos a&gt; 200 ° C durante 30 sec </td></tr><tr><td> Imaris </td><td> Bitplane </td><td> <a href="www.bitplane.com" target="_blank">www.bitplane.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Krazy Glue </td><td> Productos de Elmer </td><td> KG484 </td><td></td></tr><tr><td> Cinta Laboratory (½ &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laboratorio de cinta (1 &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tapa paraun enfriador de poliestireno envío </td><td></td><td></td><td> Esto será utilizado como la plataforma quirúrgica </td></tr><tr><td> Micro pinzas de disección </td><td> Roboz </td><td> RS-5153 </td><td> 1x2 dientes, curva leve, 0,8 mm de ancho, punta de 4 &quot;de longitud </td></tr><tr><td> Micro pinzas de disección </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td><td> Dentado, ligera curva, 0,8 mm anchura de la punta, 4 &quot;de longitud </td></tr><tr><td> Microscopio </td><td></td><td></td><td> Spinning disco confocal, XYZ etapa Piezo, capablility epifluourescence 17,25 </td></tr><tr><td> Microscopio inserción etapa </td><td> Instrumentación Científica Aplicada </td><td></td><td> Fabricado a medida, con dos puertos de imágenes circulares </td></tr><tr><td> MouseOx oxímetro, software, y sensores </td><td> STARR Ciencias de la Vida </td><td> <a href="www.starrlifesciences.com" target="_blank">www.starrlifescience</a>s.com </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene de Super Versi-Dry laboratorio soakers </td><td> Thermo Scientific </td><td> 74218-00 </td><td> Cortar en cuartos para el revestimiento de plataforma quirúrgica </td></tr><tr><td> Nebulizador </td><td> Salter Labs </td><td> 8901 </td><td> Se utiliza para humidificar gases, previene la irritación de los tejidos pulmonares </td></tr><tr><td> Slip-punta desechable jeringa de tuberculina (1 ml) </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> SurFlo alado equipo de infusión </td><td> Terumo </td><td> SV-23BLK </td><td> 23G x ¾ &quot;aguja ultra delgado de 12&quot; tubos </td></tr><tr><td> Betadine spray </td><td> Purdue Pharma </td><td> BASP3H </td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes en directo de las respuestas de drogas en el microambiente tumoral en modelos de ratón de cáncer de mama

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

El microambiente tumoral juega un papel fundamental en la iniciación del tumor, progresión, metástasis, y la respuesta a terapias contra el cáncer. Tridimensionales de co-cultivo sistemas se utilizan con frecuencia para explicar las interacciones tumor-estroma, incluyendo su papel en las respuestas de drogas. Sin embargo, muchas de las interacciones que se producen in vivo en el microambiente intacto no puede ser completamente replicado en estos ajustes en in vitro. Por lo tanto, la visualización directa de estos procesos en tiempo real se ha convertido en una herramienta importante en la comprensión de las respuestas a las terapias tumorales y la identificación de las interacciones entre las células cancerosas y el estroma que puede influir en estas respuestas. Aquí se proporciona un método para el uso de la microscopía confocal de disco giratorio de ratones vivos, anestesiados para observar directamente de distribución de fármacos, las respuestas de células cancerosas y los cambios en las interacciones tumor-estroma después de la administración de la terapia sistémica en modelos de cáncer de mama. Se describen procedimientos para labeling componentes diferentes de tumores, el tratamiento de los animales para la observación de las respuestas terapéuticas y el procedimiento quirúrgico para exponer los tejidos tumorales para imágenes de hasta 40 horas. Los resultados obtenidos de este protocolo son películas a intervalos, en los que los procesos tales como infiltración de droga, la muerte celular del cáncer y la migración de células del estroma pueden ser evaluados utilizando software de análisis de imagen.

Se describe un método para la formación de imágenes respuesta a tratamiento contra el cáncer<em&gt; In vivo</em&gt; Y en resolución única célula.

