Co-cultivo celular Patterning Uso acuoso de dos fases Sistemas

El objetivo general de este procedimiento es modelar directamente las células en entornos completamente acuosos. Esto se logra disolviendo primero los polímeros de cadena larga, como el polietilenglicol y la dextrina, en tubos separados que contienen medio de cultivo celular. El segundo paso es intentar anizar, cosechar pellets y resuspender las células a la densidad de siembra deseada en una o ambas soluciones poliméricas.

A continuación, las soluciones poliméricas se dispensan en una placa de cultivo celular. La incompatibilidad de los dos polímeros permite el modelado espacial de los dos líquidos totalmente acuosos. Las células se pueden incluir en la solución polimérica o en ambas soluciones poliméricas para producir una variedad de patrones.

El paso final es eliminar las soluciones poliméricas una vez que se ha permitido que las células se adhieran durante cuatro horas o más y reemplazarlas con un medio de cultivo. En última instancia, la microscopía de campo claro o de fluorescencia se puede utilizar para confirmar el patrón celular. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la impresión por microcontacto, es que las células se modelan en un entorno completamente acuoso con herramientas simples como los patrones de microtubos.

Este método se puede utilizar para la ingeniería de tejidos para evaluar la migración celular e investigar la señalización pericrina y autocrina de célula a célula, lo que demuestra que los procedimientos serán un Abraham, un estudiante de pregrado, y Joshua White, un estudiante de posgrado del laboratorio de Takayama. Comience por disolver los dos polímeros diferentes en el medio específico que se utilizará en sus experimentos. En este ejemplo, el polietilenglicol, también conocido como PEG y la dextrina, también conocida como Dex, tienen pesos moleculares de 35 kilodaltons y 500 kilodaltons respectivamente.

Prepare 16 muestras de dos mililitros en tubos cónicos de 15 mililitros, cada uno con diferentes concentraciones de PEG y dex, similares a la tabla que se muestra aquí. Para lograr esto, pese las cantidades apropiadas de PEG y dex de acuerdo con la tabla y mézclelas en los medios meciéndolos suavemente hasta que ambos polímeros se disuelvan por completo. Esto puede tardar varias horas después de que los polímeros se hayan disuelto por completo.

La solución debe estar turbia. Confirme la separación de fases centrifugando las muestras a 1000 Gs durante cinco minutos. La fase inferior más densa será rica en dex.

La fase superior será rica en clavijas. A continuación, añada lentamente 0,1 mililitros de medio adicional a los tubos y agite las muestras durante 20 segundos. A continuación, vuelva a centrifugar las muestras para comprobar la separación de fases.

La solución es clara después de que se hayan agregado volúmenes adicionales de medio, repita este paso agregando otros 0,1 mililitros de medio mezclando y centrifugando las muestras hasta que la solución se aclare y ya no se separe la fase. Esto indica que se ha alcanzado el umbral del punto crítico para esa mezcla específica. Registre el peso final de cada tubo en este punto.

Finalmente, determine el porcentaje de peso por peso de los dos polímeros en el punto de separación de la cara. Traza la curva nodal del contenedor, colocando la clavija de porcentaje de peso por peso en el eje Y y las plataformas de porcentaje de peso por peso en el eje X. Esta curva son las concentraciones umbral para la separación de caras de PEG y dex en este medio.

Para comenzar el patrón de exclusión de las celdas, prepare soluciones separadas de PEG y dex al doble de sus valores de punto críticos, según lo determinado por el umbral nodal de bin. Para estos experimentos, se añaden a DMEM un 5 % de peso por peso PEG y un 12,8 % de peso por peso con un 10 % de FBS y un 1 % de antibióticos. Los tubos se colocan sobre un balancín para que se disuelvan por completo.

A continuación, recoja las células que se utilizarán para el patrón de exclusión para este experimento, las células hela al 80% de confluencia se triplican utilizando 0.5%tripsin durante tres minutos. Una vez recolectadas, cuente el número de células con un hemocitómetro, luego granule y vuelva a suspender las células a 375, 000 células por mililitro en medio con 5% de PEG agregado. Esta concentración producirá muestras que, una vez cultivadas, se volverán confluentes al día siguiente.

A continuación, utilizando una micropipeta, dispense 0,5 microlitros de gotas de la solución de cubierta al 12,8% en una placa seca de 96 pocillos para el patrón de exclusión. Las gotas Dex se pueden dejar secar en condiciones estériles para su uso posterior. A continuación, dispense lentamente 200 microlitros de suspensión de células hela PEG en el pocillo.

Para cubrir las gotas de D, es importante cubrir primero la gota de D con la solución de PEG antes de rellenar las áreas circundantes, ya que esto evita que interrumpa la gota cuando se propaga por el pocillo. Una vez que todos los pocillos hayan sido modelados y sembrados cuidadosamente, coloque la placa de cultivo celular en una incubadora humidificada. Asegúrese de que el plato no esté inclinado durante la manipulación y que esté colocado en un estante nivelado de la incubadora para evitar interrumpir los patrones después de que se haya permitido que las células se adhieran durante 12 horas.

