La electroporación neonatal zona subventricular
11 de febrero de 2013
Se demuestra una técnica mínimamente invasiva conocida como electroporación neonatal zona subventricular. La técnica consiste en la inyección de ADN de plásmido en los ventrículos laterales de cachorros neonatales y la aplicación de corriente eléctrica para suministrar y manipular genéticamente las células madre neuronales
El objetivo de este procedimiento es etiquetar y manipular genéticamente los constituyentes moleculares de las células madre neurales de la zona subventricular. Esto se logra insertando primero una pipeta de vidrio cargada con ADN en el ventrículo lateral de un P cero P. El segundo paso es expulsar el ADN al líquido cefalorraquídeo del ventrículo lateral. La siguiente corriente se aplica al P. Esto permite la transferencia de ADN a las células madre neurales que recubren los ventrículos laterales.
En última instancia, se utiliza una combinación de técnicas moleculares, que incluyen inmunohistoquímica, biología molecular, microscopía y electrofisiología, para visualizar los cambios en el destino, la proliferación, la migración y la maduración de las células madre neuronales de la zona subventricular. La electroporación de la zona subventricular neonatal puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurogénesis, como qué vías moleculares son responsables de regular la proliferación, diferenciación, migración y maduración de las células madre neuronales y su progenie. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los ratones transgénicos, es que permite el marcaje rápido y robusto de las células madre neuronales de la SVZ de una manera eficiente en el tiempo y rentable.
En primer lugar, asegúrese de que el ADN a electropurar sea de alta pureza y concentración y esté libre de endotoxinas. Tire de tubos capilares de vidrio de sílice BO pulidos al fuego de 10 centímetros en pipetas. Aquí se utiliza un juego de extractores de pipetas PP eight 30 ghhi PC 10 para tirar de un tiro ponderado de un solo paso a 70,5 grados centígrados Después de tirar de la pipeta, utilice pinzas circulares para romper la punta.
A continuación, inspeccione la pipeta con un microscopio de disección para asegurarse de que no hay bordes irregulares. Si es necesario, la punta se puede biselar con una piedra de afilar. A continuación, coloque las pipetas vertidas bajo una lámpara UV durante 15 minutos.
Una vez transcurridos los 15 minutos, marque la pipeta a dos milímetros del borde de la punta con un rotulador de punta fina. Por último, prepare una solución verde rápida de 0,1 peso por volumen mezclando solución salina estéril filtrada al 0,9% estéril con anestesia verde seca y rápida. Un cachorro de cero a un día de edad, una placa de Petri de vidrio preenfriada a cuatro grados centígrados y colocada sobre hielo occidental Después de aproximadamente cinco minutos, determine el estado de anestesia utilizando la respuesta de pellizco del pie.
Si no hay movimiento, comience la inyección intraventricular. Combine la solución verde rápida con la solución de ADN y alícuota de uno a dos microlitros en la biopelícula. Es importante que esto se haga justo antes de la inyección, ya que la combinación de una solución verde rápida con ADN puede dar lugar a una rápida evaporación y cristalización con el posterior bloqueo de las pipetas de vidrio, aspirar todo el volumen de alícuotas con una jeringa de microfilm y cargar la pipeta de vidrio en un inyector de aire a presión.
Ahora, agarre y sostenga suavemente la cabeza del cachorro entre el pulgar y el índice de la última mano dominante. Luego encienda la lámpara y sostenga la cabeza del cachorro justo fuera del haz de luz. Si los ventrículos no son claramente visibles, humedezca la cabeza con solución salina estéril para ayudar a reducir la cantidad de luz reflejada por el cuero cabelludo.
A continuación, con la mano dominante, inserte la aguja en el ventrículo lateral del lado cercano. El sitio de inyección debe estar aproximadamente equidistante de la sutura OID y del ojo, y dos milímetros lateral a la sutura sagital. Inserte la pipeta extraída en la marca de dos milímetros para obtener un estallido P cero, que debería asegurar la penetración en el ventrículo lateral.
El relleno posterior de líquido cefalorraquídeo en la pipeta puede ocurrir debido a la liberación de presión intracraneal. Si esto sucede, afloje el agarre de la cabeza del POP para reducir la presión y ayudar en la inyección del plásmido. Una vez que la pipeta esté insertada de manera óptima, inyecte aproximadamente 0,5 microlitros de plásmido en el ventrículo lateral.
Configure el voltaje del generador de operación eléctrica para cinco pulsos cuadrados, 50 milisegundos por pulso y 100 voltios con intervalos de 50 milisegundos. La especificidad espacial de la operación electro de plasma viene dada por la dirección de la transferencia de carga, por lo que se debe tener en cuenta el espacio de la ubicación de los electrodos dada la diversidad de las celdas de la SVZ. Las personas han reportado cambios en términos de destino celular y proliferación en las ubicaciones ventral dorsal a CAU.
Después de la inyección de la inmersión del plásmido, las pinzas se electrodan en PBS para maximizar la transferencia de carga y ayudar a prevenir quemaduras causadas por la resistividad. A continuación, coloque el electrodo positivo en la pared lateral dorsal del cráneo cerca de la oreja y sumerja el lateral en la inyección de citoplasma. A continuación, coloque el electrodo negativo en el hemisferio contralateral ventral lateral al hocico pop.
Esta figura muestra la orientación correcta de los electrodos negativo y positivo con respecto a los ejes x, y, Z en el cachorro inyectado. Inicie la transferencia de corriente presionando el pedal del interruptor de pie de pulso y barra los electrodos de dorsal a lateral usando intervalos de ángulo de alrededor de 25 grados. Una vez que se complete la electroporación, coloque todos los cachorros electroporados en una almohadilla térmica durante cinco minutos.
