Una novela de alta resolución En vivo Técnica de escaneo para el Estudio de la respuesta dinámica de estructuras intracraneales al crecimiento del tumor y Terapéutica

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes unicelulares de alta resolución de las células progenitoras derivadas de la médula ósea siguiendo sus patrones de reclutamiento para la vasculatura cerebral normal y asociada al tumor cerebral con el tiempo. Esto se logra mediante la extracción de la tibia y el fémur de ratones donantes para obtener células progenitoras fluorescentes de la médula ósea, y luego se inyectan esas células en ratones receptores radiados. El segundo paso es generar xenoinjertos intracraneales de GB M en los ratones quiméricos dentro de una cámara de ventana craneal.

A continuación, los ratones se someten a una variedad de regímenes de tratamiento que incluyen radiación guiada estereotáctica. El paso final es obtener imágenes de los ratones en un microscopio confocal de dos fotones. En última instancia, esta metodología se puede utilizar para estudiar dinámicamente los mecanismos de vascularización intracraneal en una variedad de modelos.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la histopatología de tejidos ex vivo, es que podemos estudiar información dinámica crítica relacionada con la formación de vasos en el cerebro. Como tal, podemos responder preguntas clave en torno a los mecanismos de la neovascularización intercraneal. Aunque este método se puede utilizar para proporcionar información sobre la neovascularización intracraneal, también se puede aplicar a otros sistemas y procesos patológicos en el cerebro, como la isquemia intracraneal o el accidente cerebrovascular, la enfermedad neurodegenerativa y los mecanismos de metástasis de células tumorales en el cerebro.

Para el propósito de este video, no pudimos seguir una técnica aséptica estricta. Como tal, la capucha de bioseguridad tiene una apertura excesiva de 12 pulgadas y los animales no están cubiertos, lo que permite al espectador una imagen más clara y un mejor acceso para orientar los procedimientos para el trabajo experimental. Se debe seguir estrictamente la técnica aséptica.

Comience este procedimiento confirmando la expresión de fluorescencia del ratón donante GFP y eutanasiarlo de acuerdo con las directrices del comité institucional de cuidado animal. A continuación, limpie ambas extremidades traseras y retire la tibia y el fémur mientras trabaja en condiciones asépticas. Retire todo el exceso de tejido de los huesos.

A continuación, retire las placas finales de ambos extremos de los cuatro huesos extraídos. Enjuáguelos con una aguja de calibre 22 y un mililitro de PBS estéril. Se aclararán una vez que se haya eliminado toda la médula ósea.

Después, mezcle la suspensión de médula ósea extraída. Bueno, debería contener aproximadamente 20 millones de células, lo que es suficiente para las reconstituciones de tres ratones huéspedes. A continuación, prepare 3 agujas de tuberculina de calibre 27 y extraiga 300 microlitros de la suspensión de médula ósea en cada una de ellas.

Mientras el ratón está colocado en el restricción. Marca la superficie dorsal de la cola para orientarte. A continuación, inyecte la suspensión en la vena lateral de la cola de tres previamente irradiadas.

Ratones de deslizamiento en este procedimiento que trabajan en condiciones asépticas. Anestesiar a los ratones quiméricos de médula ósea y administrar analgesia preventiva aprobada por iacuc. Aplica gel lacrimógeno para prevenir la deshidratación de la córnea.

Limpie la cabeza primero con la solución de Betadine, luego con alcohol y retire el exceso de vello. A continuación, limpie más el cuero cabelludo subyacente con alcohol. Haz una incisión desde el punto medio de las orejas hasta justo por encima de los ojos.

Retire el cuero cabelludo a cada lado de la primera incisión para exponer unos cinco milímetros del cráneo subyacente. A continuación, identifique los puntos de referencia anatómicos de la superficie del cráneo. A continuación, identifique y levante el periostio inyectando lidocaína al 2% con solución de epinefrina.

Posteriormente, diseccionar el periostio lejos de la superficie del cráneo con un instrumento punzante. A continuación, utilice un taladro de refinamiento TR de 2,7 milímetros para debilitar un colgajo óseo circular de 2,7 milímetros en el hemisferio derecho del cráneo, equidistante de Lambda y bgma. No penetre el hueso con el taladro para proteger la duramadre y el tejido subyacentes.

Ahora, retire el colgajo óseo debilitado con la disección, las pinzas y el gancho dental con una fuerza deliberada pero controlada. A continuación, cargue una jeringa Hamilton de calibre 30 con 10 microlitros de suspensión de celdas y coloque la aguja en el marco estereotáctico. A continuación, coloque el ratón en el marco estereotáctico.

Alinee la aguja al punto central de la ventana generada, después de eso, baje la aguja hasta que toque la superficie cortical. A continuación, restablezca las coordenadas digitales. Ahora baje la aguja 3,2 milímetros en el tejido cortical.

