Usando cuantitativa en tiempo real PCR para determinar quimerismo de células donantes en un modelo competitivo Trasplante de médula ósea murina

El objetivo general de este procedimiento es llevar a cabo una técnica basada en PCR para cuantificar el injerto de células donantes en un modelo competitivo de trasplante de médula ósea en ratones, lo cual se logra primero realizando un trasplante de médula ósea en ratones hembra receptores utilizando células donantes macho. A continuación, se recoge sangre periférica de los ratones receptores en diferentes momentos temporales y se aísla el ADN genómico. Las muestras se preparan para una curva patrón.

Finalmente, se realiza la PCR en tiempo real con muestras patrón y muestras de prueba. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el injerto de células derivadas del donante masculino en ratones receptores hembra mediante el cálculo frente a una curva patrón con un porcentaje conocido de ADN masculino frente a femenino. La ventaja del método masculino respecto a técnicas existentes como un método basado en citometría de flujo es que es más sensible, más económico y las muestras pueden almacenarse durante mucho tiempo.

Lo más importante es que nuestra técnica es muy independiente de la cepa y puede utilizarse en cualquier fondo genómico de ratones, como un marcador de superficie celular bien definido para diferenciar las células donantes de las células receptoras. Después de sacrificar a los ratones donantes machos y hembras FVB/nj bajo una campana de flujo laminar, use tijeras pequeñas y pinzas para diseccionar los huesos del fémur y la tibia y colóquelos en una placa de cultivo de tejidos de 60 milímetros que contenga seis mililitros de RPMI 1640 frío con 5 % de FBS inactivado por calor. Utilice una toallita Kim para eliminar el músculo y otros tejidos, y corte ambos extremos del eje de cada hueso en la placa. A continuación, conecte los extremos de los huesos a una aguja de calibre 23 unida a una jeringa de 3 cc llena de RPMI 1640 con 5 % de FBS inactivado por calor y extraiga la médula ósea.

Utilice la misma aguja para desagregar el tejido de médula ósea mediante aspiraciones repetidas. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue durante cinco minutos a 400 ×g. Tras eliminar el sobrenadante, resuspenda las células en un mililitro de tampón de lisis de glóbulos rojos a temperatura ambiente e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos antes de añadir entre cinco y 10 mililitros de RPMI 1640 con 5% de FBS inactivado por calor. Pase las células a través de un filtro celular y recoja el flujo filtrado en un tubo nuevo. Tras centrifugar las células durante cinco minutos a 400 ×g y eliminar el sobrenadante, el precipitado debe estar libre de color rojo, lo que indica la eliminación completa de los glóbulos rojos. Resuspenda en 10 mililitros de RPMI 1640 con 5% de FBS inactivado por calor. Después de vortexar suavemente, añada una pequeña alícuota a un hemocitómetro y cuente las células.

Calcule el volumen de células necesario para mezclar con células competidoras femeninas en una proporción de cinco a dos para el trasplante de médula ósea. Como paso final para preparar las células para la inyección, mezcle los pellet de células donantes y competidoras, lávelos con PBS y resuspenda en PBS a una concentración final de cinco veces 10 a la sexta por mililitro de células donantes y dos veces 10 a la sexta por mililitro de células competidoras, cuatro a seis horas antes del trasplante de médula ósea. Irradie ratones receptores hembras con radiación gamma de cesio 137 a una dosis única de 11 grays.

Coloque las ratonas irradiadas en un sujetador para ratones e inyecte las células donantes y competidoras mezcladas a través de la vena de la cola en un volumen total de 0,1 mililitros, de modo que cada ratón reciba cinco veces 10 a la quinta células donantes y dos veces 10 a la quinta células competidoras de médula ósea para extraer muestras de sangre. Después de anestesiar, recoja aproximadamente 50 microlitros de sangre en tubos recubiertos con EDTA mediante sangrado retroorbital. También recoja muestras de ratones machos y hembras de edad similar.

A continuación, aísle el ADN genómico de ratones sujetos y ratones. Para la curva estándar, agregue aproximadamente 200 microlitros de tampón de lisis de GR a temperatura ambiente a cada muestra de sangre e incube durante cinco minutos. Agregue un mililitro de PBS y centrifugue para eliminar la mayor parte de los GR lisados.

Luego, utilice un kit de extracción de ADN de sangre para aislar el ADN, precalentando el tampón de elución a 37 grados Celsius. Para mejorar el rendimiento, mida la concentración de ADN de cada muestra. Aquellas con una relación de OD 260 a 280 entre 1,8 y 2,0 se utilizan para análisis posteriores.

Para preparar una curva estándar, diluya el ADN masculino y femenino hasta una concentración de cuatro nanogramos por microlitro y prepare la mezcla de ADN según estas indicaciones. Prepare la placa de reacción de PCR mezclando el reactivo supermix con tinte cyber green, los cebadores mostrados aquí y el ADN genómico. Cada reacción de 20 microlitros contiene 400 nanomolares de cada cebador y cinco microlitros de ADN genómico de células sanguíneas, realizada por triplicado.

Realice la PCR según las condiciones descritas en el protocolo del texto y obtenga los valores del umbral de ciclo o CT. Calcule el delta CT multiplicado por la cantidad de CT elevado a ZY1 menos CT elevado a BCL2 y los niveles de expresión de ZY1 o 2 elevado a menos delta CT. Genere curvas estándar graficando la media de los valores de 2 elevado a delta CT en triplicado frente al porcentaje conocido de ADN masculino en la mezcla, con un ajuste de regresión lineal mostrado. A continuación se presentan ejemplos de curvas estándar graficadas con los valores medios de 2 elevado a delta CT frente a los porcentajes de ADN masculino.

Este gráfico incluye una temperatura de fusión específica para los amplicones BCL2 y ZFY1 localizados a 78,5 y 88,5 grados Celsius, respectivamente. BCL2 se utiliza como gen de referencia para normalizar la cantidad total de ADN cargado en cada reacción de PCR. Las curvas de amplificación de BCL2 para cada muestra patrón se fusionan entre sí independientemente de la concentración de ADN masculino, lo que indica cantidades iguales de ADN cargado.

Sin embargo, las curvas de amplificación de ZFY migraron hacia la izquierda con cantidades crecientes de ADN masculino en las células madre hematopoyéticas de la muestra; las células de ratones PIM TKO presentan defectos para reconstituir ratones letalmente irradiados, y como era de esperar, los ratones receptores trasplantados con células PIM TKO tuvieron un porcentaje mucho menor de células masculinas en comparación con los ratones trasplantados con células de tipo silvestre. Para validar nuestro método, analizamos el injerto de células donantes masculinas en ratones hembra trasplantados, que recibieron células de médula ósea de ratones de tipo silvestre frente a ratones con triple knockout PIM o TKO en diferentes puntos temporales posteriores al trasplante, tanto en sangre periférica a las seis semanas como en muestras de médula ósea a las 16 semanas. Se analizaron tras ver este video.

Debe tener un buen conocimiento sobre cómo utilizar un método basado en PCR para cuantificar el injerto de células donantes en un modelo competitivo de trasplante de médula ósea en ratones.