Name: Usando cuantitativa en tiempo real PCR para determinar quimerismo de células donantes en un modelo competitivo Trasplante de médula ósea murina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Aprende a cuantificar el quimerismo de células donantes mediante PCR en tiempo real en un modelo competitivo de trasplante de médula ósea murina. Este método sensible y económico permite evaluar la engraftación en diferentes cepas de ratones.

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Agradecemos al Dr. Charles Greenberg para el uso de su máquina de PCR en tiempo real. Este trabajo es apoyado por MUSC Hollings Cancer Center de inicio del Fondo, Hollings Cancer Center ACS IRG, ASCO Conquer Cancer Carrera Premio de la Fundación para el Desarrollo, NIH 1K08HL 103780-01A1, y NIH 3P30CA138313-01S3. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud u otros agentes de financiación.

1. Bone Marrow celda de aislamiento <ol><li> Eutanasiar donantes masculinos FVB / NJ ratones y hembra FVB / NJ ratones utilizando CO 2 método seguido por dislocación cervical. La hembra FVB / NJ células de médula ósea se utiliza como células competitivas. </li><li> Utilice pequeñas tijeras y pinzas, diseccionar el fémur y tibiaes de ratones y colocarlos en una placa de cultivo tisular de 60 mm que contiene 6 ml de helado de RPMI1640 con FBS inactivado por calor al 5%. Utilizar tejido Kimwipe para eliminar músculo y otros tejidos. Cortar ambos extremos de cada eje del hueso en el plato. </li><li> Conectar el extremo del hueso con aguja 23G en la jeringa de 3 cc, enjuagar la médula ósea con RPMI1640 con FBS al 5% inactivado por calor en el plato. Desagregar los tejidos de la médula ósea por aspiraciones repetidas utilizando la misma aguja. Transferir la suspensión celular a 15 ml tubo de centrífuga. </li><li> Centrifugue las células durante 5 min a 400 xg, eliminar el sobrenadante, resuspender las células en 1 ml de tampón a temperatura ambiente de color rojo sangre lisis celular (155 mM potassium bicarbonato, cloruro de amonio 10 mM, 0,1 mM de EDTA, 7,4 = PH) e incubar a temperatura ambiente durante 5 min y después se añade 5-10 ml de RPMI 1640 con FBS al 5% inactivado por calor. </li><li> Pasar las células a través de un filtro de células. Recoger el flujo a través de un tubo nuevo. Centrifugue durante 5 min a 400 x g. Eliminar el sobrenadante, el pellet de células no debe contener ningún color rojo. La ausencia de color rojo indica una eliminación completa de las células rojas de la sangre. Resuspender el sedimento celular en 10 ml de RPMI1640 con FBS al 5% inactivado por calor. Vórtice suavemente para asegurarse de que la suspensión de células es completamente uniforme. Tomar una parte alícuota y se cuentan las células en un hemocitómetro. Calcular la cantidad de volumen de células necesarias para el trasplante de médula ósea y células alícuotas suficientes y mezclar células masculinas donantes con células competidor femenino en una proporción de 5:2. Centrifugue durante 5 min a 400 xg, se lava con PBS, se resuspende en PBS con la concentración final de células del donante en 5 × 10 6 células / ml y competidor en 2 × 10 6 </sup&gt; / ml. </li></ol> 2. Trasplante de Médula Ósea Competitiva <ol><li> Irradiar ratones hembra receptora (8-12 semanas de edad) con gamma 137Cs radiador rayos en una sola dosis de 11Gy 4-6 h antes del trasplante de médula ósea. </li><li> Coloque los ratones irradiados femeninos en un mecanismo de contención del ratón. Se inyecta la mezcla de donante y las células de la competencia a través de la vena caudal en 0,1 ml de volumen total de tal manera que cada ratón recibe el 5 × 10 5 células del donante y 2 × 10 5 células de médula ósea de la competencia. </li></ol> 3. Recogida de muestras Semana pareja después del trasplante de médula ósea, recoger muestras de sangre periférica (~ 50 l) de ratón hembra receptora por sangrado retro-orbital bajo anestesia condición. Las muestras se recogen en tubos con EDTA recubiertos. BM muestras también pueden ser recogidos al final del experimento, usualmente al menos 4 meses después del trasplante, con los mismos procedimientos que se describen anterior (Paso 1); generalmente 20-40% deUna tibia BM células son suficientes para hacer la cantidad suficiente de ADN. La sangre o muestras de la misma edad BM ratones normales de ambos sexos también se recogen para preparar la curva estándar. 