Imágenes en directo de las respuestas de drogas en el microambiente tumoral en modelos de ratón de cáncer de mama

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

El objetivo general de este procedimiento es rastrear en tiempo real la penetración del fármaco y la respuesta terapéutica a la administración de un fármaco terapéutico. Esto se logra tratando primero al animal con el medicamento. A continuación, se expone la glándula mamaria inguinal que contiene el tumor mediante la creación de un colgajo de piel.A continuación, el ratón se transfiere a la etapa microscópica y se mide la saturación de oxígeno en sangre y la frecuencia del pulso y se inserta una línea permanente para la administración de líquidos y fármacos o tintes. Finalmente, se adquieren imágenes time-lapse para su posterior análisis. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran cambios en la muerte celular o las interacciones del estroma tumoral en respuesta a un fármaco a través de la microscopía confocal de disco giratorio en vivo de tumores mamarios de ratón.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del microambiente tumoral, como la forma en que los diversos componentes del estroma de un tumor influyen en la respuesta al tratamiento. Antes de comenzar, consulte el protocolo escrito para conocer los horarios típicos de administración de medicamentos e imágenes. Encienda un esterilizador de perlas caliente y deje que alcance al menos 200 grados centígrados.Después de lavar las herramientas quirúrgicas con agua y jabón, incluyendo un par de pinzas con dientes, un par de pinzas dentadas y dos pares de tijeras, use el esterilizador de perlas calientes para esterilizarlas durante al menos 30 segundos. Entonces déjalos. Fresco. Coloque un empapador de laboratorio encima de la tapa de espuma de poliestireno que se utilizará como plataforma quirúrgica.Use cinta de laboratorio para fijar un cono de nariz con una línea al sistema de anestesia al empapador de laboratorio y cierta aguja de calibre 18 de una pulgada y media a través de la cinta en la tapa de espuma de poliestireno a cada lado del cono de la nariz para mantener el cono de la nariz asegurado en su lugar. Reserva la gasa estéril Betadine. Dos toallitas con isopropanol al 70%, un portaobjetos de microscopio, superpegamento y cuatro trozos de cinta de laboratorio de media pulgada de ancho.Después de anestesiar al animal en una cámara de inducción, cuando esté respirando profunda y lentamente, transfiera el ratón a la plataforma quirúrgica, con el lado ventral hacia arriba. Para evitar la presión alta, abra la línea de anestesia a la plataforma quirúrgica y luego cierre la línea de anestesia a la cámara de inducción. Reducir la concentración de isoflurano del 4% al 2,5%Compruebe que la profundidad de la anestesia es suficiente para la cirugía realizando un pinzamiento de la almohadilla del pie.Si el animal no reacciona, use cuatro pedazos de cinta de laboratorio para asegurar sus extremidades a la plataforma quirúrgica y use una maquinilla de afeitar eléctrica para quitar el pelo de la superficie ventral. Utilice toallitas de isopropanol al 70%, seguidas de Betadine aplicado a gasas estériles para desinfectar la superficie ventral del animal con tijeras y pinzas con dientes. Realizar una incisión subcutánea en la línea media ventral desde unos tres milímetros por encima de la uretra hasta la apófisis xifoides.Tenga cuidado de evitar perforar o cortar el peritoneo con las tijeras y las pinzas dentadas. Se separa suavemente la piel de la cavidad peritoneal con la glándula mamaria inguinal que contiene el tumor que se va a fotografiar. Coloque un portaobjetos de microscopio de vidrio contra el colgajo de piel de modo que la mayor parte del tumor quede plana una vez que el ratón se coloca en la plataforma, y para que no quede obstruido por las extremidades traseras.Una vez que el portaobjetos del microscopio se haya colocado correctamente, use superpegamento para unir el