Name: Ex Vivo Blood Red Cell Hemólisis Ensayo para la Evaluación de pH sensibles a agentes endosomolítico para la entrega citosólica de Drogas biomacromoleculares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Aprende a evaluar la citocompatibilidad y actividad endosomolítica de sistemas de liberación de fármacos mediante un ensayo de hemólisis ex vivo con glóbulos rojos como modelo de membrana endosomal.

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Los autores agradecen la financiación a través del Departamento de Defensa, el Congreso dirigió programas de Investigación Médica (# W81XWH-10-1-0445), los Institutos Nacionales de Salud (NIH R21 HL110056), y la American Heart Association (# 11SDG4890030).

1. Preparación y Esterilización de tampones y agentes de prueba <ol><li> 150 mM de tampón de NaCl: Disolver 4,383 g de cristales de NaCl en 500 ml de agua nanopura. </li><li> Tampones de pH: Preparar los tampones de fosfato a pH 5,6, 6,2, 6,8, y 7,4 mediante la mezcla de cantidades apropiadas de monobásico y fosfato sódico dibásico. Si las muestras se van a probar a valores de pH más bajos (es decir, pH &lt;5,6) y luego una amortiguación más apropiado, tal como tampón citrato, se debe utilizar. Recetas de búfer están disponibles, y un ejemplo de referencia ha sido proporcionada aquí 12. </li><li> Esterilice todos los tampones mencionados anteriormente a través de un aparato de vacío botella-top filtración y vuelva a comprobar el búfer de pH. </li><li> 20% de Triton X-100 (control positivo): Mezclar 20 ml puro Triton X-100 en 80 ml de agua nanopura. Agitar vigorosamente y sonicado para disolver. Dejar a temperatura ambiente durante la noche antes de su uso. </li></ol> 2. Preparación de eritrocitos <ol><li> Obtener 25 ml de sangre from un donante anónimo humano, dibujado directamente en K 2-EDTA Vacutainer tubos recubiertos para evitar la coagulación. </li></ol> NOTA: Todos los procedimientos deben ser previamente aprobados por la junta de revisión competente Institucional (IRB) y la punción venosa y la extracción de sangre debe ser realizada por un flebotomista capacitado con el fin de minimizar el riesgo para el donante. Los procedimientos estándar de flebotomía se han publicado en otros lugares 13. <ol start="2"><li> Centrifugar la sangre a 500 xg durante 5 min, y los niveles de marca de hematocrito (rojo, capa inferior) y plasma (capa amarillenta, superior) en el tubo. </li><li> Aspirar suavemente plasma a través de una pipeta, añadir a lejía, y descartar a los residuos biológicos peligrosos. </li><li> Llene el tubo hasta la línea marcada hematocrito (nivel original de plasma) con 150 mM de NaCl. Cierre e invierta varias veces para mezclar suavemente. Centrifugar a 500 xg durante 5 min. </li><li> Repita los pasos 2.3-2.4 para lavar los glóbulos nuevo. A continuación, aspirar supernathormiga y reemplazar con PBS a pH 7,4. Invertir para mezclar. </li><li> Dividir sangre uniformemente en cuatro tubos, correspondientes a cada pH que se pondrá a prueba. Etiquetar los tubos de acuerdo a cada pH a ensayar (5,6, 6,2, 6,8, 7,4). </li><li> Centrifugar los tubos de sangre a 500 xg durante 5 min. Marque los niveles en los tubos, y aspirar el sobrenadante. </li><li> Llenar cada tubo a la línea marcada con tampón de pH apropiado (como se indica en 2,6). </li><li> Etiqueta cuatro cónico de 50 ml tubos (uno por pH a prueba), y pipeta de 49 ml de PBS de pH apropiado en cada tubo cónico. </li><li> Añadir 1 ml de eritrocitos (pH misma) en el tubo correspondiente para una dilución 1:50. Inspeccione visualmente la sangre diluida, que debe