4. Aislamiento de ADN genómico <ol><li> Añadir 4 × volumen de habitación lisis temperatura del tampón RBC (~ 200 l) a cada muestra de sangre. Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir 1 ml de PBS, a continuación, girar hacia abajo para retirar la mayor parte de la RBC lisada. </li><li> Aislar ADN usando un kit de extracción de ADN de sangre (QIAmp DNA Blood Kit de extracción). Pre-caliente el tampón de elución (AE) a 37 º C para mejorar el rendimiento de ADN eluido. ADN masculino y femenino para la curva estándar se aíslan de manera similar. </li><li> (Opcional) El ADN genómico puede ser purificado adicionalmente o se concentró utilizando el método de precipitación con EtOH en presencia de acetato de sodio 3 M (pH = 5,5). Los sedimentos de ADN se resuspende en agua destilada 40-50 l para el análisis inmediatamente o almacenado a -20 ° C para su uso futuro. </li><li> Mida la concentr ADNción con fotómetro espectros Nanodrop ND-1000. Las muestras con OD 260/280 entre 1.8-2.0 se utilizan para el análisis adicional. </li><li> Diluir el ADN con ADNasa libre de H 2 O para 4ng/μl en un volumen total de 50 l. </li></ol> 5. Preparación Curva Estándar Diluir ADN masculino y femenino de ADN a una concentración de 4 ng / l, y hacer la mezcla de ADN según la Tabla 1 <table border="1"><tbody><tr><td> % De ADN masculino en segundo plano Mujer </td><td> Volumen (l) de ADN masculino 4ng/μl </td><td> Volumen (l) de ADN femenino 4ng/μl </td><td> Volumen total (l) </td></tr><tr><td> 0,2 </td><td> 1 </td><td> 499 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 0,5 </td><td> 1 </td><td> 199 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 2,5 </td><td> 5 </td><td> 195 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 12,5 </td><td> 25 </td><td> 175 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 87,5 </td><td> 175 </td><td> 25 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 200 </td><td> 0 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Preparación de la muestra para la curva estándar. Normales macho y hembra FVB / NJ ratones a la edad de 8-12wks fueron sacrificados. Células de la sangre y el BM fueron recogidos. Los ADN de las células masculinas y femeninas células fueron aisladas y re-suspendido a una concentración de 4ng/μl. Los ADN masculino y femenino se mezclaron en diferentes proporciones para generar las mezclas de ADN de la muestra estándar. 6. PCR en tiempo real <ol><li> Configurar la placa de reacción de PCR mezclando SYBR Green Supermix reactivo con cebadores y ADN genómico. El volumen de reacción (20 l) contiene 400 nM de cada cebador y 5 l de ADN genómico de células sanguíneas (4ng/μl l x5 = 20 ng) en cada reacción. ADN samples y las normas se establecieron por triplicado. Las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 2. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del gen </td><td> Adelante </td><td> Marcha atrás </td></tr><tr><td> Bcl2 </td><td> 5&#39;-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA </td><td> 5&#39;-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG </td></tr><tr><td> Zfy1 </td><td> 5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA </td><td> 5&#39;-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC </td></tr></tbody></table> Tabla 2. RT-PCR cebador de secuencia de murino Bcl2 y Zfy1. <ol start="2"><li> Realizar reacción de PCR usando Biorad iQ5 máquina de PCR con las siguientes condiciones: 95 ° C 3 min, 42 ciclos de amplificación de 95 ° C durante 10 s, 58 ° C durante 25 seg y 72 ° C durante 15 segundos, seguido por una fusión de curva el paso. </li><li> Obtener ciclo umbral (Ct) valores por Bio-Rad iQ5 2,1 Edición del sistema óptico estándar. Calcular? Ct (Ct Zfy1 &lt;/ Sup&gt;-Ct Bcl2) valor, y Zfy1 nivel de expresión se calcula como el valor de 2-δ Ct. </li><li> Establecer las curvas de calibración para cada serie reacción utilizando 2-? Ct lectura de conocidos / as mezclas estándar. Las curvas de calibración se generan por el trazado de la media de 2-? Ct valor de triplicados en el ADN conocida macho% en la mezcla con ajuste de regresión lineal. </li></ol>

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</ol>

Nosotros no tenemos intereses financieros en competencia a revelar.