portaobjetos a la superficie externa de la piel. Retire la cinta de laboratorio que sujeta las extremidades del animal. Abra la línea de anestesia a la etapa del microscopio y luego cierre la línea de anestesia a la plataforma quirúrgica.Transfiera rápidamente al animal a la etapa del microscopio Una vez que el animal haya sido transferido, coloque y asegure la línea de anestesia y el cono de la nariz para asegurarse de que el ratón permanezca anestesiado y esté en una posición cómoda. Reducir la concentración de isoflurano al 1,5%Exponga el tumor de modo que se coloque en la parte superior y en el centro de uno de los puertos de imagen cubiertos de vidrio en la platina del microscopio. Inserte la vía intraperitoneal permanente con equipo de infusión alado conectado a la jeringa de un mililitro que contiene solución salina PBS estéril o solución salina con yoduro de propidio.Cuando se inserte la vía intraperitoneal, inyecte al animal 100 microlitros de solución salina con yoduro de propidio y continúe inyectando 50 microlitros de solución salina con yoduro de propidio cada hora hasta que se complete la sesión de imagen. Con las piezas oculares, verifique que el tumor esté correctamente colocado y que el portaobjetos del microscopio y la línea intraperitoneal estén suavemente pegados. El portaobjetos debe estar asegurado lo suficientemente suelto como para que el flujo sanguíneo al tejido no se obstruya.Pegar el portaobjetos del microscopio ayuda a minimizar los artefactos de imagen introducidos por la respiración del animal para adquirir imágenes de lapso de tiempo. Utilice el software de código abierto micromanager, compile y analice los datos brutos utilizando IRIS u otro software de análisis de imágenes. Las hebras DExT conjugadas con fluorescencia se pueden utilizar como marcador sustituto para la administración de fármacos en los tejidos.Aquí se muestra la llegada de dos megadalton dextrano IV conjugados fitzy inyectados en un ratón que expresa la proteína fluorescente azul en células de cáncer de mama. Tras la llegada del fármaco al tumor, se pueden obtener imágenes de la extravasación y la difusión para determinar la vida media intravascular y la distribución del fármaco. Aquí, se muestra la extravasación y distribución de 10 kilodalton dextran IV conjugado LOR inyectado en un ratón que expresa proteína fluorescente azul en células de cáncer de mama y proteína fluorescente verde en células mieloides.Las imágenes pueden proporcionar información sobre el tipo de muerte celular que sufren las células cancerosas. Aquí, se observan cambios nucleares estructurales indicativos de necrosis o apoptosis en un ratón que expresa una proteína fluorescente verde conjugada con su dos b. Después del tratamiento con doxorrubicina, la muerte de las células cancerosas inducida por la quimioterapia con frecuencia resulta en un reclutamiento reactivo de células inmunitarias en los tumores.Este es un ejemplo de esta respuesta estromal al tratamiento agudo con doxorrubicina en un ratón que expresa proteínas fluorescentes azules y verdes en células de cáncer de mama y mieloides, respectivamente. Además de visualizar la respuesta estromal general a la quimioterapia, aquí también se pueden visualizar las respuestas estromales especializadas. La fagocitosis del material celular necrótico por una célula vecina se muestra una vez dominada.Esta técnica se puede realizar en 30 a 60 minutos y los animales se pueden fotografiar durante 12 a 40 horas si se realiza correctamente.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Ortotópico modelos animales de cáncer de ovario reproducir mejor las enfermedades humanas y por lo tanto, mejorar nuestra comprensión de la progresión del cáncer y la respuesta del tumor a la terapia. Un modelo de ratón recibe una inyección intrabursal de luciferasa que expresan las células tumorales de ovario. El tratamiento se administra a través de una sonda nasogástrica. El crecimiento del tumor está controlado...