estar turbio y se asentará si no se toca. Si no se forma de pellets, las células se lisaron. </li></ol> 3. Ensayo de lisis 96 Configuración Plate Bueno y Cuantificación <ol><li> Preparar soluciones madre de todos los agentes de suministro de drogas experimentales, a 20x la concentración final deseada a ensayar (Ensayotendrá 10 l de agente de administración de fármacos + 190 mu l células rojas de la sangre diluida, dando lugar a una dilución de 1/20 de la agente de administración de fármaco original en la mezcla de prueba). Las existencias de 20, 100, y 800 ug / ml, se sugieren, dando lugar a concentraciones de ensayo finales de 1, 5, y 40 mg / ml, respectivamente. </li><li> Pipetear 10 l de cada solución madre en fondo en V de 96 pocillos. Para obtener resultados óptimos, cargue cada muestra por triplicado o cuadruplicado. </li></ol> NOTA: Para mayor facilidad, se recomienda que una separada placa de 96 pocillos deben estar preparados para cada pH a ensayar, con cada muestra (a cada concentración) embarcado en n = 3-4 por placa. <ol start="3"><li> Para pocillos de control positivo, añadir 10 l de 20% de Triton X-100. </li><li> Para pocillos de control negativo, añadir 10 l de tampón fosfato. Utilizar una solución tampón al mismo pH para ser probado. </li><li> Pipetear 190 l de eritrocitos diluidas (ver 2,10) a cada pocillo, haciendo seguro solución stock de celda permanecehomogénea durante la transferencia. Sugerencia: Use una pipeta multicanal para simplificar esta tarea. </li><li> Incubar las placas a 37 ° C durante una hora (Opcional: Utilice un agitador orbital o basculante). </li><li> Centrifugar las placas durante 5 minutos a 500 xg para eritrocitos de pellets intactos. Nota: cuando la eliminación de la placa de la centrífuga y su transporte a la siguiente etapa, manipular con cuidado y estar seguro de no perturbar el sedimento celular. </li><li> Usando una pipeta multicanal, transferir 100 l de sobrenadante de cada pocillo en un claro, de fondo plano de 96 pocillos. Nota: si el sedimento celular se accidentalmente perturbado para cualquier muestra (s), se puede volver a centrifugar la placa y luego proceder con la transferencia de sobrenadante. </li><li> Medir la absorbancia de los sobrenadantes con un lector de placas. Tenga en cuenta que una gama de longitudes de onda se puede utilizar (400 - 541 nm). </li></ol> NOTA: Los distintos lectores de placa puede tener diferentes puntos de saturación y la sensibilidad, así que la elección de una longitud de onda para míhicieron mediciones depende de si o no los datos de hemólisis de las muestras experimentales puede ser fiable normalizado contra hemólisis máxima como la inducida por tratamiento con detergente. Esto requiere una medición precisa de los valores de absorbancia de las muestras de control positivas. <ol start="10"><li> Uso de Microsoft Excel o un software de análisis de datos similar, hallar el promedio de las lecturas de fondo de absorbancia de las muestras de control negativo establecidos para cada pH (paso 3,4). Restar este valor de la absorbancia de fondo de todas las otras muestras que fueron medidas a ese pH. </li><li> Después de la sustracción del fondo, encontrar la absorbancia media del control positivo tratados con detergente muestras (paso 3,3). Entonces normalizar todos los puntos de datos experimentales para este valor de absorbancia media, que debería representar el 100% de hemólisis. Por último, multiplica cada valor bien por 100% para calcular el% de hemólisis que se produjo en cada pocillo individual en relación con el control de detergente. </li></ol>