Gire suavemente a los cachorros cada 30 segundos con una estimulación leve. Esta imagen muestra el ventrículo lateral de un ratón neonatal 24 horas después de la electroporación de un vector codificante de EGFP. Las celdas electro clasificadas emiten fluorescencia verde.
Aquí vemos el ventrículo lateral marcado con LV 28 días después de la electroporación de la recombinasa Cree y los plásmidos que codifican GFP en ratones que llevan un código de parada en la fase anterior de la recombinación del tomate TD que induce la expresión del tomate TD visto en rojo, la dilución sucesiva del plásmido que da como resultado pocas células SVZ positivas para EGFP restantes o el tomate TD expresado genómicamente se expresa permanentemente. La dilución del plásmido, el ADN que se muestra en verde es evidente dado que más células en la capa de células granulosas del bulbo olfatorio marcadas como OB, expresan el marcador genómico TD tomate que se muestra en rojo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar y manipular las células madre de la SVZ.
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Visión general
Este artículo presenta una técnica mínimamente invasiva conocida como electroporación subventricular neonatal, que permite la manipulación genética de las células madre neuronales en cachorros neonatales. El método implica inyectar ADN plasmídico en los ventrículos laterales y aplicar corriente eléctrica para facilitar la captación de ADN por parte de las células.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Ingeniería genética
- Investigación de células madre
Antecedentes
- Las células madre neuronales en la zona subventricular (SVZ) son cruciales para la neurogénesis.
- Los métodos tradicionales para la manipulación genética pueden ser costosos y consumir mucho tiempo.
- Esta técnica ofrece una alternativa rápida y eficiente para etiquetar y estudiar estas células.
- La electroporación mejora la entrega de ADN a las células, mejorando los resultados experimentales.
Propósito del estudio
- Etiquetar genéticamente y manipular los constituyentes moleculares de las células madre neuronales de la SVZ.
- Investigar las vías moleculares que regulan el comportamiento de las células madre.
- Proporcionar un método rentable para estudiar la neurogénesis.
Métodos utilizados
- Inyección de ADN plasmídico en el ventrículo lateral usando una pipeta de vidrio.
- Aplicación de pulsos eléctricos para facilitar la captación de ADN por las células madre neuronales.
- Uso de inmunohistoquímica y microscopía para visualizar cambios en el comportamiento celular.
- Monitoreo del destino celular, proliferación, migración y maduración post-electroporación.
Principales resultados
- Etiquetado exitoso de las células madre neuronales de la SVZ con marcadores fluorescentes.
- Cambios demostrados en el destino celular y proliferación en respuesta a la electroporación.
- Proporcionó información sobre los mecanismos moleculares que gobiernan la neurogénesis.
- Destacó las ventajas de esta técnica sobre los métodos tradicionales de manipulación genética.
Conclusiones
- La electroporación subventricular neonatal es una herramienta valiosa para la investigación en neurociencia.
- Este método permite una manipulación genética eficiente de las células madre neuronales.
- Abre nuevas vías para estudiar la dinámica de la neurogénesis y la biología de las células madre.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Neonatal subventricular zone electroporation enables rapid, cost-effective genetic manipulation of neural stem cells, supporting early-stage target validation in neurogenesis research. The technique provides a scalable alternative to transgenic models, reducing time and resource investment in preclinical target de-risking. It enhances predictive confidence by allowing direct interrogation of molecular pathways in a disease-relevant postnatal mammalian system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of molecular pathways regulating neural stem cell proliferation, differentiation, migration, and maturation.
- Operational Value: Provides rapid, robust labeling of SVZ neural stem cells and progeny for downstream phenotypic analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively assessable cellular readouts via immunohistochemistry, microscopy, and electrophysiology to evaluate genetic manipulations.
- Operational Value: Supports assay standardization through reproducible electroporation parameters and consistent DNA delivery to the lateral ventricle.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking genetic perturbations to cellular phenotypes in a postnatal rodent forebrain model.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of electroporated cells and their progeny, supporting biomarker-aligned outcome assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven manipulation of neural stem cells prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports target validation through direct genetic manipulation of SVZ neural stem cells and quantification of fate, proliferation, migration, and maturation changes.
- Screening: Delivers standardized, reproducible transfection efficiency for consistent compound or genetic perturbation screening in neural stem cell-derived systems.
- Analytics: Generates multiplexed readouts (fluorescent labeling, electrophysiological migration, immunohistochemical maturation) enabling comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects discovery-phase mechanistic insights to preclinical continuity via permanent genomic reporters (e.g., TD tomato) and dilution-tracked plasmid expression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative target interrogation across multiple genetic constructs and timepoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of stem cell behavior changes in an intact neonatal niche.
- Operational Value: Standardization via defined electroporation parameters (5 pulses, 50 ms, 100 V) and reproducible DNA injection volumes (0.5 µL).
- Strategic Value: Reduced biological risk in go/no-go decisions by enabling rapid, cost-effective target de-risking versus transgenic model generation.
- Portfolio Impact: Accelerates prioritization of neurodevelopmental targets by providing early functional evidence in a disease-relevant system.
Implementation Considerations
- Required expertise in neonatal pup handling, microsurgery, and electrophysiology-based injection techniques.
- Need for precision instrumentation including pipette pullers, microinjectors, and electroporation generators with pulse control.
- Standardization of DNA preparation (high purity, endotoxin-free, optimal concentration) and electrode placement for consistent charge transfer.
- Adaptation considerations across rodent strains and developmental timepoints (P0-P1) to maintain ventricular access and cell targeting efficiency.
- Practical limitations include variable transfection efficiency due to ventricular anatomy and CSF dynamics, requiring operator training for reproducibility.
