Un modelo de pez cebra de la diabetes mellitus y la memoria metabólica

Memoria metabólica es el fenómeno por el cual las complicaciones diabéticas persistir y progresar sin obstáculos, incluso después de euglucemia se logra farmacéuticamente. Aquí se describe un modelo de pez cebra diabetes mellitus, que es la única que permite el examen de los componentes epigenéticos mitóticamente transmisibles de memoria metabólica

El objetivo general de este procedimiento es generar un modelo de pez cebra con diabetes mellitus tipo uno, que se pueda utilizar para descubrir las bases moleculares de las complicaciones de la diabetes mellitus y, lo que es más importante, determinar la base genética de su persistencia. Esto se logra induciendo primero la hiperglucemia con una serie de inyecciones del fármaco diabetogénico STZ y la incubación de los peces a una temperatura reducida. A continuación, después de tres semanas, se determinan los niveles de glucosa en sangre en ayunas para garantizar que se indujo el estado de hiperglucemia y se suspende el fármaco para iniciar la recuperación de las células beta.

A continuación, se amputa la aleta caudel y se le permite regenerarse para aislar los componentes genéticamente transmisibles de la memoria metabólica y eliminar los factores potencialmente complicados del entorno hiperglucémico anterior. Finalmente, se realiza un ensayo de regeneración de aletas para documentar una reducción persistente en la regeneración de aletas e identificar los cambios inducidos en el tejido seccionado a través de un ensayo de interés. La principal ventaja del modelo de pez cebra diabético sobre los existentes es que la memoria metabólica se puede estudiar en un verdadero ambiente glucémico U de verano a lo que se vería en los pacientes después de un trasplante de páncreas.

Esperamos que el modelo se utilice para el descubrimiento de las modificaciones epigenéticas que subyacen a la memoria metabólica y la persistencia de las complicaciones diabéticas. Para generar peces cebra con diabetes mellitus, prepare un tanque de recuperación con agua normal para peces y un tanque anestésico de agua para peces con una dilución de uno a 1000 de dos fenoxietanol bajo una campana extractora. Prepare una solución al 0,3% de STREPTOZOTOCINA o STZ añadiendo seis miligramos de STZ a dos mililitros de cloruro de sodio al 0,09%, e inmediatamente coloque la solución en hielo en un tubo separado. Alícuota suficiente solución salina para el control.

Los peces llenan una jeringa de medio CC equipada con una aguja de calibre 27 y medio con la STZ o soluciones de control, asegurándose de que no queden atrapadas burbujas de aire. Anestesia a un solo pez colocándolo en agua anestésica y esperando hasta que el movimiento de natación cese alrededor de uno o dos minutos. Una vez anestesiado, coloque brevemente el pez sobre una toalla de papel para absorber el exceso de agua, luego coloque el pez en un bote y péselo.

A continuación, coloque el pescado sobre una superficie firme. A continuación, inserte la aguja más allá del bisel en la cara posterior del peritoneo ventral e inyecte 0,35 miligramos por gramo de TZ o un volumen equivalente de solución de control en la cavidad peritoneal del pez después de la inyección. Coloque a los peces en el tanque de agua de recuperación y controle su actividad normal de natación.

Después de inyectar suficientes peces para el experimento, transfiéralos a tanques vivos normales y manténgalos a una temperatura de 22 a 24 grados centígrados. La temperatura reducida es fundamental para la inducción eficiente de la hiperglucemia para inducir un estado prolongado de hiperglucemia muy alta, siga un programa de inyecciones frecuentes durante la fase de inducción, seguidas de inyecciones de mantenimiento semanales como se muestra aquí para recolectar sangre. Para determinar la FBGL, prepare un tubo de PCR marcado para cada muestra de sangre que contenga cinco microlitros de solución salina normal.

Después de anestesiar al pez, seque el exceso de agua, coloque el pez en un portaobjetos de microscopio y con un bisturí, retire la cabeza en la base del opérculo, recoja la sangre que se libera en el portaobjetos y agréguela rápidamente al tubo de PCR de pipeteo estéril y salino normal hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de que la sangre no se coagule de inmediato, coloque la muestra en hielo. Determine el volumen de la muestra de sangre midiendo el volumen total del líquido en el tubo y restando los cinco microlitros de solución salina. Transfiera cinco microlitros de la sangre diluida de cada tubo de PCR a un tubo de micro fuga de 1,5 mililitros y use el kit de ensayo de glucosa de cromo cuántico de acuerdo con las instrucciones del fabricante para determinar la concentración de glucosa en sangre.

Después de anestesiar un pez, colóquelo en una placa de Petri y, bajo un endoscopio de disección, use un bisturí estéril de tamaño 10 para amputar la aleta de cuña cortando una línea recta proximal al primer punto de ramificación de la tráquea lipídica para la fase de crecimiento regenerativo del ensayo. Coloque el pez en un tanque de recuperación a 33 grados centígrados para obtener imágenes de las aletas en regeneración. Después de anestesiar a un pez, extienda la aleta para que quede completamente extendida y use un telescopio de disección equipado con una cámara y software de elemento NIS.

Recopile imágenes con un aumento de x para medir el crecimiento regenerativo. Imprima las imágenes y utilice el software image J y un bloc de dibujo para trazar alrededor de toda el área de nuevo crecimiento para mayor precisión del trazado. Asegúrese de que no haya sombras ni gotas de agua y tome cada medición cinco veces para calcular el promedio.

Para normalizar las mediciones, mida la longitud del sitio de amputación a lo largo del eje ventral dorsal y divida el área previamente determinada por esta medición. Después de generar un grupo de DM FISH y sus controles a los 21 días, determine el FBGL para un subconjunto del grupo y divida el DM fish en dos subgrupos durante la duración del experimento. Continúe con las inyecciones semanales de STZ para uno de los grupos, ya que los controles de DM para el segundo grupo cesan las inyecciones de STZ e incuban a los peces a temperatura normal.

Dentro de 14 días, estos peces cebra restablecerán el control normal de la insulina y la glucosa en la sangre a través de la regeneración del páncreas. Estos peces ahora se llaman memoria metabólica o MM, los peces en el día 30 después de la eliminación del medicamento amputan las aletas de los peces de control DM y MM como se demostró anteriormente en este video para permitir el crecimiento del tejido de memoria metabólica. Regrese el pez a las condiciones normales del agua para la regeneración de las aletas durante 30 días a los 60 días.

Realizar una segunda amputación dentro del tejido que se regeneró en el período de 30 a 60 días y realizar un ensayo de regeneración de aleta de cuero, aislar el tejido y realizar un ensayo de interés. El pez cebra diabético tipo uno no solo muestra las complicaciones secundarias conocidas de retinopatía y nefropatía, sino que también exhibe una complicación adicional: la regeneración de la aleta de cudo, como se puede ver aquí a las 72 horas después de la amputación. Esta complicación persiste debido a la memoria metabólica en peces que han restablecido el control normal de la glucosa después de un período de hiperglucemia, como se muestra aquí, el pez cebra mm exhibe un déficit en la regeneración de las aletas de aproximadamente el 40% en comparación con los peces control, y el deterioro se ha observado hasta 150 días después de la amputación.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo iniciar el estado hiperglucémico en el pez cebra, medir los niveles de glucosa en sangre en ayunas, realizar estudios de regeneración de aletas y, en última instancia, generar peces de memoria metabólica.