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</ol>

Aprobación de la IRB: Procedimientos en seres humanos han sido aprobados por la Junta Universidad de Vanderbilt Revisión Institucional (IRB, Protocolo # 111251). No hay conflictos de interés declarado.

sensibilidad al pH polímeros u otros agentes diseñados para la función endosomolítico puede ser rápida y eficaz detección basado en la lisis de las células rojas de la sangre a valores de pH encontradas en el endosoma (Figura 1; pH 6,8 - endosoma temprano, pH 6,2 - endosoma tardío, pH 5,6 - lisosoma). 14-17 dependiente del pH hemólisis se ha utilizado para cribar la capacidad de las compañías para mediar en la liberación endosomal de la terapéutica biomacromoleculares (por ejemplo, p...

Aunque hay muchos potenciales de alto impacto dianas terapéuticas dentro de la célula, la administración intracelular de agentes plantea un desafío significativo. Con frecuencia, los fármacos, especialmente biológicos, son internalizados por las células a la trata en vesículas que o bien conducir a la degradación de su contenido a través de la vía endo-lisosomal, o son transportados de nuevo fuera de la célula a través de exocitosis. 1 En el último proceso, el pH interno de las vesículas se acidifica a aproximadamente 5-6, que es el pH óptimo para la actividad de las enzimas que funcionan en este compartimiento, tal como lisozima. 2 Recientemente, una serie de materiales han sido diseñados específicamente para aprovechar la acidificación de los endosomas para facilitar la entrega citosólica de su carga. Un ejemplo de este enfoque utiliza polímeros sintéticos, nanopartículas micelares cuyo núcleo es de ion híbrido y neutro de carga a pH fisiológico (es decir, 7,4). Sin embargo, a pH 6,0- 6,5, los polímeros a ser protonados y adquirir una carga positiva neta que desestabiliza el núcleo de la micela, y los segmentos de polímero expuestos interactuar con y alteran la membrana endosomal. Esta actividad se ha demostrado para promover el escape endosomal de péptidos y ácidos nucleicos basados ​​en ácido terapéutica, lo que les permite acceder a sus objetivos citosólicas. 3,4 Otros ejemplos de métodos desarrollados para mediar de escape endosomal que interrumpir la barrera de la membrana incluyen &#39;fusogénicos&#39; o péptidos proteínas que pueden mediar la fusión de membranas o la formación de poros transitorios en la bicapa de fosfolípidos. 5 homopolímeros de ácidos acrílicos aniónicos de alquilo tales como poli (ácido propilacrílico) son otro enfoque bien estudiado, y en estos polímeros, el estado de protonación de ácido carboxílico colgantes dicta transición en un hidrófobo, la membrana disruptiva de estado en intervalos de pH endo-lisosomales 6,7. Un sistema de modelo útil para el cribado de comportamiento endosomolítico es el correox dependiente del pH in vivo ensayo de hemólisis. 8 En este sistema modelo, la membrana de los eritrocitos sirve como un sustituto para la membrana de bicapa lipídica que encierra endo-lisosomales vesículas. Este modelo generalizable ha sido utilizado por otros, para evaluar el comportamiento de endosomolítico penetran en las células péptidos y otros sistemas poliméricos de liberación de genes. 8-11 En este experimento, las células rojas de la sangre y los materiales de ensayo se incuban conjuntamente en tampones a pH definidos que imitan extracelulares (7,4), a principios endosomal (6,8), y tarde endo-lisosomal (&lt;6,8) entornos. La cantidad de hemoglobina liberada durante el período de incubación se cuantificó como una medida de la lisis de glóbulos rojos, que se normaliza a la cantidad de hemoglobina liberada en muestras de control positivas lisadas con un detergente. A partir de la detección de una pequeña biblioteca de materiales de ensayo potencialmente endosomolítico, se puede inferir que las muestras que no producen hemólisis a un pH de 7,4, pero dobladillo significativamente elevadosolysis a pH &lt;6,5, serán los candidatos más eficaces y citocompatible para administración de fármacos citosólica. Los materiales que se ajusten a estos criterios se espera que permanezca inerte y no indiscriminadamente destruir las membranas de bicapa lipídica (es decir, que podría causar citotoxicidad) hasta ser expuesto a una caída en el pH local después de la internalización en endo-lisosomales compartimentos. En este protocolo, los eritrocitos se aíslan de un donante humano y co-incubadas a pH 5,6, 6,2, 6,8, o 7,4 con agentes experimentales endosomolítico de suministro de fármacos. Los eritrocitos intactos se sedimentan, y los sobrenadantes (que contiene la hemoglobina liberada a partir de eritrocitos lisados) se analizan para la absorbancia característica de la hemoglobina a través de un lector de placas (Figura 1).

<table border="1"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> BD Vacutainer - K2EDTA tubos vacutainer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-253-145 </td><td> Para la recolección de sangre </td></tr><tr><td> BD Vacutainer recolección de sangre, agujas de calibre 20,5 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-665-31 </td><td> Para la recolección de sangre </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Tube soporte / adaptador de aguja </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-289-953 </td><td> Para la recolección de sangre </td></tr><tr><td> BD Marca Alcohol isopropílico Swabs </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-680-63 </td><td> Para la recolección de sangre </td></tr><tr><td> BD Vacutainer sin látex Tourniquet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-657-6 </td><td> Para la recolección de sangre </td&gt; </tr><tr><td> El ácido clorhídrico (conc.) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td> Para el ajuste del pH de D-PBS. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td> El control positivo </td></tr><tr><td> PBS de Dulbecco </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene estéril desechable MF75 Bottle-Top Unidad de filtro con membrana SFCA </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09 a 740-44A </td><td></td></tr><tr><td> BD placas de 96 pocillos, de fondo plano, de cultivo de tejidos tratados con poliestireno </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08 a 772-2C </td><td> Para la placa de lectura al final del ensayo. </td></tr><tr><td> BD placas de 96 pocillos, de fondo redondo, de cultivo de tejidos tratados con poliestireno </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-17 </td><td> Para la incubación de las células rojas de la sangre con agentes experimentales. </td></tr></table&gt;