El objetivo de nuestro estudio es proporcionar a los espectadores una técnica basada en PCR para cuantificar quimerismo de células donantes en un modelo competitivo trasplante de médula ósea murina. Varios estudios han descrito el uso de RT-PCR para detectar células del donante en modelos de trasplante 9-10. El grupo del Dr. Schwarzenberger la primera desarrollado un trasplante de médula ósea murina modelo de trasplante usando PCR en tiempo real para amplificar y-cromosoma específico 8. Este método...

Murino médula ósea (MO) trasplante modelo fue desarrollado por primera vez en 1960 1. Este modelo se ha usado ampliamente para el estudio de células madre de un donante hematopoyéticas (HSC) biología en un ratón receptor host. Médula ósea murina modelo de trasplante nos ha proporcionado valiosa información sobre las funciones de HSC y su regulación y es indispensable en la investigación HSC. Alogénico de médula ósea como modelo de transplante C57Bl/6J H2B-Balb / C H2d o modelo de trasplante congenic como C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 se utilizan en muchos laboratorios para estudiar la función de genes en la actividad HSC 2, el efecto de fármaco de tratamiento de enfermedades de función HSC 3 o trasplante relacionados, tales como la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) 4. Marcadores de superficie celular tales como haplotipo MHC o CD45.1 son comúnmente utilizados para distinguir las células derivadas del donante de células receptoras-originaron. C57Bl/6J H2b, CD45.2 </sup&gt;, Balb / C H2d y CD45.1 B6.SJL son las cepas de ratón más comúnmente usados ​​en el trasplante de médula ósea debido a que la contribución de donantes de células pueden ser fácilmente evaluada por citometría de flujo midiendo vs CD45.1 o CD45.2 H2b vs H2D. Sin embargo, muchas otras cepas como FVB / NJ 5 y C3H también se utiliza a menudo para generar transgénicos o genéticamente ratones knockout. Estos ratones pueden ser retrocruzaron a una línea consanguínea y mantenido en una genético mixto / MHC fondo. En estos casos, la determinación de quimerismo de células donantes y la función HSC podría ser difícil como donante específico de células marcadores de superficie puede no estar disponible. Utilizando Y-cromosoma sonda específica de ADN para detectar las células del donante masculino por Southern blot en el sexo no coincide el trasplante de médula ósea ha sido desarrollado por el grupo del Dr. Miwa 6. Entonces, una PCR en tiempo real para la región Y determinante del sexo se encontró que era un método preciso y altamente específico para cuantificar male células fetales en la sangre materna sistema 7. Este concepto fue adaptado por el grupo del Dr. Schwarzenberger para el desarrollo de una técnica de PCR en tiempo real en un modelo de trasplante de médula ósea murina para determinar quimerismo de células donantes 8. Hemos modificado adicionalmente este método para la medición de quimerismo de células donantes en FVB / NJ modelo de trasplante de médula ósea de ratón. Este método actualmente es ampliamente utilizado en nuestro grupo para estudiar el papel de Pim1 quinasa en biología HSC.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Hyclone </td><td> SH30255.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-017 </td><td> Inactivado por calor </td></tr><tr><td> Cloruro amónico </td><td> MP Biomedicaals </td><td> 194806 </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonato de Potasio </td><td> Pescador </td><td> P184-500 </td><td></td></tr><tr><td> QIAamp DNA Blood minikit </td><td> Qiagen </td><td> 51106 </td><td></td></tr><tr><td> Celular filtro </td><td> BD biociencias </td><td></td><td></td></tr><tr><td> iQ SYBR Green Supermix </td><td> Biorad </td><td> 170-8882 </td><td></td></tr><tr><td> iQ5 PCR en tiempo real de la máquina </td><td> Biorad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Spectra fotómetro </td><td> Nanodrop ND-1000 </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

usando cuantitativa en tiempo real pcr para determinar quimerismo de células donantes en un modelo competitivo trasplante de médula ósea murina

