Name: Purificación de las transcripciones y los metabolitos de Drosophila Cabezales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Aprende a purificar ARN y metabolitos de cabezas de Drosophila mediante liofilización y extracción con triol o cloroformo. Este método permite estudios de neurodegeneración de alto rendimiento con análisis de calidad por bioanalizador y RMN.

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Estamos agradecidos a Janice Santiago, Gabriel Figueroa y José Herrera para la asistencia técnica y el Bloomington Drosophila Stock Center en la Universidad de Indiana para las poblaciones de moscas. DH y CW con el apoyo de fondos de la NSF-IOS-1.051.890. PF-F y LMM el apoyo de un Fondo Semilla de Oportunidades de la Universidad de Florida.

1. Generación de un Replicar y Congelación de las moscas (PRECAUCIÓN, nitrógeno líquido) Objetivos: Recoger al menos 200 mujeres por cada punto genotipo / hora, y Flash de congelación. <ol><li> Genotipos: GAL80 SR; da-Gal4, cepa para la expresión ubicua de Gal4 bajo el control de la región daughterless reguladora sensible a la temperatura y GAL80. Como una línea de control, se utilizó UAS-LacZ, que previamente se ha demostrado que induce sin efectos nocivos. UAS-Atxn3-27Q y UAS-Atxn3-78Q, no patógenos y patógenos construcciones experimentales, respectivamente. (La Y, hs-Hid construcción se ha utilizado antes para una colección más eficiente de las hembras vírgenes, pero decidió no hacerlo debido al tiempo adicional necesario para introducir Y, hs-Hid con GAL80 ts; Gal4-da en los cromosomas II y III.) </li><li> Expandir todas las poblaciones mediante la combinación de 10 hembras y 5 machos en la botellas para evitar el hacinamiento. Todos los experimentos se llevaron a cabo en Jazz mosca medios Mix, que es fácil de preparar y promueve el crecimiento rápido de Drosophila y de baja infestación con ácaros. </li><li> Recoger 50 GAL80 ts; machos DA-Gal4, y 100 UAS-Atxn3-78Q vírgenes (sólo una línea UAS se utilizará como ejemplo) para cada punto de tiempo. </li><li> Haga diez cruces por punto de genotipo / hora. Anestesie los alumnos y alumnas en el dióxido de carbono (CO 2) del durmiente / pad. Lugar diez UAS-Atxn3-78Q vírgenes moscas (no más de cinco días) y cinco hombres ts GAL80, da-Gal4 en cada botella grande de pinchos con pasta de levadura (levadura rehidratada seco). Etiquetar las botellas con los genotipos, los puntos temporales e identificadores de botella (letras AJ), y colocarlos a 25 ° C. </li><li> Después de 2 días, desactive los adultos de las botellas, añadir una pizca de levadura seca y un chorrito de agua para fomentar el crecimiento larval óptima, y ​​colocar las botellas a 18 ° C (GAL80 activo,Reprimido Gal4). No copie los cruces, ya que esto puede introducir variabilidad experimental en la progenie derivada de fertilizado con las de hembras vírgenes. Además, la progenie de cada botella representa repeticiones biológica independiente (cada botella produce progenie único), pero cruces transferidos (copias) sería técnicos repeticiones (progenie adicional con la misma constitución genética). </li><li> Cuando la progenie ecloses a 18 ° C, anestesiar el CO 2 sofá / pad, recoger vírgenes de los genotipos deseados, y colocarlos en frascos pequeños (dos hasta doce moscas por vial). Viales que lleven el identificador de botella. No piscina vuela de botellas diferentes. Colocar los frascos a 18 ° C durante 24 horas. Para maximizar la progenie, seguiremos recogiendo en las mañanas y las tardes consecutivas. </li><li> Cuando se completa cada vial 24 horas a 18 ° C, que se desplacen a 29 ° C (GAL80 inactivo, activo Gal4). Este es el día 0, el punto de partida del experimento, cuando tLos transgenes que inician su expresión. </li><li> Transferir las moscas para limpiar viales de cada 2 días hasta que alcanzan días 10 y 20. </li><li> Cuando las moscas alcanzan la edad deseada (1, 10, 20 días), contar y transferirlos desde los viales de alimentos pre-marcados en crioviales utilizando un pequeño embudo. No anestesiar a las moscas. Invierta los frascos en el banquillo. </li><li> Espere 30 minutos para permitir que las moscas para recuperarse de la transferencia (estrés), y luego flash-congelar los viales por inmersión en nitrógeno líquido y guárdelo en un pre-etiquetado, pre-enfriado caja congelador Recuerde:. Congelar las moscas en el mismo orden se transfirieron a la criovial, haciendo el tiempo pasado en el criovial uniforme a través de muestras. </li></ol> 2. Recogida y liofilización de Jefes Fly (realizar en el cuarto frío, Pre-chill Equipo All, PRECAUCIÓN, nitrógeno líquido y hielo seco) Objetivo: Rápida separación, recolección y secado por congelación de tejido. <ol><li> AsambleaBLE el tamiz (malla más grande en la cámara superior para recoger los cuerpos, el segundo mayor en la cámara inferior para recoger las cabezas, la tapa en la parte inferior para recoger piezas pequeñas) y el pre-enfriamiento a -80 º C durante al menos 30 min. </li><li> Recoger 200 moscas de crioviales al maximizar la contribución de las moscas procedían de la misma botella. Para compensar las diferencias entre las moscas recolectadas por la mañana o por la noche, asegúrese de que todas las muestras utiliza un idéntico mañana / tarde proporción (se utilizó el 47% por la mañana / tarde 53%) Nota:. El ARN resultante de dos muestras de 100 cabezas se pueden combinar más adelante para generar el equivalente de 200 moscas en una réplica única. </li><li> Enfriar una pieza de parafilm (~ 9 x 14 cm) en hielo seco durante 5 min. </li><li> Vacíe los crioviales con las moscas completo en el parafilm, unos pocos a la vez, recuento de moscas mediante pincel, y guardar en otro criovial en hielo seco hasta llegar a 100 moscas. </li><li> Sumerja el tamiz en el nitrógeno líquido, añadir los 100 moscas a la chamb superiorer. Agitar el tamiz vigorosamente durante 1 min. Sumerja en el nitrógeno líquido de nuevo y se agita durante 1 min. </li><li> Abrir el tamiz, recoger las cabezas de la cámara inferior en un microtubo, y el lugar a -80 ° C. </li><li> Abra los microtubos, envuelva la parte superior de parafina, y hacer pequeños agujeros. </li><li> Colocar las muestras en el liofilizador durante un mínimo de 2 días. </li></ol> 3. Total RNA de extracción y purificación de ARNm (Tratar todas las superficies con RNaseZap, guantes cambian con frecuencia) Objetivo: Homogeneizar el tejido para maximizar el rendimiento, se extrae el ARN total, y purificar mRNA. <ol><li> Retire las muestras del liofilizador y añadir tres pequeñas bolas de acero pulido estériles, a cada microtubo. Coloque en el Geno / Grinder, funcionan a 1.500 golpes / min durante 1 min. </li><li> Abrir los tubos, añadir 1 ml de TRIzol, y sellar los tubos con parafilm. Moler 1 min; toca los tubos boca abajo para sacar las bolas de acero si es necesario. Moler 1 min. </li><li> Nocentrifugar el tubo en este punto (el tubo será frágil). Transferir la mezcla (excepto las bolas de acero) en un nuevo microtubo de RNasa libre. Se precipitan los desechos celulares en una microcentrífuga de mesa a 4 º C durante 10 min a 12.000 x g. </li><li> Transferir el sobrenadante a un nuevo microtubo. Añadir 0,1 volúmenes de 1-bromo-3-cloropropano (BCP) y agitar vigorosamente durante 15 segundos. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Girar en una microcentrífuga a 4 ° C durante 15 min a 12.000 x g Nota: muchos protocolos de extracción de ARN utilizan cloroformo en esta etapa; BCP está destinado a maximizar el rendimiento de ARN mediante el aumento de la eficiencia de la separación de fases.. Mantener las muestras a 4 ° C durante la etapa de centrifugación también se incrementará la eficiencia de la separación de fases y reducir la contaminación de la proteína y el ADN genómico en la fase acuosa. </li><li> Se transfiere la capa acuosa superior a un nuevo microtubo. Precipitar el ARN mediante la adición de 0,5 volúmenes de isopropanol enfriado con hielo; invertido seis veces a millasx. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Girar en una microcentrífuga a 4 ° C durante 10 min a 12.000 x g. </li></ol> Nota: Además de recuperar el ARN, las proteínas también se puede extraer de la capa orgánica y la interfase de TRIzol, por lo tanto la proteómica y la transcriptómica análisis se puede realizar en las mismas muestras. A pesar de no haber realizado este paso en nuestro análisis, la extracción de TRIzol produce una representación excelente de proteínas solubles y una mayor representación de la membrana y las proteínas nucleares que la mayoría de buffer / detergente extracciones. Lee y 17 Lo describe un procedimiento para extraer proteínas usando TRIzol apropiada para el análisis de proteómica, incluyendo 2-D gel y LC-MS/MS. <ol start="6"><li> Eliminar el sobrenadante. Lavar el ARN mediante la adición de 1 ml de helado de etanol 70% (utilizar agua tratada con DEPC), y se mezcla con un vórtice corto. Girar en una microcentrífuga a 4 ° C durante 5 min a 12.000 x g. </li><li> Eliminar el sobrenadante. Aire seco el precipitado por unl menos 15 min. Añadir 80 l de DEPC-agua para el pellet de ARN y lo coloca a 55 º C durante 10 min. Agregar a 4 ° C durante la noche. </li><li> Determinar la concentración de ARN utilizando el espectrofotómetro NanoDrop. La relación de absorbancia a 260 nm/280 nm debe ser de entre 1,8 y 2,1, con 2,1 ser óptima. </li><li> Tomar 30 microgramos de ARN a granel, añadir 4 U de DNasa I, 60 U RNasin, 10 l tampón de reacción 10x, y agua tratada con DEPC para llevar el volumen total hasta 100 l. Incubar a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Purificar el ARN utilizando el kit RNeasy Mini. Siga las instrucciones del fabricante, con excepción de realizar todas las centrifugaciones durante 30 segundos e incluyen todos los pasos &quot;opcionales&quot;. </li><li> Determinar la concentración de ARN utilizando el NanoDrop, y evaluar la calidad del ARN utilizando el &quot;pico de ARN total&quot; ensayo sobre un Bioanalyzer. </li><li> Para la purificación de ARNm, transferir 30 Dynabeads mu l a un tubo de microcentrífuga de RNasa libre. </li><li> Colocar el tubo en un imán para 1-2 min y eliminar el sobrenadante. Resuspender las cuentas en15 l de tampón de unión. Repetir. </li><li> Comenzando con 5 g de ARN total, ajustar el volumen a 15 l usando agua DEPC. Se calienta a 65 ° C durante 2 min, y colocar en hielo. </li><li> Añadir 15 l de ARN total a los 15 mu l pre-lavadas cuentas. Mezclar bien pipeteando cada 5 min durante 30 min para recocer el ARN a las perlas. Colocar en el imán durante 1-2 min y retirar todo el sobrenadante. </li><li> Añadir 35 l de Tampón de Lavado B. Mix por pipeteado cuidadoso. Coloque el imán y retire con cuidado el sobrenadante. Repetir el lavado dos veces. </li><li> Eluir el ARNm mediante la adición de 15 l frío 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) y calentando a 80 ° C durante 2 min. Colocar inmediatamente el tubo en el imán, transferir el sobrenadante a un tubo libre de RNasa, y se congelan a -80 ° C. Cuantificar como en 3,8). Rendimiento debe ser ~ 1-5% del total de ARN. </li></ol> Para los análisis metabolómica, lleve a cabo los protocolos 1 y 2), y proceder a 4) a continuación: 4. Metanol-cloroformo extracción de los metabolitos Objetivo: Separar metabolitos polares y no polares. <ol><li> Añadir el antioxidante hidroxitolueno butilado (BHT) para el cloroformo a una concentración de 0,1 mg / ml para evitar la auto-oxidación de los lípidos durante la extracción. Utilice este BHT-cloroformo para todos los pasos posteriores. </li><li> Transferencia de 200 cabezas en frío, previamente pesado cónicos con tapa de rosca tubos de polipropileno, congelar a -80 ° C, y se liofiliza. Determinar el peso seco. </li><li> Coloque cuentas 5-7 circonio en los tubos y se homogeneiza en un talón-batidora durante dos ciclos de 20 segundos cada uno a 800 Hz. </li><li> Basado en el peso seco de la más pesada de la muestra, añadir agua, metanol, cloroformo y en las siguientes proporciones: 11,74 x metanol; 10,59 x agua; 11,74 x cloroformo, donde x es el peso más pesado de la muestra en gramos y el producto es el volumen en ml. Añadir todo el metanol como se calcula y 45% del total de agua en el tubo de batidor de bolas que contiene las cabezas liofilizadas. </li><li> Homogeneizaciónze en la perla-batidora durante dos ciclos más de 20 segundos cada uno. </li><li> Combinar los volúmenes de cloroformo (100%) y el resto del agua (55%) en un vial de vidrio cónico en hielo. A continuación, transferir la mezcla de tejido (con bolas) a la ampolla de cristal. Agitar durante 10 min. Incubar durante 10 min en hielo. </li><li> Girar en una centrífuga a 4 º C durante 5 min a 2.000 x g. Retire la polar (superior) de fase con una pipeta Pasteur (evitar los plásticos), y meterlo en un tubo de microcentrífuga segundo. </li><li> Guardar la no-polar (inferior) de fase en un vial de vidrio pequeño y se congelan a -80 ° C. Secar bajo una corriente de gas nitrógeno; asegurarse de que el tubo que va desde el tanque de nitrógeno es de gran pureza Tygon para evitar plastificantes en el extracto. </li><li> Rehidratar la fase no polar con cloroformo deuterado de 620 l. Transferir 600 l en tubos de RMN etiquetados. Almacenar en un a prueba de explosión -80 ° C congelador. </li><li> Coloque fase polar en el CentriVap y ejecutar hasta que el tubo esté completamente seca a 30 º C (~ 7 h). </li><li> Rehydrate la fase polar con 620 l 0,1 M de tampón fosfato de sodio (pH 7,3) en óxido de deuterio con 1 mM TMSP [3 - (trimetilsilil) propiónico-2 ,2,3,3-d4 ácido] como patrón interno. Vortex durante 30 segundos. Girar en una microcentrífuga a 4 ° C durante 5 min a 10.000 rpm para precipitar los pigmentos y otras moléculas grandes, que podrían interferir con los espectros de RMN. Transferir 600 l del sobrenadante a tubos de RMN etiquetados. </li></ol>