ex vivo blood red cell hemólisis ensayo para la evaluación de ph sensibles a agentes endosomolítico para la entrega citosólica de drogas biomacromoleculares

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

Bicapas de fosfolípidos que constituyen endo-lisosomal vesículas pueden suponer un obstáculo para la entrega de medicamentos biológicos a los objetivos intracelulares. Para superar esta barrera, una serie de portadores de fármacos sintéticos han sido diseñados para interrumpir activamente la membrana endosomal y entregar la carga en el citoplasma. Aquí se describe el ensayo de hemólisis, que se puede utilizar como rápido y de alto rendimiento para la pantalla cytocompatibility y actividad endosomolítico intracelulares de sistemas de suministro de fármacos. En el ensayo de hemólisis, las células rojas de la sangre y los materiales de ensayo se incuban conjuntamente en tampones a pH definidos que imitan extracelulares, endosomal temprano y tardío endo-lisosomales entornos. Tras una etapa de centrifugación para sedimentar glóbulos rojos intactos, la cantidad de hemoglobina liberada en el medio se midió espectrofotométricamente (405 nm para el mejor rango dinámico). El porcentaje de glóbulos rojos interrupción se cuantifica en relación con el control positivo samples lisadas con un detergente. En este sistema de modelo de la membrana de los eritrocitos sirve como un sustituto para la membrana de bicapa lipídica que encierra endo-lisosomales vesículas. El resultado deseado es la hemólisis despreciable a pH fisiológico (7,4) y la hemólisis robusta en el intervalo de pH endo-lisosomal de aproximadamente pH 5-6.8.

<html> Típicamente, los agentes que exhiben ideales dependiente del pH comportamiento hemolítica tienen el mayor potencial para la entrega citosólica de fármacos, ácidos nucleicos, u otras moléculas bioactivas. Esto se ejemplifica por el Agente # 1 como se representa en la figura 2, que muestra la hemólisis mínima a un pH de 7,4, pero un fuerte aumento en el comportamiento hemolítica a intervalos de pH endosomal (&lt;6,5). Algunos agentes pueden mostrar niveles significativos de comportamiento hemolítica...

Un ensayo de hemólisis se puede utilizar como una rápida, de alto rendimiento pantalla de cytocompatibility sistemas de administración de fármacos y la actividad endosomolítico para entrega de carga intracelular. El ensayo mide la disrupción de membranas de eritrocitos como una función del pH del medio ambiente.

Ex Vivo Blood Red Cell Hemólisis Ensayo para la Evaluación de pH sensibles a agentes endosomolítico para la entrega citosólica de Drogas biomacromoleculares

Phospholipid bilayers that constitute endo-lysosomal vesicles can pose a barrier to delivery of biologic drugs to intracellular targets. To overcome this ...