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murino de trasplante de médula ósea modelos constituyen una herramienta importante en la medición de células madre hematopoyéticas (HSC) y los genes que determinan las funciones / moléculas que regulan las CMH. En estos sistemas modelo de trasplante, la función de HSCs se determina por la capacidad de estas células a ratones injertan y reconstituir receptores irradiados letalmente. Comúnmente, la célula donante contribución / injerto se mide por los anticuerpos específicos de donante-proteínas de superficie celular por citometría de flujo. Sin embargo, este método depende en gran medida de la especificidad y la capacidad del marcador de superficie celular para diferenciar las células derivadas del donante de células receptoras originados, que pueden no estar disponibles para todas las cepas de ratón. Teniendo en cuenta los diversos antecedentes de cepas de ratón genéticamente modificados en el mercado, esta superficie de la célula / citometría de flujo basado en el método tiene limitaciones importantes, especialmente en las cepas de ratón que carecen bien definidos marcadores de superficie de células donantes separados de congenic destinatario cells. Aquí, se informó de una técnica basada en PCR para determinar quimerismo de células donantes / contribución en los ratones receptores de trasplante. Hemos trasplantado machos donantes de médula ósea a HSCs irradiados letalmente ratones hembra congénicos. Muestras de sangre periférica fueron recolectadas en diferentes tiempos después del trasplante puntos. Muestras de médula ósea se obtuvieron al final de los experimentos. ADN genómico se aisló y el gen específico de cromosoma Y, Zfy1, se amplificó utilizando PCR en tiempo real cuantitativa. El injerto de los machos células derivadas del donante en los ratones receptores hembra se calculó contra curva estándar con un porcentaje conocido de los ADN macho contra hembra. Bcl2 se utilizó como gen de referencia para normalizar la cantidad de ADN total. Nuestros datos sugiere que este enfoque fiable determina quimerismo de células donantes y proporciona un método útil, pero sencillo en la medición de la reconstitución de células hematopoyéticas en modelos murinos trasplante de médula ósea. Nuestro método puede ser realizada de forma rutinaria en la mayoría de los laboratorios porque noequipos costosos tales como la citometría de flujo se requiere.

La Figura 1 y 2 mostraron ejemplos de las curvas de calibración trazada con valores medios de 2-? Ct contra porcentajes de ADN masculino. Figura 1A muestra la temperatura de fusión específica para Bcl2 y Zfy1 amplicones localizados a 78,5 ° C y 88,5 ° C, respectivamente. Bcl2 se utiliza como un gen de referencia para normalizar la cantidad total de ADN cargado en cada reacción de PCR. Bcl2 curvas de amplificación (vista de registro) para cada muestra estándar fusionarse entre...

Determinación de quimerismo de células donantes presenta un reto en modelos de ratón trasplante de médula ósea que carecen bien definidos marcadores fenotípicos. Se presenta una metodología para cuantificar injerto macho donante de células en ratones hembras receptoras de trasplante. Este método se puede utilizar en todas las cepas de ratón para el estudio de funciones HSC.

Usando cuantitativa en tiempo real PCR para determinar quimerismo de células donantes en un modelo competitivo Trasplante de médula ósea murina

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

El objetivo general de este procedimiento es llevar a cabo una técnica basada en PCR para cuantificar el injerto de células donantes en un modelo competitivo de trasplante de médula ósea en ratones, lo cual se logra primero realizando un trasplante de médula ósea en ratones hembra receptores utilizando células donantes macho. A continuación, se recoge sangre periférica de los ratones receptores en diferentes momentos temporales y se aísla el ADN genómico. Las muestras se preparan para una curva patrón.Finalmente, se realiza la PCR en tiempo real con muestras patrón y muestras de prueba. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el injerto de células derivadas del donante masculino en ratones receptores hembra mediante el cálculo frente a una curva patrón con un porcentaje conocido de ADN masculino frente a femenino. La ventaja del método masculino respecto a técnicas existentes como un método basado en citometría de flujo es que es más sensible, más económico y las muestras pueden almacenarse durante mucho tiempo.Lo más importante es que nuestra técnica es muy independiente de la cepa y puede utilizarse en cualquier fondo genómico de ratones, como un marcador d

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Trasplante de médula ósea murina es una técnica ampliamente utilizada para estudiar los mecanismos inmunológicos que regulan injerto contra huésped enfermedad en los seres humanos. La capacidad para monitorear los patrones de tráfico de células...

La inducción de la enfermedad de injerto contra huésped y<em&gt; En Vivo</em&gt; T Monitoreo Celular Utilizando un modelo murino MHC de concordancia

Trasplante de médula ósea proporciona una manera de cambiar el genotipo de las células de médula ósea derivadas. Si el gen de interés se expresa tanto en las células derivadas de la médula ósea y no células de médula ósea derivadas, transplante de médula ósea puede cambiar las células de médula ósea derivadas de un genotipo diferente sin cambiar la no de la médula ósea derivada genotipo celular.

Diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por Trasplante de Médula Ósea

Este video muestra la inducción de la enfermedad de injerto contra huésped intestinal, EICH, en un ratón receptor irradiado letalmente utilizando células madre hematopoyéticas alogénicas y linfocitos T aloreactivos esplénicos inductores de EICH. Este protocolo ayuda a establecer un modelo de EICH intestinal aguda grave para comprender el mecanismo de la enfermedad y desarrollar opciones terapéuticas innovadoras.

Inducción de la enfermedad de injerto contra huésped en modelos de ratón mediante trasplante alogénico de médula ósea y células esplénicas

Masas de tejido complejo, de órganos a los tumores, se componen de diversos elementos celulares. Hemos dilucidado la contribución de los fenotipos celulares dentro de un tejido utilizando ratones transgénicos fluorescentes de múltiples etiquetados en combinación con la tinción de inmunofluorescencia seguido de multiparamétrico desmezcla espectrales de descifrar origen celular, así como características de células basado en la expresión de proteínas.

Análisis Cuantitativo multiespectrales después de un trasplante de tejido fluorescente para la visualización de los Orígenes celulares, tipos y Interacciones

Presentamos un protocolo rápido y flexible para un sistema de expresión in vivo basado en un solo receptor de células T (TCR) retroviral.  Los vectores retrovirales se utilizan para transducir células progenitoras de la médula ósea con el fin de estudiar el desarrollo y la función de las células T in vivo como alternativa a los ratones transgénicos TCR.

Retroviral transducción de células progenitoras de médula ósea para generar las células T del receptor Retrogenic ratones

Microscopía de fluorescencia intravital (IVFM) de la bóveda craneal se aplica en combinación con la genéticos modelos animales para estudiar el autoguiado hacia el blanco y el engraftment de células hematopoyéticas en la médula (BM) nichos.

Combina la microscopia Intravital fluorescente (IVFM) con modelos genéticos para estudiar dinámica del Engraftment de células hematopoyéticas a nichos de la médula ósea

Este protocolo proporciona pautas paso a paso para establecer experimentos competitivos de trasplante de médula ósea de ratón para estudiar la función de las células madre/progenitoras hematopoyéticas sin purificación previa de las células madre mediante clasificación de células.

Los trasplantes competitivos para Evaluar la aptitud de Células Madre Hematopoyéticas

Este manuscrito proporciona una descripción de la metodología utilizada para establecer modelos de ratón de transducción-trasplante. Se da cuenta detallada de los errores técnicos que se deben evitar al realizar trasplantes de médula ósea. Se debe obtener una comprensión clara de la importancia del título viral alto, la transfección/transducción y la irradiación.

Transducción-Trasplante modelo de ratón de Neoplasias mieloproliferativas

Aquí, presentamos un protocolo para inducir y puntuar enfermedades en un modelo xenogénico de enfermedad de injerto contra huésped (xenoGVHD). xenoGVHD proporciona un modelo in vivo para estudiar la inmunosupresión de células T humanas. Además, describimos cómo detectar células T humanas en tejidos con PCR digital como herramienta para cuantificar la inmunosupresión.

Inducción y puntuación de la enfermedad de injerto-versus-huésped en un modelo de murina xenógeno y cuantificación de células T humanas en tejidos de ratón utilizando PCR digital

Describimos tres métodos de trasplante de la médula (BMT): BMT con la irradiación de cuerpo entero, BMT con la irradiación blindada, y método de BMT sin el pre-condicionamiento (BMT adoptivo) para el estudio de la hematopoyesis clónica en modelos del ratón.

Procedimientos de trasplante de médula ósea en ratones para estudiar la hematopoyesis clonal

Este protocolo describe la inyección intrafemoral de unas pocas células madre hematopoyéticas o leucémicas, incluidas las células editadas genéticamente, en modelos de xenoinjertos murinos, lo que no solo permitirá el trasplante rápido y seguro de células, sino también análisis seriados de la médula ósea.

Las inyecciones intrafemorales simplificadas con ratones vivos permiten un análisis continuo de la médula ósea

Aprende a cuantificar el quimerismo de células donantes mediante PCR en tiempo real en un modelo competitivo de trasplante de médula ósea murina. Este método sensible y económico permite evaluar la engraftación en diferentes cepas de ratones.

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