Co-cultivo celular Patterning Uso acuoso de dos fases Sistemas

El objetivo general de este procedimiento es crear patrones directos de células en ambientes completamente acuosos. Esto se logra primero disolviendo polímeros de cadena larga, como el polietilenglicol y la dextrina, en tubos separados que contienen medio de cultivo celular. El segundo paso consiste en tripsinizar, cosechar el sedimento y resuspender las células a la densidad de siembra deseada en una o ambas soluciones poliméricas.

A continuación, se dispensan las soluciones poliméricas sobre un recipiente para cultivo celular. La incompatibilidad entre los dos polímeros permite el perfilado espacial de los dos líquidos completamente acuosos. Las células pueden incluirse en cualquiera de las soluciones poliméricas o en ambas soluciones poliméricas para producir una variedad de patrones.

El paso final consiste en eliminar las soluciones poliméricas una vez que se haya permitido a las células adherirse durante cuatro horas o más, y sustituirlas por medio de cultivo. Finalmente, se puede utilizar microscopía de campo brillante o de fluorescencia para confirmar el patrón celular. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la impresión por microcontacto es que las células se disponen en un entorno completamente acuoso utilizando herramientas sencillas como patrones de microcanales.

Este método puede utilizarse en ingeniería de tejidos para evaluar la migración celular y para investigar la señalización paracrina y autocrina entre célula y célula. Las demostraciones serán realizadas por Abraham, un estudiante de pregrado, y Joshua White, un estudiante de posgrado del laboratorio de Takayama. Comience disolviendo los dos polímeros diferentes en el medio específico que se utilizará en sus experimentos. En este ejemplo, el polietilenglicol, también conocido como PEG, y la dextrina, también conocida como Dex, tienen pesos moleculares de 35 kilodaltons y 500 kilodaltons, respectivamente.

Prepare 16 muestras de dos mililitros en tubos cónicos de 15 mililitros, cada una con diferentes concentraciones de PEG y dex, similares a las del cuadro mostrado aquí. Para lograrlo, pese las cantidades adecuadas de PEG y dex según el cuadro y mézclelas en el medio agitando suavemente hasta que ambos polímeros se disuelvan completamente. Esto puede tardar varias horas después de que los polímeros se hayan disuelto por completo.

La solución debe estar turbia. Confirme la separación de fases mediante centrifugación de las muestras a 1000 G durante cinco minutos. La fase inferior más densa estará rica en dex.

La fase superior será rica en PEG. A continuación, agregue lentamente 0,1 mililitros de medio adicional a los tubos y vortexee las muestras durante 20 segundos. Luego, centrifugue nuevamente las muestras para verificar la separación de fases.

La solución queda clara después de haber agregado volúmenes adicionales de medio; repita este paso añadiendo otro 0,1 mililitro de medio, mezclando y centrifugando las muestras hasta que la solución se vuelva clara y ya no separe en fases. Esto indica que se ha alcanzado el umbral del punto crítico para esa mezcla específica. Registre el peso final de cada tubo en este momento.

Finalmente, determine el porcentaje peso por peso de los dos polímeros en el punto de separación de fases. Trace la curva nodal binaria, colocando el porcentaje peso por peso de PEG en el eje Y y el porcentaje peso por peso de dex en el eje X. Esta curva representa las concentraciones umbral para la separación de fases de PEG y dex en este medio.

Para comenzar con el patrón de exclusión de células, prepare soluciones separadas de PEG y dex al doble de sus valores críticos determinados por el umbral nodal binario. Para estos experimentos, se añade 5% peso por peso de PEG y 12,8% peso por peso de dex al DMEM con 10% de FBS y 1% de antibióticos. Los tubos se colocan sobre un agitador para permitir que se disuelvan completamente.

A continuación, recolecte las células que se utilizarán para el patrón de exclusión en este experimento; las células HeLa al 80 % de confluencia se tripsinizan usando tripsina al 0,5 % durante tres minutos. Una vez recolectadas, cuente el número de células utilizando un hemocitómetro, luego centrifugue y resuspenda las células a una concentración de 375 000 células por mililitro en medio con 5 % de PEG añadido. Esta concentración producirá muestras que, al ser cultivadas, alcanzarán confluencia al día siguiente.

A continuación, utilizando una micropipeta, distribuya gotas de 0,5 microlitros de la solución al 12,8 % de deck sobre una placa de 96 pocillos seca para el diseño por exclusión. Las gotas de dex pueden dejarse secar en condiciones estériles para su uso posterior. Luego, agregue lentamente 200 microlitros de la suspensión de células Hela PEG en el pocillo.

Para cubrir las gotas de D, es importante primero cubrir la gota de D con la solución de PEG antes de llenar las áreas circundantes, ya que esto evita que se altere la gota cuando se extiende a través del pocillo. Una vez que todos los pocillos hayan sido patroneados y sembrados cuidadosamente, coloque la placa de cultivo celular en un incubador humedecido. Asegúrese de que el recipiente no esté inclinado durante el manejo y de que se coloque sobre una repisa nivelada del incubador para evitar alterar los patrones después de que las células hayan tenido tiempo para adherirse durante 12 horas.