Retire la solución de PEG y lave tres veces con 200 microlitros de medio de cultivo para eliminar los polímeros residuales. Luego agregue 200 microlitros de medio de cultivo fresco y devuelva la placa a la incubadora. Monitorear los cultivos periódicamente para observar la proliferación celular y la migración hacia las zonas de exclusión para comenzar el patrón de islas.

Prepare soluciones de 5% de peso por peso PEG y 12.8% de peso por peso en medio de cultivo celular. También recoja las células hela que se utilizarán para el patrón de islas y, nuevamente, determine el número total de células disponibles usando un hemocitómetro. Siguiente pellet y resus.

Gire las células a 5 millones de células por mililitro en medio. Continuando con el 12,8%dex, puede ser necesaria una mayor concentración de células para alcanzar la confluencia en 24 horas si las células no se adhieren tan bien como las células heela. A continuación, pipetee 200 microlitros de solución de PEG en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.

A continuación, añada lentamente una gota de 0,5 microlitros de suspensión de celda de cubierta en cada pocillo que contenga la solución de PEG. Las gotas se hundirán hasta el fondo y entrarán en contacto con la superficie del cultivo. Luego, transfiera con cuidado la placa a la incubadora, teniendo cuidado de no inclinar la placa en ningún punto, lo que puede interrumpir los patrones después de 12 horas.

Retirar la solución de PEG y lavar tres veces con 200 microlitros de medio de cultivo. Luego agregue 200 microlitros de medio de cultivo fresco y devuelva la placa a la incubadora. Monitorear los cultivos periódicamente para observar la proliferación celular y la migración hacia el exterior de las islas.

Comience el patrón de co-cultivo preparando soluciones de 5% de peso por peso PEG y 12.8% de peso por peso en DMEM con 10% de FPS y 1% de antibióticos también crezcan los dos tipos de células que se utilizarán en el patrón de exclusión e isla para que estén cerca de la confluencia. Al mismo tiempo, aquí, usaremos Hep G, dos islas de hepatocitos C3 a, con NIH tres fibroblastos T tres a su alrededor. A continuación, recoja los dos tipos de células y cuéntelas por separado con un hemocímetro.

Estos dos tipos de células se pueden distinguir fácilmente utilizando pellets de microscopía de campo claro, los hepatocitos Hep G dos C3 A para el patrón de isla y el gasto de resus en cubiertas del 12,8%. A continuación, granule los fibroblastos para la exclusión, el patrón y la suspensión de resus en 5% peg. A continuación, dispense gotas de 0,5 microlitros de suspensión de celdas D en una placa seca de 96 pocillos y cubra las gotas dex suavemente con 200 microlitros de suspensión de celdas peg

Luego transfiera la placa a una incubadora después de 12 horas. Retire el medio y enjuague tres veces con 200 microlitros de medio de cultivo. Luego agregue 200 microlitros de medio de cultivo fresco y devuelva la placa a la incubadora.

Por último, el seguimiento de la intensidad de la tinción de albúmina en los cocultivos puede utilizarse para evaluar los efectos beneficiosos del cocultivo de fibroblastos. Las concentraciones de polímeros necesarias para formar una variedad de sistemas acuosos bifásicos se describen aquí mediante las curvas nodales de la cuenca a concentraciones superiores a la curva nodal de la caja. El sistema forma dos fases por debajo de la curva nodal del bin.

La solución es un sistema monofásico bifásico transparente de al menos dos veces. Las concentraciones de los que se encuentran en la curva binaria son suficientes para su uso en los sistemas acuosos bifásicos descritos en este vídeo. El primer ejemplo de su uso es un patrón de exclusión en el que pequeñas áreas pueden dejarse vacías de células.

El patrón de isla crea exactamente lo contrario del patrón de exclusión, donde las regiones pequeñas se pueden asentar con celdas. La combinación de estos dos procedimientos se puede utilizar para formar un cocultivo único en el que una isla de células puede estar rodeada por otro tipo de célula, como se muestra aquí. Las células Hela plateadas con patrones de exclusión proliferarán y migrarán para llenar el vacío.

con el tiempo. El tamaño del vacío se puede monitorear para proporcionar información valiosa sobre la migración y el crecimiento de las células en condiciones variables. El patrón de islas, por otro lado, se puede utilizar para medir el crecimiento de las células.

La combinación de patrones insulares y de exclusión produce regiones bien definidas de cocultura. Aquí se muestran islas de hepatocitos rodeados de células de fibroblastos. Se ha encontrado que estas colonias mantienen su organización durante al menos cuatro días en cultivo.

Con este sistema, se pueden cultivar varias islas de células en la misma placa. Cuando se cultivan en islas solas, los hepatocitos producen ligeramente menos albúmina que cuando se cultivan en cocultivo con fibroblastos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar concentraciones de polímeros al doble de la concentración crítica para formar soluciones bifásicas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo formular un sistema acuoso de dos fases y usarlo para modelar celdas y definir geometrías.