En vivo de imágenes y tratamientos terapéuticos en un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario

Un modelo experimental de ratón de las metástasis óseas se estableció después de la entrega intracardíaca de luciferasa que expresan las células del tumor mamario. El desarrollo de tumores y dio lugar a lesión osteolítica fueron controlados longitudinalmente con bioluminiscencia y micro TC.

Monitoreo metástasis tumorales y lesiones osteolíticas con bioluminiscencia y Micro Imágenes de TC

Imágenes de bioluminiscencia de inducible por hipoxia-1α factor de actividad se aplica al seguimiento del desarrollo de la hipoxia tumoral intracraneal en un modelo de ratón de cáncer de mama metástasis cerebrales.

Imágenes in vivo de tumores bioluminiscencia Dinámica hipoxia de la metástasis cerebral cáncer de mama en un modelo de ratón

Hemos desarrollado modelos 3D para el cocultivo de células vivas imágenes en tiempo real de las interacciones entre las células tumorales de mama y otras células en el microambiente que afectan la progresión a un fenotipo invasivo. Estos modelos pueden servir como pantallas preclínicos de los medicamentos que se dirigen a paracrinos inducidos por las vías proteolíticas, quimiocinas / citocinas y la quinasa implicados en la invasión.

MAME Modelos de 4D Live de células de imagen de un tumor: Interacciones microambiente que la progresión maligna del impacto

Fuente:Marina Arantes Radicchi1, Victor Carlos Mello1,Victória Paz Machado1, Márcia Cristina Oliveira da Rocha1, Jaqueline Vaz de Oliveira1, Luana Cristina Camargo1,2, Luís Alexandre Muehlmann1, Ricardo Bentes Azevedo1, Sônia Nair Bao1, João Paulo Figueiró Longo11Instituto de Ciencias Biológicas, Universidad de Brasilia, 2Departamento de Procesos Psicológicos Básicos, Instituto de Psicología, Universidad de BrasiliaEste video demuestra el procedimiento para rastrear la progresión tumoral in...

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Un modelo de tumor primario de cáncer de mama ortotópico y la extirpación quirúrgica del tumor primario para extender la vida del ratón para generar metástasis espontánea se describen. El crecimiento del tumor y la progresión se supervisan y se cuantificaron por imágenes de fluorescencia de la luciferasa.

Un modelo de ratón ortotópico de cáncer de mama metástasis espontánea

Este protocolo describe el uso de la microscopía multifotónica para realizar extendida time-lapse de las interacciones multicelulares en tiempo real, en vivo a una resolución de una sola célula.

Prolongado lapso de tiempo intravital de imágenes de tiempo real multicelular Dinámica en el microambiente tumoral

Este trabajo preestablece un protocolo avanzado para evaluar con precisión la carga del tumor mediante la detección de señales de proteína fluorescente verde y bioluminiscencia, así como la integración de la técnica de detección molecular cuantitativa.

Estudio del triple cáncer de mama negativo con el modelo de cáncer de mama ortotópico

Aquí, describimos un método de monitoreo no invasivo que involucra la expresión de luciferasa y proteína fluorescente verde en varias líneas celulares de cáncer de mama. Este protocolo proporciona una técnica para monitorizar la formación tumoral y la colonización metastásica en tiempo real en ratones.

Monitoreo del crecimiento del cáncer de mama y la formación de colonias metastásicas en ratones utilizando bioluminiscencia

El manuscrito describe una metodología para el establecimiento y seguimiento longitudinal del crecimiento de las metástasis pulmonares espontáneas de tumores de mama inyectados ortotópicamente, susceptibles de intervención en todas las etapas de la cascada metastásica.

In vivo Diagnóstico por imágenes para medir la metástasis pulmonar espontánea de células tumorales de mama inyectadas ortotópicamente

Aquí, describimos el protocolo para la administración in vivo de nanopartículas magnéticas de óxido de hierro portadoras de oligómeros de ARN al cáncer de mama metastásico en modelos animales, proporcionando un enfoque clínicamente viable para el silenciamiento terapéutico de ácidos nucleicos oncogénicos.

Monitorización de la acumulación de nanofármacos en metástasis de cáncer de mama murino

Aprende a rastrear en tiempo real la penetración de fármacos y la respuesta terapéutica en tumores mamarios de ratón mediante microscopía confocal de disco giratorio. Este método permite visualizar cambios en la muerte celular y las interacciones del estroma tumoral con resolución de célula única.

Imágenes en directo de las respuestas de drogas en el microambiente tumoral en modelos de ratón de cáncer de mama

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