El objetivo general de este experimento es evaluar cuantitativamente el potencial de ruptura de membranas de vectores de administración de fármacos para la entrega intracelular de productos biológicos, utilizando glóbulos rojos como modelo biológico de la membrana endosomal. Este video fue producido por el Laboratorio de Terapéutica Avanzada de la Universidad de Vanderbilt. Todos los procedimientos que involucran sujetos humanos han sido aprobados por la Junta de Revisión Institucional de Vanderbilt.Primero, una breve introducción a endosomas, hemólisis y hemolisis. Los portadores de productos biológicos son incorporados por la célula en endosomas mediante endocitosis no específica o mediada por receptores. Tras la endocitosis.La carga se degrada en los lisosomas o se transporta para su exocitosis de regreso al espacio extracelular. Como se muestra, sin embargo, la disminución del pH en un endosoma puede aprovecharse mediante vehículos de fármacos sensibles al pH, que en respuesta al entorno ácido se vuelven disruptores de la membrana, generando poros físicamente o bien desestabilizando la membrana endosomal; una vez que la membrana del endosoma se ve alterada, la carga del fármaco puede liberarse al citoplasma y difundirse hacia las localizaciones diana en el citoplasma, las mitocondrias o el núcleo. En este ensayo, los glóbulos rojos se utilizan como modelo de la membrana endosomal a pH fisiológico.Los vehículos de administración ideales permanecerán estables y no alterarán la membrana del glóbulo rojo. Sin embargo, al disminuir el pH, el vehículo de administración se volverá inestable, lo que dará lugar a interacciones hidrofóbicas que destruyan la membrana del glóbulo rojo, liberando hemoglobina. La hemoglobina puede entonces aislarse de los glóbulos rojos y cuantificarse espectrofotométricamente mediante la absorbancia a 405, 450 o 541 nanómetros.Valores más altos de absorbancia se correlacionarán con un comportamiento endolítico más potente. Esto puede visualizarse mediante microscopía de lapso de tiempo a pH fisiológico. Los glóbulos rojos permanecen estables en presencia del vehículo del fármaco.Sin embargo, a un pH más bajo característico de la vía endosomal, los vehículos de entrega interrumpen y destruyen rápidamente las membranas de los glóbulos rojos. Los materiales necesarios para este estudio incluyen cloruro de sodio 150 milimolar, preparado con 500 mililitros de agua desionizada y 4,383 gramos de cloruro de sodio estéril, filtrado mediante un aparato de filtración al vacío con embudo de botella. Segundo, soluciones de salina tamponada con fosfato a pH 7,4, 6,8, 6,2 y 5,6 se prepararon mezclando las cantidades adecuadas de tampones de fosfato monosódico y disódico y se filtraron estérilmente utilizando un aparato de filtración al vacío con embudo de botella.El pH se monitoreó con un pH-metro y/o tiras de pH, utilizando varios métodos para asegurar la precisión de las mediciones. Se preparó Triton X al 20 % disolviendo 20 mililitros de Triton X-102 en 80 mililitros de agua nano pura, agitando vigorosamente y sonicando para disolver, tras la aprobación del comité de revisión institucional. Pida a su enfermera de estudio o flebotomista que recoja 25 mililitros de sangre completa de un donante anónimo en tubos al vacío recubiertos con EDTA potásico para prevenir la coagulación.En este video, se utiliza una aguja de recolección de calibre 20,5 conectada a un adaptador para tubo al vacío. La sangre recolectada se centrifuga a 500 veces la gravedad durante cinco minutos. Tras la centrifugación, deben observarse claramente la capa de plasma y la capa de glóbulos rojos.Tenga cuidado de no alterar las capas agitando. Marque los niveles del plasma y luego aspire suavemente con una pipeta micrométrica o un aspirador al vacío y deseche en lejía. Reemplace el plasma con cloruro de sodio 150 milimolar hasta la línea marcada.Cierre el vial y inviértalo varias veces para mezclar suavemente. Centrifugue por segunda vez a 500 G durante cinco minutos, seguido de la aspiración del sobrenadante. Reemplace el sobrenadante hasta la línea marcada con cloruro de sodio 150 milimolar e invierta varias veces para mezclar suavemente. Centrifugue por tercera vez a 500 G durante cinco minutos. Aspire el sobrenadante y reemplace hasta la línea marcada con PBS de pH 7,4.Divida la muestra de sangre equitativamente en cuatro tubos. Uno para cada pH que se va a probar, incluyendo el pH fisiológico de 7,4, el pH endosomal temprano de 6,8, el pH endosomal tardío de 6,2 y el pH de endosoma tardío o lisosomal de 5,8. Repita la centrifugación por cuarta y última vez a 500 G durante cinco minutos.Marque los niveles de super natan y aspire suavemente, descartando el super natan en lejía. Reemplace el super natan con PBS de pH apropiado. Los cultivos finales de glóbulos rojos se preparan diluyendo las soluciones stock 50 veces en tampón de pH adecuado.En