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses financieros.

Basándonos en nuestra experiencia previa en transcriptómica 11, 12, 15 metabolismo y las enfermedades neurodegenerativas 6, 8, presentamos aquí un nuevo protocolo para la recogida de miles de cabezas de moscas adultas con la expresión específica de genes patógenos, y purificar mRNA y los metabolitos de ARN- SEC y espectroscopía de RMN, respectivamente. La naturaleza de estos experimentos requiere la incorporación de una serie de innovaciones anteriores a la recogida mosca, incluyendo la selección de un ubicuo Gal4 línea y el uso de la regulación temporal de la expresión génica. En cuanto a la expresión de Gal4, ubicuo de los transgenes fue crucial por dos razones. En primer lugar, un gran número de genes implicados en enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la ATXN3, huntingtina, proteína precursora de amiloide, y la superóxido dismutasa 1, entre otros, son ampliamente expresado en las células neuronales y gliales, así como en otros tipos de células fuera del sistema nervioso. Quisimosmodelar correctamente este aspecto de la biología de estos genes patógenos mediante el análisis de las consecuencias de la expresión ubicua en lugar de centrarse únicamente en la expresión neural. En segundo lugar, no es posible recoger los cerebros de mosca en gran número, pero podemos hacerlo con cabezas de moscas (más de 200 por triplicado por condición) 11, 12. Dado que la homogeneización de cabezas enteras se mezcla tejidos neurales y no neurales, la expresión del transgen en todas partes se vuelve crítica para la obtención de RNA uniformes y metabolitos a partir de poblaciones de células que expresan los transgenes mismos. Es importante observar que da-Gal4 fue elegido por su distribución bastante uniforme no, debido a su alto nivel de expresión, aunque un informe reciente sugiere que da-Gal4 puede no ser totalmente ubicua 25. Nos habíamos considerado anteriormente otros ubicuos Gal4 líneas, incluyendo el brazo, Bañera, y Act-GA4, pero todos mostraron patrones complejos de expresión en el SNC adulto y los músculos, haciéndolos menos unadequate para este estudio. De hecho, la inmunofluorescencia en cerebros adultos mostró que da-Gal4 induce la expresión generalizada pero débil, que sólo acumulado a altos niveles en los centros del cerebro que comprenden de unos pocos miles de axones y en unos pocos grandes neuronas (Figura 2). Aunque los niveles de expresión de los constructos fueron bajos, estas condiciones reduce drásticamente la supervivencia de una manera dependiente de polyQ. Esta dinámica de la expresión cubrió nuestras necesidades, manteniendo bajos niveles de expresión, lo cual era importante para la observación de las alteraciones lentas y progresivas celulares inducidos por las proteínas neurotóxicas. Una consecuencia previsible de inducir la expresión ubicua de las proteínas neurotóxicas era que provocó letalidad antes de la eclosión de los adultos. Afortunadamente, esta complicación fue puenteado con el uso de GAL80 ts. Como se discutió anteriormente, la expresión génica alcanzado niveles máximos de aproximadamente 48 horas después del cambio de temperatura, que se ajusta bien con el tiempo frame del experimento. Una ventaja adicional del uso de GAL80 ts fue que, en contraste con los experimentos en los que las proteínas se expresan constitutivamente neurotóxicos pan-neuralmente, no había expresión durante el desarrollo del sistema nervioso. Así, el uso de GAL80 ts creado una &quot;limpia&quot; fondo donde el sistema nervioso no fue expuesto a las actividades tóxicas de estas proteínas neurotóxicas durante fases sensibles del desarrollo. En nuestra opinión, la activación de la expresión génica en adultos como resultado un modelo mejor para esta clase de patologías de inicio adulto. Sin embargo, GAL80 ts también presentó algunas complicaciones asociadas con los cambios de temperatura. Una era que las moscas de crecimiento a baja temperatura (18-20 ° C) con retraso del ciclo de vida, por lo que los experimentos significativamente más larga. Además, es bien sabido que las moscas en crecimiento a altas temperaturas (29-31 ° C) acelera su metabolismo, como se ilustra por la menor esperanza de vida en comparación con las moscas envejecidos a 25 ° C. Sina vez que los estudios de la transcripción y metabólico se realiza en las moscas envejecidas a temperatura elevada, se puede esperar para ver cambios importantes en vías de estrés celular y el metabolismo de la energía. Esto es por qué es tan importante para introducir dos controles para el experimento, uno de los no patógenos Atnx3-27Q y un control sin relación expresa LacZ. Estos controles se proporcionan una base para la expresión de genes y cambios metabólicos asociados a la temperatura elevada de manera que se pueden identificar esos cambios directamente vinculada a la expresión de Atxn3 tóxicos. En general, se han introducido varias modificaciones en la colección de moscas que proporcionan numerosas ventajas - y algunas desventajas (problemas con la temperatura y el párrafo siguiente) - para estudiar inicio adulto, enfermedades progresivas. Aunque la regulación temporal con GAL80 ts fue una adición útil, también introdujo una complicación inesperada. Mientras que la generación de las moscas que llevan tanto GAL80 ts unnd da-Gal4 construcciones en una población estable, notamos que vuela por partida doble homocigotos para ambas construcciones son viables pero estéril. Desde homocigotos GAL80 y cepas ts-da Gal4 fueron viables y fértiles, por sí mismas, no está claro por qué la combinación muestra baja fertilidad. Se ha sabido por algún tiempo que Gal4 es ligeramente tóxico para Drosophila tejidos 22. Es posible, entonces, que la expresión heteróloga de la levadura GAL80 represor transcripcional contribuido a la toxicidad de Gal4 al interferir, potencialmente, con la maquinaria transcripcional endógeno. Esta toxicidad puede ser exacerbada por la distribución ubicua de Gal4 bajo el control del da, un gen que juega un papel clave en el desarrollo temprano y determinación sexual. Independientemente de las causas subyacentes de la esterilidad, ampliamos la ts GAL80, da-Gal4 moscas mediante el mantenimiento de un cromosoma equilibrador sobre da-Gal4, manteniendo el homozygosity para GAL80 t s, lo que sugiere que Gal4 es un contribuidor más crítico para la esterilidad. Esta solución era clave porque se utilizó cientos de estos machos cada dos semanas para cruzar con cada uno de los transgenes UAS. Sin embargo, cruza la realización de un equilibrador creado un trabajo adicional durante la selección de la progenie apropiada. Sólo un cuarto (25%) de la progenie se recogió (hembras, no equilibrador), lo que añade tiempo de selección, reducido el rendimiento por botella, y aumentó el número de botellas necesarias para obtener al menos 200 moscas por genotipo / repetición / tiempo punto. En general, aunque la colección de moscas se convirtió en mucho tiempo debido a los grandes conjuntos necesarios, estamos seguros de que el estudio de los cambios celulares sólo unas pocas horas después de encender la expresión de genes patógenos ubicuamente identificará procesos novedosas e interesantes implicados en la pérdida neuronal progresiva. Una vez que el diseño genético estaba en su lugar, se prestó especial atención a lamanipulaciones experimentales que podrían introducir variabilidad biológica. En primer lugar, sólo se recogen las hembras vírgenes para garantizar la homogeneidad de las muestras, aunque esto significaba tirar machos y comprobación para la progenie de dos veces al día. Durante el envejecimiento, no más de 12 moscas se mantuvieron en el mismo vial para evitar el hacinamiento y estrés. También, antes de la congelación, las moscas se transfirieron a crioviales sin anestesia y se les permitió recuperarse de la transferencia durante 30 min. Estos factores aparentemente triviales pueden influir en la expresión génica y el metabolismo, la introducción de la variabilidad en el análisis final que no sería relevante para el experimento. Para garantizar la calidad de los materiales congelados (cabezas, ARN, y metabolitos), se prestó especial atención a cada detalle que puede contribuir a la degradación del tejido. Dado que las moscas se transfieren a crioviales en pequeñas cantidades (hasta 12 moscas por vial), teníamos que recuperar muchos frascos para la recogida de 200 cabezas. Estas manipulaciones eran duno con un cuidado extremo en una habitación fría con hielo seco y nitrógeno líquido. La colección de moscas, la separación de las cabezas, y la purificación de moléculas informativas consume demasiado tiempo para descubrir que el material se degradó al final de este largo proceso. Además de asegurar que el material mantiene su calidad, este protocolo se describen varios pasos que maximizan el rendimiento de ARN y metabolitos, incluyendo el secado por congelación y el golpeo de bolas. Estos pasos no son necesarios para las extracciones normal para RT-PCR o PCR cuantitativa a partir de moscas enteras, pero son críticos para la purificación consistente de muestras pequeñas tales como cabezas de moscas. Se determinó que otros pasos afectar el rendimiento de ARN. Por ejemplo, los mayores moscas producen RNA significativamente menos que los más jóvenes moscas, independientemente del genotipo. Esta observación sugiere que el envejecimiento a alta temperatura induce cambios dramáticos. Además, la extracción de RNA a partir de 100 cabezas era en realidad más eficiente que la de 200 cabezas, por lo que se procedió a purificar en dos batches de 100 por muestra, sólo para combinarlos después de la verificación de la calidad con el Bioanalyzer. Además, las columnas de purificación de ARNm parecía saturar fácilmente, por lo que la cantidad de RNA total utilizado por columna tiene que ser optimizado. Los metabolitos son una mezcla diversa de moléculas pequeñas, por lo que el control de calidad es más difícil que con el ADN, ARN o proteínas. Desafortunadamente, no existe un catálogo completo de metabolitos para cualquier modelo animal en ese momento, algo que podría cambiar en los próximos años gracias a la aplicación de algunas de las diversas innovaciones tecnológicas, como la espectroscopía de RMN y la ampliación del uso de la cromatografía líquida - espectrometría de masas ( LC-MS). Aunque la RMN es menos sensible que la MS, que muestra muchas ventajas prometedoras, incluyendo sin destrucción de las muestras, no hay procedimientos analíticos que introducen sesgo (LC), y alta reproducibilidad que permite la comparación estadística de repeticiones y de varias condiciones experimentales 24. Así, la muestra puede serensayarse para verificar las observaciones o re-analizaron por LC-MS para validar los datos de RMN. A continuación, mostramos los datos preliminares de RMN de moscas que estamos utilizando para compilar un catálogo de metabolitos en Drosophila. Esta información será fundamental para determinar cómo la expresión de los genes de patógenos altera el metabolismo normal, se abre una nueva ventana para promover la comprensión de los mecanismos celulares que subyacen a las enfermedades neurodegenerativas. Recientemente las nuevas tecnologías ómicas ofrecen la mejor oportunidad para estudiar las enfermedades neurodegenerativas en un nivel de detalle no alcanzado anteriormente. Tal vez el mayor obstáculo a superar en estos estudios de alto rendimiento es la colección de muestras reproducibles fieles que pueden ser analizados con métodos altamente sensibles. Los procedimientos presentados aquí proporcionan una manera de lograr esta coherencia, y dará lugar a resultados que pueden ser fácilmente comparados a través de conjuntos de datos. Aunque nuestros intereses de investigación principales involucrados que examinan los cambios del gen expressiones y metabolitos, las moscas generados también podría ser sometido a análisis proteómico o epigenómico. Cambios proteómicos y epigenómico que ocurren durante la neurodegeneración también es probable que sea de suma importancia para el proceso de la enfermedad. Cuando la comunidad científica en última instancia identifica el espectro completo de los cambios moleculares que afectan al proceso de la enfermedad, una comprensión de los sistemas cierto nivel de la enfermedad será posible. En este nivel, la modificación de la enfermedad terapias finalmente emerger como una realidad.