Elimine la solución de PEG y lave tres veces con 200 microlitros de medio de cultivo para eliminar cualquier polímero residual. A continuación, agregue 200 microlitros de medio de cultivo fresco y devuelva la placa al incubador. Monitoree periódicamente los cultivos para observar la proliferación celular y la migración hacia las zonas de exclusión para comenzar el estampado de islotes.

Prepare soluciones de PEG al 5% peso por peso y cubiertas al 12,8% peso por peso en medio de cultivo celular. También recolecte las células HeLa que se utilizarán para el estampado de islas y, nuevamente, determine el número total de células disponibles utilizando un hemocitómetro. A continuación, centrifugue y re suspenda.

Centrifugar las células a 5 millones de células por mililitro en medio. Continuando con dex al 12,8 %, puede ser necesaria una concentración mayor de células para alcanzar la confluencia en 24 horas si las células no se adhieren tan bien como las células heela. A continuación, pipetear 200 microlitros de solución de PEG en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.

Luego, agregue lentamente una gota de 0,5 microlitros de suspensión de células deck en cada pocillo que contenga la solución de PEG. Las gotas se hundirán hasta el fondo y entrarán en contacto con la superficie de cultivo. A continuación, transfiera cuidadosamente la placa al incubador, teniendo cuidado de no inclinar el recipiente en ningún momento, ya que esto podría alterar los patrones después de 12 horas.

Elimine la solución de PEG y lave tres veces con 200 microlitros de medio de cultivo. A continuación, agregue 200 microlitros de medio de cultivo fresco y devuelva la placa al incubador. Observe periódicamente los cultivos para verificar la proliferación celular y la migración hacia afuera desde las islas.

Comience el trazado de co-cultivo preparando soluciones de PEG al 5% peso por peso y decks al 12,8% peso por peso en DMEM con 10% FPS y 1% de antibióticos. Al mismo tiempo, cultive los dos tipos celulares que se utilizarán en el trazado de exclusión e islas para que estén cerca de la confluencia. En este caso, usaremos hepatocitos Hep G2C3 como islas con fibroblastos NIH 3T3 alrededor de ellos. Luego, recolecte los dos tipos celulares y cuéntelos por separado utilizando un hemocitómetro.

Estos dos tipos celulares pueden distinguirse fácilmente mediante microscopía de campo claro. El pellet de células hepáticas Hep G2 C3A se utiliza para el estampado de islas y se resuspende en 12,8 % de decks. Luego, el pellet de fibroblastos se usa para exclusión, estampado y se resuspende en 5 % de peg. A continuación, se dispensan gotas de 0,5 microlitros de suspensión de células D en una placa de 96 pocillos seca y se cubren suavemente las gotas de dex con 200 microlitros de suspensión de células en peg.

Luego, transfiere la placa al incubador después de 12 horas. Retira el medio y enjuaga tres veces con 200 microlitros de medio de cultivo. A continuación, añade 200 microlitros de medio de cultivo fresco y devuelve la placa al incubador.

Finalmente, la intensidad de la tinción de albúmina en cultivos colectivos puede utilizarse para evaluar los efectos beneficiosos del cultivo colectivo con fibroblastos. Las concentraciones de polímero necesarias para formar una variedad de sistemas acuosos de dos fases se describen aquí mediante las curvas binodales: el sistema forma dos fases por debajo de la curva binodal, en concentraciones superiores a la curva binodal.

La solución es un sistema bifásico de fase única transparente al menos dos veces. Las concentraciones de los compuestos situados sobre la curva binodal son suficientes para su uso en los sistemas acuosos bifásicos descritos en este video. El primer ejemplo de su aplicación es un patrón de exclusión, en el que se pueden dejar pequeñas áreas libres de células.

El patrón de islas crea exactamente lo opuesto al patrón de exclusión, en el que pueden establecerse pequeñas regiones con células. La combinación de estos dos procedimientos puede utilizarse para formar un co-cultivo único en el que una isla de células puede quedar rodeada por otro tipo celular, como se muestra aquí. Las células HeLa sembradas mediante el patrón de exclusión proliferarán y migrarán para llenar el espacio vacío.

Con el tiempo, el tamaño del vacío puede monitorizarse para obtener información valiosa sobre la migración y el crecimiento celular bajo diferentes condiciones. Por otro lado, el trazado de islas puede utilizarse para medir el crecimiento celular.

La combinación de patrones de islas y exclusión produce regiones bien definidas de co-cultivo. Aquí se muestran islas de hepatocitos rodeadas por células fibroblasto. Se ha encontrado que estas colonias mantienen su organización durante al menos cuatro días en cultivo.

Utilizando este sistema, se pueden cultivar múltiples islotes de células en la misma placa. Cuando se cultivan únicamente como islotes, los hepatocitos producen ligeramente menos albúmina que cuando se cultivan en co-cultivo con fibroblastos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar concentraciones de polímeros al doble de la concentración crítica para formar soluciones de dos fases.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo formular un sistema acuoso de dos fases y utilizarlo para distribuir células y definir geometrías.