este caso, se agregó un mililitro de glóbulos rojos concentrados a 49 mililitros de PBS, invirtiendo suavemente el vial varias veces para mezclar los glóbulos rojos antes de la preparación de la sangre. Prepare soluciones stock de los vehículos de administración a una concentración 20 veces mayor. Para los polímeros, sugerimos 2100 y 800 microgramos por mililitro como concentraciones iniciales de prueba; una vez diluidas, la concentración final será de 105 y 40 microgramos por mililitro para la incubación. Utilice placas cónicas o de fondo redondo para que los glóbulos rojos intactos puedan eliminarse mediante centrifugación. Pipetee 10 microlitros de la solución de polímero 20 veces concentrada en cada pocillo.Se recomienda analizar las muestras al menos en triplicado o cuadruplicado para optimizar los resultados. Triton X lisará todas las células y puede utilizarse como control positivo a una concentración final del 1 %. PBS a pH 7,4 puede usarse como control negativo. Pipetee 190 microlitros de glóbulos rojos diluidos en cada pocillo. Asegúrese de que la solución de glóbulos rojos se mantenga homogénea, lo cual puede requerir una leve agitación o mezcla para mantenerlos en suspensión.Tenga en cuenta que una vez agregadas las células rojas, es posible que ya observe el inicio de la lisis para compuestos extremadamente hemolíticos. Incube durante una hora a 37 grados Celsius para permitir que ocurra la lisis después de una hora. Retire las placas para la centrifugación; centrifugue las placas a 500 G para sedimentar los glóbulos rojos.Luego, transfiera cuidadosamente 100 microlitros del sobrenadante a una placa plana de 96 pocillos. Es fundamental no perturbar el sedimento de glóbulos rojos, por lo que asegúrese de manipular con cuidado. Mida la absorbancia de cada pocillo con un lector de placas a 450 nanómetros.Si la hemoglobina está demasiado concentrada y se obtienen lecturas de ABSORBANCIA altas, las placas también pueden leerse a 541 nanómetros. Alternativamente, si la hemoglobina está demasiado diluida y se obtienen lecturas de absorbancia bajas, las placas pueden leerse a 405 nanómetros para maximizar la absorbancia. Para analizar los datos, el porcentaje de hemólisis puede calcularse suponiendo que el PBS no lisará ningún glóbulo rojo y que el Triton X lisará el 100 % de los glóbulos rojos.La ecuación mostrada dará como resultado el porcentaje de homólisis para cada muestra. Se puede utilizar software como Microsoft Excel para analizar rápidamente experimentos provenientes de cientos de pocillos. A continuación se presentan resultados representativos a varias concentraciones a lo largo de los rangos de pH discutidos.Esta formulación muestra una respuesta de pH ideal y que no presenta actividad hemolítica a pH fisiológico, pero muestra un comportamiento de conmutación a pH endosomal que resulta en una alteración significativa de la membrana, como se indica con la flecha roja. Acaba de ver el video de nuestro laboratorio que describe el ensayo de hemólisis de glóbulos rojos dependiente del pH. Este es un ensayo relativamente económico, fácil de usar y de alto rendimiento que puede emplearse para tamizar bibliotecas combinatorias de series de polímeros diseñados para la liberación biológica de fármacos.Descubrimos que este ensayo es altamente predictivo de la entrega citosólica y la bioactividad de una amplia gama de productos biológicos, incluyendo proteínas, péptidos y ácidos nucleicos. Sin embargo, debe mencionarse que existen algunas debilidades potenciales de este ensayo. Se considera una buena herramienta predictiva para polímeros o péptidos que realmente alteran físicamente la membrana endosomal.Sin embargo, no es una buena herramienta predictiva para usar con polímeros u otros sistemas que actúan mediante un mecanismo basado en la esponja protónica. Además, se debe tener en cuenta que la composición de la bicapa lipídica de los glóbulos rojos no imita exactamente la de las membranas endosomales o lisosomales. En cuanto a la composición lipídica y el contenido de colesterol, siempre se debe estar preparado para realizar un seguimiento.Cualquier resultado de hemólisis de glóbulos rojos con técnicas y ensayos complementarios. Por ejemplo, la microscopía fluorescente utilizada en conjunto con colorantes endosomales o lisosomales puede emplearse en estudios de colocalización para visualizar el escape de medicamentos biológicos desde las vías endolisosomales. Además, la medición de la bioactividad o de los efectos posteriores del fármaco o biológico administrado debe ser siempre el paso final.Finalmente, recuerde manipular y desechar siempre los desechos biopeligrosos adecuadamente, según lo definido por su institución. Esto concluye nuestro video. Mucha suerte en sus experimentos.

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Inmunología e Infección

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