En el siglo pasado, Drosophila ha demostrado ser una herramienta muy valiosa para la investigación de laboratorio profundas cuestiones biológicas, sobre todo en el desarrollo, biología celular, genética, neurobiología y 1. Las razones para este éxito son que moscas de la fruta son fáciles de manipular, tiene una caja de herramientas en constante expansión 18, 21, 31, y poseen un genoma relativamente simple, con alta calidad de anotación 26. Estas ventajas técnicas, combinadas con el ingenio y la innovación constante en la comunidad mosca, han dado lugar a amplias aportaciones científicas, como lo demuestra la concesión de tres premios Nobel (1933, 1995, 2011). Más recientemente, Drosophila ha surgido como un modelo pertinente para el estudio de enfermedades humanas, trastornos del desarrollo, principalmente la inmunidad innata, cáncer, neurodegeneración y 2. Estamos particularmente interesados ​​en el descubrimiento de las bases celulares y moleculares de las enfermedades neurodegenerativas. Estos co compleja y diversanditions están vinculados a los ensamblados, oligómeros solubles, posiblemente de proteínas anormalmente plegadas y están, por lo tanto, fáciles de modelar en las moscas. Todas las principales enfermedades neurodegenerativas, como el Alzheimer, el Parkinson y la enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, ataxias varios tauopatías, enfermedades priónicas, y otros trastornos raros, se han modelado en las moscas en los últimos quince años 23. Fly laboratorios han contribuido a la comprensión de estas enfermedades, principalmente mediante la explotación de las proezas de Drosophila genética para identificar nuevos genes implicados en la neurotoxicidad de las proteínas patógenas. Una vez que los nuevos genes pertinentes a la cascada neurotóxico se identifican, sus efectos se analizan típicamente por métodos tradicionales, incluyendo la histología para determinar los patrones de degeneración, inmunofluorescencia para determinar la distribución de proteínas y patología celular, y los análisis bioquímicos para evaluar la cantidad y el tipo de conformaciones de proteínas anormales . Por último, comportamientoanálisis conductual sirve como una lectura funcional de resultados de la enfermedad. Estas técnicas bien establecidas han sido explotados para examinar la contribución de uno o unos pocos genes candidatos para el proceso de la enfermedad, como el estrés oxidativo y la disfunción mitocondrial 13, disregulación transcripcional 9, 27, 30, transporte axonal anormal y la actividad sináptica 14 de ARN anormal biología 9, dysregulated señalización celular 29, dyshomeostasis ER 6, obstaculizado proteostasis celular 33, 23 y muchos otros. Sin embargo, no está claro cómo estas proteínas tóxicas pueden interferir simultáneamente con múltiples vías interconectadas, lo que es la secuencia temporal de estas alteraciones, y lo que es la contribución relativa de cada vía a la patogénesis. Décadas de investigación se centró en un solo gen, la hipótesis de enfoques basados ​​en los seres humanos y modelos animales han dado lugar a una imagen incompleta, de desconcierto de los mecanismos celulares que causanneurodegeneración. La comprensión actual de los pobres mecanismos exactos por los que estos conjuntos de proteínas tóxicas causan neuropatología es una limitación clave para el desarrollo de las terapias modificadoras de la enfermedad. Ahora estamos interesados ​​en la aplicación de nuevos enfoques para la comprensión de cómo estas proteínas patógenas inducen perturbaciones globales celulares. El advenimiento de la era ómicas permite que el sondeo profundo de los complejos problemas biológicos usando sofisticadas tecnologías de alto rendimiento, que pueden conducir a tratamientos eficaces que en un futuro próximo. La expresión de genes (transcriptómica) estudios se establecieron después de la terminación de las secuencias del genoma múltiples puesto de alta calidad anotación puede predecir la mayoría de las transcripciones. La reciente aplicación de secuenciación de próxima generación para el análisis de transcripción (RNA-seq) ha proporcionado nuevas ventajas y oportunidades en comparación con los microarrays, incluyendo un enfoque imparcial, un mejor alcance cuantitativo y costo reducido 32.Queremos explotar las ventajas de RNA-seq para comprender mejor la forma más común de herencia dominante ataxia, ataxia espinocerebelosa tipo 3 (SCA3) o enfermedad de Machado-Joseph. SCA3 es una enfermedad monogénica, dominante con penetrancia completa, causada por una expansión CAG trinucleótido en el gen Ataxin3 (ATXN3) 16. Esta mutación da lugar a la producción de proteína con un Atxn3 largo poliglutamina (polyQ) pista que lo hace propenso a la agregación. Desde mutante Atxn3 es el agente neurotóxico en responsable de todas las perturbaciones relacionadas con la enfermedad SCA3, esta es una enfermedad ideal para la aplicación de estos enfoques ómicas nuevos. Además, SCA3 fue una de las primeras enfermedades neurodegenerativas modelados en moscas 34. Al poner en marcha los procedimientos para recoger un gran número de cabezas de moscas de RNA-seq, nos dimos cuenta de que podíamos usar el mismo material para la realización de los estudios mundiales de otras moléculas informativas. Entre Discip otras economías emergenteslíneas, la proteómica, la metabolómica epigenómica y permitir el examen de la patología celular, a una profundidad que antes no alcanzados, aunque no sin dificultades. A diferencia de los ARNm, el catálogo de proteínas y metabolitos es bastante incompleta en este momento debido a la mayor dificultad en la predicción de todas las posibles variantes de empalme y el origen aún más enigmático de todos los metabolitos normal y patógena. Grandes esfuerzos se están realizando para catalogar las proteínas en muchos organismos y en condiciones de enfermedad. Para ello, hemos querido centrarse en la contribución de los metabolitos alterados para SCA3 patogénesis usando un simple organismo, tales como Drosophila. Este es un campo relativamente nuevo y prometedor, en particular con la reciente introducción de la resonancia magnética nuclear (RMN), que proporciona una alta reproducibilidad y no destruye las muestras 5, 24. Proponemos que el metabolito de perfiles pueden contribuir a la identificación de biomarcadores y mecanismos implicados en la enfermedad neurodegeneratisobre. Una consideración importante con estos proyectos ómicas es que requieren muestras grandes y uniformes (200 cabezas de mosca) así como las técnicas de purificación precisas para minimizar la variación experimental. Empezamos a recoger las moscas siguiendo los procedimientos que habían usado previamente para microarrays y también utilizado recientemente para RNA-seq 12. Pero pronto se encontró con una serie de problemas relacionados con los misexpressing SCA3 construcciones. En primer lugar, tuvimos que seleccionar un controlador de Gal4 para estos 4 experimentos, donde el tejido diana para el análisis fue el cerebro. La opción obvia sería un conductor pan-neuronal desde SCA3 es una enfermedad cerebral. Sin embargo, ya tenemos la intención de recoger mRNA y los metabolitos de las cabezas enteras, esta opción podría producir material mezclado de los tejidos que expresan y no expresar-las construcciones. Para generar muestras homogéneas donde todas las células expresan las construcciones, se decidió utilizar una línea de conductor, pero débil en todas partes, daughterless (da)-Gal4. Intereshormigueo, muchos de los genes implicados en las enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la ATXN3 20, tienen una amplia distribución, por lo que la elección de la expresión ubicua apropiado. Entonces, nos encontramos con un segundo problema: la expresión ubicua de patógenos Atxn3-78Q provocado muerte durante el desarrollo. Para pasar por alto esta letalidad, incorporamos GAL80 ts para controlar la activación temporal de Gal4 19. Esto nos permitió recoger las moscas experimentales, la edad durante un máximo de 20 días, congelar y procesar sus cabezas liofilizados, ya sea ARN (TRIzol) o metabolito (metanol-cloroformo) extracción (Figura 1). Ya hemos usado este protocolo para la obtención de muestras para análisis transcriptomic y metabolómica, pero hay otras aplicaciones obvias para esta técnica (por ejemplo, proteómica o análisis peptidomic neuro-). Experimental visión general: El objetivo general de estos protocolos es apoyar la recogida de consimuestras de stent de cabezas de moscas para la extracción de las transcripciones y metabolitos. La meta específica de estos procedimientos es la adquisición de las moscas que expresan Atxn3-27Q y 78Q Atxn3-(no patógenas y patógenas de las construcciones experimentales), así como LacZ (control constructo), donde una sola muestra se compone de 200 cabezas de moscas. Aunque la tecnología actual permite el análisis de muestras muy pequeñas, como las células individuales 28, se combinaron 200 cabezas para eliminar la variación experimental, biológicos y técnicos, lo que nos permite identificar los cambios celulares asociados con el proceso de la enfermedad con alta confianza estadística. Este enfoque está diseñado para detectar sólo los cambios en la expresión de genes que son consistentes en la población, dirigiéndonos hacia las vías más críticos que impulsan la degeneración. Dado que estamos interesados ​​en dependientes de la edad cambios en las cabezas de estas moscas, cada genotipo se obtuvo a 1, 10, y 20 días de edad. Un aspecto fundamental de estosanálisis globales es la producción de réplicas biológicas que el apoyo de un análisis estadístico robusto. Nuestra experiencia anterior con micromatrices y ARN SEQ-sugiere que el análisis de muestras biológicas en triplicado proporcionar fuerte significación estadística de los datos 11, 12. Se describe en la sección 1) cómo generar un solo replicar biológica (Rep 1) para cada punto genotipo y el tiempo. Estos procedimientos pueden repetirse para generar Reps 2 y 3, o realizarse en paralelo, siempre y cuando cada Rep está debidamente identificado. Aunque tres Reps es el objetivo, el establecimiento de un cuarto (o quinto) Rep es muy recomendable para tratar cuestiones relacionadas con el bajo rendimiento, pérdida de moscas durante el envejecimiento o la pérdida accidental de material (moscas, cabezas, o ARN) en uno o más muestras. Se encontró que diez cruces (botellas identificadas por letras AJ) producido progenie suficiente para obtener 200 cabezas / genotipo / hora punta. El cuidado extremo debe ser aplicado para evitar la confusión, ya que un gran número de botellasre necesario para obtener un Rep (10 botellas x 3 x 3 genotipos puntos de tiempo = 90 botellas). Para ello, hemos designado cada botella con el genotipo, punto en el tiempo, y la letra de la botella. Por ejemplo, SCA3-27Q 20E se refiere a la quinta botella (de diez) de las moscas que expresan Atxn3-27Q envejecido durante 20 días. Una vez que el eclose progenie, las moscas se mantuvieron en viales separados marcados con el identificador único. Hemos mantenido el número de moscas obtenidos para cada muestra, botella, y el punto de recogida (mañana y tarde) en una hoja de cálculo Excel. Hemos revisado el número de moscas por vial antes de congelar para tener en cuenta la letalidad y fugitivos. De esos recuentos finales, los viales añadiendo 200 moscas pueden ser fácilmente localizado antes de abrir el congelador, contribuyendo así a la conservación de las muestras. Puesto que las moscas recogidas de una botella sólo se puede utilizar en una Rep, que maximiza su contribución por réplica biológica, aunque todos los representantes contenida moscas de múltiples botellas. Nos reservamoslas moscas de las botellas no utilizados en su Rep programado para Reps otros, como muestras de recambio, o para otros experimentos relacionados (western blot, qPCR).

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Cat. Número </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Jazz mezcla Drosophila alimentos </td><td> Fisher Scientific </td><td> TAL-153 </td><td></td></tr><tr><td> Viales criogénicos </td><td> Corning, Inc. </td><td> 430658 </td><td></td></tr><tr><td> Microtubos </td><td> Axygen </td><td> MCT-175-CS </td><td></td></tr><tr><td> RNaseZap </td><td> Ambion </td><td> AM9786 </td><td> Trate todas las superficies </td></tr><tr><td> 5/32 &quot;bolas de molienda, acero inoxidable </td><td> OPS Diagnóstico </td><td> GSS 156-5000-01 </td><td></td></tr><tr><td> TRIzol </td><td> Ambion </td><td> 15596018 </td><td></td></tr><tr><td> 1-bromo-3-cloropropano </td><td> Sigma </td><td> B9673-200ML </td><td></td></tr><tr><td> Isopropanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A416-500 </td><td></td></tr><tr><td> Agua tratada con DEPC </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP561-1 </td><td></td></tr><tr><td> DNasa I </td><td> Promega </td><td> M6101 </td><td></td></tr><tr><td> Inhibidor de ribonucleasa RNasin </td><td> Promega </td><td> N2111 </td><td></td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> ARNm Dynabeads purificación kit </td><td> Invitrogen </td><td> 610-06 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos cónicos con cierre de rosca </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-344 </td><td></td></tr><tr><td> Screw Caps w / O-Rings </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-364 </td><td></td></tr><tr><td> 2,0 mm Zirconia cuentas </td><td> BioSpec Productos </td><td> 11079124zx </td><td></td></tr><tr><td> Methanol, grado HPLC </td><td> Fisher Scientific </td><td> A4524 </td><td></td></tr><tr><td> Cloroformo, grado HPLC </td><td> Acros Organics </td><td> AC39076 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Las acciones de Drosophila </td></tr><tr><td> da-Gal4 </td><td> Bloomington Stock Center </td><td> 5460 </td><td></td></tr><tr><td> GAL80 [ts] </td><td> Bloomington Stock Center </td><td> 7108 </td><td></td></tr><tr><td> UAS-MJD-27Q </td><td> Bloomington Stock Center </td><td> 8149 </td><td></td></tr><tr><td> UAS-MJD-78Q </td><td> Bloomington Stock Center </td><td> 8150 </td><td></td></tr><tr><td> UAS-lacZ </td><td> Bloomington Stock Center </td><td> 8529 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipo </td></tr><tr><td> Inyectar + Matic Durmiente </td><td> INJECT + MATIC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microsieve Set </td><td> Fisher Scientific </td><td> 3410531 </td><td> Use dos grandes mallas </td></tr><tr><td> Geno / Grinder 2000 </td><td> SPEX Sample Prep </td><td> SP2100-115 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrífuga Sorvall Legend </td><td> ThermoScientific </td><td> 75002436 </td><td></td></tr><tr><td> FreeZone Plus Cascade 2,5 L Sistema Freeze Dry </td><td> Labconco </td><td> 7670041 </td><td></td></tr><tr><td> Bioanalyzer v 2.6 </td><td> Agilent </td><td> 2100 </td><td></td></tr><tr><td> Dynamag-2 Imán </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td></td></tr><tr><td> Espectrofotómetro NanoDrop </td><td> ThermoScientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fast Prep bead-beater </td><td> ThermoScientific </td><td> FP120 </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> CentriVap Vacufuge Plus </td><td> Labconco </td><td> 022820001 </td><td></td></tr></tbody></table>

purificación de las transcripciones y los metabolitos de<em&gt; drosophila</em&gt; cabezales

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

Durante la última década, hemos tratado de comprender los mecanismos moleculares y celulares de la degeneración neuronal utilizando Drosophila como organismo modelo. A pesar de moscas de la fruta proporcionan ventajas obvias de experimentación, la investigación sobre las enfermedades neurodegenerativas ha dependido en gran medida las técnicas tradicionales, incluyendo la interacción genética, histología, inmunofluorescencia, y la bioquímica de proteínas. Estas técnicas son efectivas para mecanicista, los estudios basados ​​en hipótesis, que conducen a una comprensión detallada de la función de genes individuales en problemas bien definidos biológicos. Sin embargo, las enfermedades neurodegenerativas son muy complejas y afectan a múltiples orgánulos celulares y procesos en el tiempo. El advenimiento de las nuevas tecnologías y la edad ómicas ofrece una oportunidad única para comprender las perturbaciones globales celulares que subyacen a las enfermedades complejas. Organismos flexibles modelo como Drosophila son ideales para la adaptación de las nuevas tecnologías debido a su fuerte annotción y trazabilidad de altura. Uno de los problemas con estos pequeños animales, sin embargo, es la purificación de suficientes moléculas informativas (ADN, ARNm, proteínas, metabolitos) de tejidos altamente relevantes, tales como los cerebros de ventanas. Otros retos consisten en reunir un gran número de moscas para la replica experimental (crítico de robustez estadística) y la elaboración de procedimientos uniformes para la purificación de material de alta calidad biológica. A continuación, se describen los procedimientos para recoger miles de cabezas de moscas y la extracción de las transcripciones y los metabolitos de entender cómo los cambios globales en la expresión génica y el metabolismo contribuyen a las enfermedades neurodegenerativas. Estos procedimientos son fácilmente escalable y puede ser aplicado al estudio de las contribuciones proteómicos y epigenómicas a la enfermedad.

Para omitir la letalidad inducida por la expresión ubicua de Atxn3 expandido bajo el control de da-Gal4, se introdujo regulación temporal de Gal4 con GAL80 ts. Pero antes de proceder a la recogida y la congelación de grandes cantidades de moscas, hemos querido determinar la dinámica de expresión de nuestro transgén bajo el control de GAL80 ts y da Gal4-. Para ello, hemos generado las cruces, salió de la progenie a 18 ° C, se recogió las moscas adultas, y las mantuvo durante 24 horas a 18 ° C. A continuación, se colocaron las moscas a la temperatura restrictiva (29 º C) y se incubaron ellos por 0, 6, 12, 24, 36, 48, y 72 hr. A continuación, se detectó la acumulación del alelo polyQ ampliado por Western blot de las moscas individuales siguiendo protocolos publicados 10. La expresión se detectó por primera vez, pero débil 6 horas después del cambio de temperatura y siguió aumentando hasta las 48 horas, cuando llegó a los niveles de saturación (Figura 2A). Intereshormigueo, una banda de alto peso molecular de polyQ insoluble apareció después de 48 hr, señalando el tiempo que tarda la proteína para formar grandes agregados. También disecaron los cerebros de ventanas en cada punto de tiempo para determinar la distribución del alelo expandido polyQ por inmunofluorescencia (Figura 2B). La proteína se detectó por primera vez 24 horas después del cambio de temperatura, aunque con una distribución desigual. Entre el 24 y 48 horas los niveles de proteína seguido aumentando, lo que hace el cerebro de varios centros claramente visibles, incluyendo los lóbulos antenales y las proyecciones del cuerpo de setas (Figura 2B). Entre 48 y 72 horas la expresión del alelo expandido polyQ alcanzado niveles máximos, lo que sugiere que el sistema Gal4 se activó completamente en este momento. Basándose en estos resultados, se seleccionaron 24 horas después de la elevación de la temperatura como el primer punto de tiempo (día 1) para experimentos posteriores. Las colecciones de las moscas de 10 y 20 días de edad también se midieron a partir del cambio de temperatura (time 0), que es el tiempo cuando el experimento se inicia con la nueva expresión de los transgenes patógenas y control. Una vez que se verificó que Atxn3 se detectó después de 24 hr bajo el control de GAL80 ts y da Gal4-a 29 ° C, nos preguntamos si estas moscas se muestran signos de neurodegeneración durante 20 días. Estas moscas comenzar expresando las proteínas patógenas como adultos, nos temíamos que podría necesitar un largo tiempo de incubación para mostrar fenotipos neurodegenerativas. Para determinar la toxicidad de Atxn3-78Q en estas condiciones, se recogieron las moscas que expresan LacZ, Atxn3-27Q y 78Q Atxn3, y grabaron su longevidad. Considerando que las moscas que expresan LacZ y Atxn3-27Q muestran más del 90% de viabilidad después de 20 días, las moscas que expresan Atxn3-78Q mostró una baja supervivencia en el día 20 (30%) (Figura 3). De hecho, Atxn3-78Q moscas empezaron a morir por día 10 (7% de mortalidad) y por día 15 la pérdida fue significativa (20%), que se aceleró en los últimos cinco days. Así, estos resultados indicaron que la expresión de un gen adulto patógena resultó en menor esperanza de vida, una señal clave de los fenotipos neurodegenerativos inducidos por Atxn3-78Q. Uno de los aspectos más críticos de este protocolo era la manipulación y la conservación de muestras después de la congelación para asegurar la calidad del material extraído. Se extrajeron entre 15-80 g de ARN total por cada 200 cabezas (dependiendo de la edad y el genotipo) antes del tratamiento con DNasa según NanoDrop. Aproximadamente un tercio (6-25 g) se recuperó como ARN altamente puro después del tratamiento con DNasa por la relación de absorbancia a 260 nm/280 nm. Sin embargo, hemos encontrado que la mejor manera de determinar la calidad del ARN para la preparación de bibliotecas de ADNc para RNA-seq fue analizar el ARN total en el Bioanalyzer. Afortunadamente, sólo una pequeña cantidad de ARN (5 ng) se utilizó en el Bioanalyzer, por lo que no tuvo impacto en la capacidad de producir varias bibliotecas por muestra. A modo de ejemplo, nos encontramos con dos muestras del totalARN antes del tratamiento con DNasa en un chip Bioanalyzer, uno de ellos sospechosos de ser degradado (Figura 4A-C). La alta calidad del ARN (muestra 1) produjo tres afilados bandas de ARN, dos justo por debajo de 2.000 nucleótidos (nt) de tamaño y una banda más pequeña por debajo de 200 nt, que representan los ARN ribosómicos (Figura 4A). Las dos bandas de alrededor de 2.000 nt corresponden al rRNA 18S (pico más pequeño) y dos fragmentos de la rRNA 28S (pico más grande), que es un aspecto único de rRNA biología en Drosophila (véase la figura 4B). Estas cualidades también se observaron en las trazas Bioanalyzer (Figura 4B). En contraste, una muestra de ARN degradado (muestra 2) no produjo los picos agudos de los ARN ribosómicos, y acumulado múltiples bandas de menos de 500 nt (Figura 4A). Esta distribución de tamaño se distinguía fácilmente en las huellas Bioanalyzer (Figura 4C), en el que picos anchos de menor tamaño se observó. También es importante destacar wcomo la diferencia en las unidades del eje Y entre las dos muestras de ARN, lo que demuestra que la muestra tenía menos ARN degradado. Sólo ARN mostrando la máxima calidad (relación NanoDrop de absorbancia a 260 nm/280 nm entre 1,8 y 2,1, con 2,1 es óptimo, véase el paso protocolo 3,8) se utilizan para la generación de bibliotecas. Para la extracción de metabolitos, hemos seguido un clásico agua / metanol / cloroformo (2.0:2.0:1.8) procedimiento de extracción 3 se dividió en dos pasos para maximizar la extracción de metabolitos, tanto polares como no polares-35. Después de separar las fases polares y no polares, que les reconstituye en agua deuterada o cloroformo deuterado, respectivamente, y se añadieron estándares internos para el análisis por RMN. Los espectros de RMN obtenidos utilizando este método de extracción se resolvieron bien con líneas de base plana y líneas estrechas (Figura 5), lo que indica la purificación de extractos de alta calidad, adecuada para un perfil metabólico tantod la identificación de un gran número de metabolitos. Figura 5 muestra la identificación de algunos picos prominentes correspondientes a los metabolitos altamente abundantes, tales como glucosa y sacarosa, y dos ácidos metabólicos clave, lactato y acetato, de acuerdo con los desplazamientos químicos en la literatura 7. El desplazamiento químico (en partes por millón) representa el blindaje electromagnético de una molécula con respecto a una molécula estándar (TMS, primer pico de la derecha). Más shieldedmolecules tienen una mayor densidad de electrones alrededor del núcleo y aparecerá a la derecha del espectro, incluyendo alquilos. Deshielded moléculas tales como amida y hidrógenos aromáticos aparecerá a la izquierda del espectro. La sección central ocupado (ppm 3-4) está enriquecida en moléculas de azúcar. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50245/50245fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50245/50245fig1.jpg" /> <strong&gt; Figura 1. Flujo de trabajo experimental. Primero, establecemos cruces para colectar las moscas de los genotipos deseados (fila superior). Entonces, cambiamos vírgenes a 29 ° C para activar la expresión de genes, la edad de los 1, 10, y 20 días, y el flash-congelar (segunda fila). Estamos próximos a recoger cabezas congeladas utilizando un microsieve (tercera fila). Las cabezas son liofilizadas, base, y tratado para la extracción de RNA (cuarta fila) o metabolitos (fila inferior). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50245/50245fig2.jpg" /> Figura 2. Cinética de expresión (A) Western blot que muestra Atxn3-78Q expresión (GAL80 ts; da-GAL4 / UAS-Atxn3-78Q). En moscas incubadas a 29 ° C de 0 a 72 h. Una banda débil se detecta por primera vez a las 6 h y la saturación se alcanza por 48 hr después de la inducción. (B) Inmunofluorescencia de cerebros enteros en las mismas moscas. Los cerebros se disecaron, se fijaron, unad tiñeron con un anticuerpo que reconoce la proteína polyQ ampliado. La proteína se detectó por primera vez en las setas corporales (MB) proyecciones y los lóbulos antenales (AL). Entre 48 y 72 horas, la expresión alcanza niveles máximos y es muy visible en los centros cerebrales con inervación abundante. El nivel de expresión por neurona es débil como se ve en el lóbulo óptico (OL), excepto en unas pocas neuronas de gran tamaño entre el OC y el cerebro central. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50245/50245fig3.jpg" /> Figura 3. Atxn3-78Q reduce la vida útil de las moscas que expresan LacZ, Atxn3-27Q y 78Q-Atxn3 doquier en etapas adultas (GAL80 ts, da-Gal4). Fueron controlados por su longevidad en 29 ° C. Las moscas que expresan LacZ (azul) y Atxn3-27Q (verde) mostraron niveles bajos de mortalidad durante el día 20. Por el contrario, las moscas que expresan Atxn3-78Q (rojo) que se muestrauna mortalidad pronunciada a partir de 10 días. Para el día 15 mostraron una reducción del 20% en la viabilidad, que se aceleró en los próximos cinco días, alcanzando una mortalidad del 70% en el día 20. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50245/50245fig4.jpg" /> Figura 4. Evaluación de la calidad del ARN. ARN de alta calidad y muestras degradadas se ha ejecutado en un chip Bioanalyzer. (A) Bioanalyzer funcionar con una alta calidad de ARN (muestra 1) y un ARN degradado (muestra 2) junto a un marcador de tamaño (carril izquierdo). Tenga en cuenta los tres picos afilados correspondientes al ARN ribosomal en el carril central. (B) Bioanalyzer rastreo para la muestra 1, con dos picos característicos fuertes justo por debajo de 2.000 nt y otro por debajo de 200. (C) Bioanalyzer rastreo para la muestra 2, que consiste de ARN principalmente degradados. Tenga en cuenta la diferencia en unidades en el eje Y entre los paneles B y C. Figura 5. Los espectros de RMN 1D Representante de metabolitos polares. Protón Representante 1D espectro de RMN de metabolitos polares de Drosophila y complementarias 2D COSY (espectroscopía de correlación) y HSQC (correlación heteronuclear solo quantum) en ensayos con asignación máxima. Metabolitos identificados de acuerdo con químico conocido turnos-1: Sacarosa; 2: Glucosa; 3: Beta-alanina; 4: Acetato; 5: Lactato.

Se describen aquí los procedimientos para la extracción y purificación de ARNm y metabolitos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Cabezas. Estamos aplicando estas técnicas para entender mejor las perturbaciones celulares subyacentes a la degeneración neuronal. Estas metodologías se puede escalar fácilmente y adaptarse a otros &quot;ómicas&quot; proyectos.

Purificación de las transcripciones y los metabolitos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Cabezales

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

El objetivo de este procedimiento es obtener transcritos y metabolitos de cabezas de Drosophila con calidad y cantidad suficientes para realizar estudios de alto rendimiento consistentes. Esto se logra primero generando y congelando rápidamente moscas del genotipo y edad adecuados por triplicado. A continuación, se prepara el tejido para la extracción separando las cabezas de las moscas de los cuerpos, manteniendo el tejido congelado.Luego, las cabezas se liofilizan. Finalmente, el tejido se trata con triol o cloroformo para extraer transcritos o metabolitos, respectivamente. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran que se puede obtener ARN y metabolitos de alta calidad mediante análisis con bioanalizador y RMN.Respectivamente, aunque este método puede proporcionar información sobre la base celular de la neurodegeneración progresiva, también puede aplicarse a otras enfermedades como el cáncer, el envejecimiento y los trastornos mediados por estrés. Para comenzar, realice cruces combinando 10 hembras vírgenes que porten un transgén de interés bajo el control de UAS y cinco machos con sensibilidad térmica a gal y waterless. Incube cuatro machos en frascos grandes.Etiquete los frascos y colóquelos a 25 grados Celsius. Después de dos días, retire a los adultos de los frascos y coloque los frascos a 18 grados Celsius. Cuando los ELOs progenie recojan vírgenes, colóquelos en pequeños viales de alimento para moscas, etiquete los viales y colóquelos a 18 grados Celsius durante 24 horas. Después de 24 horas a 18 grados Celsius, transfiera los viales a 29 grados Celsius.Transfiera las moscas a viales limpios cada dos días hasta que alcancen los días 10 y 20. Cuando las moscas alcancen la edad deseada, cuéntelas y utilice un embudo pequeño para transferirlas a viales criogénicos previamente etiquetados. Invierta los viales sobre la bancada y espere 30 minutos.Luego, enfríe rápidamente. Congele los viales sumergiéndolos en nitrógeno líquido y almacénelos en una caja de congelador pre etiquetada y previamente enfriada. Para recolectar cabezas de moscas, arme el tamiz y enfríelo previamente a menos 80 grados Celsius durante al menos 30 minutos.Enfríe una pieza de paraformo de nueve por 14 centímetros en hielo seco durante cinco minutos. Vacíe los viales criogénicos sobre el paraformo de a pocos a la vez. Utilice un pincel para contar las moscas y guárdelas en otro vial criogénico sobre hielo seco hasta acumular 100 moscas.A continuación, sumerja el tamiz en nitrógeno líquido y luego agregue las 100 moscas a la cámara superior y agite vigorosamente el tamiz durante un minuto. Sumerja nuevamente en el nitrógeno líquido y agite durante un minuto adicional. Abra el tamiz.Recolecte las cabezas de la cámara inferior en un tubo micro, y colóquelo a menos 80 grados Celsius hasta que todas las muestras estén listas para ser liofilizadas. Abra los tubos micro, envuelva las tapas con película de parafina y haga pequeños orificios. Coloque las muestras en el liofilizador durante un mínimo de dos días para extraer el ARN.Retire las muestras del liofilizador y agregue tres pequeñas bolas de acero estériles a cada tubo micro. Coloque en el molinillo de tejidos y opere a 1.500 golpes por minuto. Durante un minuto, agregue un mililitro de triazol y use paraformo para sellar los tubos; muela durante un minuto, golpee los tubos boca abajo para desprender las bolas de acero si es necesario, y muela durante un minuto adicional.Pipetee la mezcla en un nuevo tubo microfuger libre de ARN. Pelote los restos celulares en una microcentrífuga de mesa a 12.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Después de transferir el sobrenadante S a un nuevo tubo microfuger, agregue 0,1 volúmenes de bromocloropropano uno tres y agite vigorosamente durante 15 segundos.Incubar a temperatura ambiente durante tres minutos, luego centrifugar a 12.000 ×g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius; transferir la capa acuosa superior a un nuevo tubo micro. Precipitar el ARN añadiendo 0,5 volúmenes de isopropanol frío con hielo e invertir seis veces para mezclar. Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego centrifugar tras eliminar el sobrenadante S.Lave el ARN añadiendo un mililitro de etanol al 70 % frío con hielo y vortexe brevemente. Antes de centrifugar, retire el sobrenadante y seque el precipitado al aire durante al menos 15 minutos. Añada 80 microlitros de agua DEPC y coloque a 55 grados Celsius durante 10 minutos.Luego, almacénelo durante la noche a cuatro grados Celsius al día siguiente. Determine la concentración de ARN después de purificar 30 microgramos de ARN total según el protocolo descrito en el texto y determinar la concentración; utilice el ensayo PICO de ARN total en un bioanalizador para evaluar la calidad del ARN para la purificación de MNA. Coloque un tubo microfugable libre de ARNas que contenga 30 microlitros de perlas Dyna en un imán durante uno o dos minutos y retire el sobrenadante.Re-suspender las perlas en 15 microlitros de tampón de unión. Incubar el tubo en el imán y eliminar el tampón tras usar agua DEPC para ajustar el volumen de cinco microgramos de ARN total a 15 microlitros. Calentar el ARN a 65 grados C durante dos minutos y colocar en hielo.Añada 15 microlitros de ARN total a los 15 microlitros de perlas previamente lavadas e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Coloque en el imán durante uno o dos minutos y retire el sobrenadante. Una vez que el ARN haya sido lavado tres veces con 35 microlitros de tampón de lavado B y se haya eliminado el último lavado, eluya el ARN.M agregando 15 microlitros de tris clorhidrato frío 10 milimolar y calentando la muestra a 80 grados Celsius durante dos minutos.Transfiera inmediatamente el sobrenadante S a un tubo libre de RNasas y congele a menos 80 grados Celsius. El rendimiento debe ser de aproximadamente del 1 al 5 % del ARN total para realizar la extracción con metilcloroformo. Comience añadiendo butilhidroxitolueno al cloroformo hasta una concentración de 0,1 miligramo por mililitro.Transfiera 200 cabezas a tubos cónicos de polipropileno con tapón de rosca previamente pesados y enfriados, congele a menos 80 grados Celsius y liofilice tras determinar el peso seco; agregue cinco a siete cuentas de circonia y homogenice mediante un agitador de cuentas durante dos ciclos de 20 segundos a 800 hercios. Utilizando el peso seco, calcule el agua, el metanol y el cloroformo que deben añadirse en las siguientes proporciones, donde X es el peso de la muestra más pesada en gramos y el producto es el volumen de cada líquido en mililitros que se agregará al tubo que contiene las cabezas liofilizadas. Añada todo el metanol calculado y el 45 % del agua total; tras homogenizar la muestra en el agitador de cuentas durante dos ciclos adicionales de 20 segundos cada uno, agregue todo el cloroformo y el agua restante a un vial cónico de vidrio sobre hielo.Transfiera la mezcla de perlas al vial de vidrio y agite durante 10 minutos, luego incube durante 10 minutos en hielo. A continuación, centrifugue durante cinco minutos a 2000 ×g y 4 °C. Utilice una pipeta Pasteur para retirar la fase polar superior y colóquela en un segundo tubo micro. Después de congelar la fase no polar inferior en un vial de vidrio pequeño a −80 °C, séquela bajo un flujo de gas nitrógeno.Añada 620 microlitros de cloroformo desactivado para rehidratar la fase no polar. Transfiera 600 microlitros a tubos de RMN etiquetados y coloque la polifase en la Sentri VA a 30 grados Celsius. Ejecute la Sentri VA hasta que el tubo esté completamente seco, aproximadamente siete horas.Rehidrate la polifase con 620 microlitros de tampón de fosfato de sodio 0,1 molar en óxido de deuterio con un milimolar de TMSP como estándar interno y vortexee durante 30 segundos. Tras una centrifugación a 10.000 RPM y cuatro grados Celsius durante cinco minutos, transfiera 600 microlitros del SUPINATO a tubos de RMN para determinar la dinámica de expresión de los expandidos en los ataques en el gen tres trench bajo el control de GAL A TTS. Se realizaron cuatro blot de Western a partir de diferentes puntos temporales a la temperatura restrictiva y, como se muestra aquí, la expresión fue débil a las seis horas y continuó aumentando hasta las 48 horas, momento en el que alcanzó niveles saturados.La proteína también se detectó mediante inmunofluorescencia en cerebros de moscas disecados primero a las 24 horas y luego alcanzando niveles máximos entre las 48 y 72 horas tras el cambio de temperatura. Para determinar la toxicidad de ATIN 3 78 Q, recolectamos moscas que expresaban LAX Z aax en 3 27 Q y AAX en 3 78 Q y registramos su longevidad. Mientras que las moscas que expresaban lack Z y ATEX en 3 27 Q mostraron una viabilidad superior al 90 % tras 20 días, las moscas que expresaban atex en 3 78 Q presentaron una baja supervivencia al día 20. En este ejemplo, dos muestras de ARN total antes del tratamiento con DNA's se analizaron en un chip de bioanalizador.La muestra de ARN de alta calidad uno produjo tres bandas nítidas de ARN dos justo por debajo de los 2000 nucleótidos de tamaño, y una banda más pequeña por debajo de los 200 nucleótidos que representa los ARN ribosomales. Estas características también se observaron en los rastros del bioanalizador. En contraste, una muestra de ARN degradada muestra dos no produjo los picos nítidos de los ARN ribosomales y acumuló múltiples bandas de menos de 500 nucleótidos.Esta distribución de tamaños se distinguió fácilmente en los rastros del bioanalizador, en los que se observaron picos amplios de menor tamaño. Solo se utiliza ARN que muestra calidad máxima para generar bibliotecas. El análisis de RMN en esta figura identifica algunos picos prominentes correspondientes a metabolitos altamente abundantes, como la glucosa y la sacarosa, y dos ácidos metabólicos clave, lactato y acetato, según los desplazamientos químicos reportados en la literatura.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener transcritos y metabolitos de alta calidad a partir de grandes colecciones de cabezas de Joss, lo que le permitirá descubrir las perturbaciones moleculares y celulares inducidas por amiloides tóxicos que median la pérdida de células neuronales.

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