A continuación, retraiga 0,2 milímetros e inyecte a tres milímetros. La inyección en profundidad debe realizarse a una velocidad de 10 microlitros por minuto. Una vez finalizada la inyección, deje la aguja en su lugar durante un minuto antes de retraerla lentamente.

A continuación, retire el ratón del marco. Posteriormente, mantener hidratada la superficie cerebral. Usando gotas de PBS estéril.

Coloque un cubreobjetos de tres milímetros en la superficie del cerebro para sellar la ventana de 2,7 milímetros. A continuación, seca el hueso del cráneo circundante. A continuación, aplique bond, veterinario, para pegar el tejido del cuero cabelludo al hueso del cráneo y mantenga el cubreobjetos en su lugar.

No aplique demasiado, ya que se filtrará debajo del vidrio y disminuirá el potencial de imagen. A continuación, mezcle el polvo acrílico dental fresco y la solución en la capucha y aplique la mezcla sobre la unión veterinaria con una aguja de calibre 22. Para asegurar un sellado hermético, aplique el acrílico para que se superponga ligeramente con el borde del cubreobjetos de vidrio, pero no para cubrir el cubreobjetos de vidrio.

En este paso, coloque un ratón anestesiado en un protector de cabeza personalizado dentro del irradiador estereotáctico XAD 2 25 diseñado por la casa. Obtenga una tomografía computarizada de haz cónico de 360 grados con el tubo de rayos X funcionando a un voltaje máximo de 40 kilos y 0,05 miliamperios a través de un filtro de aluminio de dos milímetros. Utilice la imagen para colocar la platina de manera que el centro ISO de radiación se dirija hacia el hemisferio derecho y sea central en la dirección ventral dorsal.

Hay una amplia variedad de colimadores disponibles para dirigir la radiación, lo que demuestra la adaptabilidad del modelo. En este caso, utilizamos ocho milímetros por 11 milímetros para la irradiación hemisférica. Inserte el colimador hemisférico en el irradiador estereotáctico X RAD 2 25.

Obtenga las imágenes ortogonales de TC individuales desde la parte superior e inferior a través del colimador para garantizar el posicionamiento correcto de la cabeza mediante la localización de las estructuras óseas anatómicas y el ajuste manual de la posición de la etapa en el monitor. Cambie el filtro de aluminio XAD 2 25 IRRADIATOR por un filtro de tratamiento de cobre de 0,93 milímetros. A continuación, ejecute el programa del tubo de rayos X a 225 voltaje máximo illa y 13 miliamperios y administre la mitad de la dosis de radiación desde la parte superior en una dirección AP.

Vuelva a colocar el pórtico en la posición inferior y administre la segunda mitad de la dosis de radiación desde la parte inferior en dirección PA. En este procedimiento, anestesiar el ratón de ventana intracraneal previamente generado y limpiar la ventana con alcohol en aerosol. Configure los canales en el microscopio confocal según lo determinado por los fluorocromos integrados en el ratón quimérico generado.

También puede reutilizar los ajustes anteriores para reducir la variabilidad entre las sesiones de imágenes. Inyecte las marcas necesarias para la obtención de imágenes en la vena lateral de la cola, en este caso, dextrano para la vasculatura. Invierta el ratón en el retenedor de cabeza hecho a medida, que se apoya con plastilina moldeable, asegurándose de que el cabezal esté perpendicular al láser y cargue el retenedor en la platina del microscopio móvil.

Encienda el láser del primer canal y colóquelo en el centro de la ventana intracraneal mirando directamente al punto de intersección del rayo láser en la ventana de la cámara. Tome una imagen de cada canal para toda la ventana con una lente de cinco aumentos y utilícela como mapa para otras imágenes de mayor resolución con lentes de largo alcance de 10 y 20 aumentos. Este esquema destaca los errores técnicos asociados con el proceso quirúrgico y demuestra el efecto que cada uno tendrá en las imágenes producidas.

El aire atrapado debajo de la ventana será visible como burbujas en las imágenes. La acumulación de acrílico en el vidrio es autofluorescente en el canal rojo lejano y bloqueará parte del campo de visión. Del mismo modo, la suciedad de la ventana durante la toma de imágenes se muestra como flexión autofluorescente en las imágenes.

Incluso la ventana intracraneal perfecta puede encontrar problemas una vez que está bajo el microscopio. Los artefactos de respiración dan como resultado imágenes rayadas, mientras que una mala posición del mouse en el marco da como resultado una imagen segmentada. Dado que el láser solo atraviesa una parte del tejido con el procesamiento posterior a la imagen, es posible agregar un canal adicional para las células marcadas con CFP, mediante el cual las imágenes GFP se pueden restar de las imágenes CFP para revelar la verdadera señal CFP.

Además, utilizando la autofluorescencia de segunda generación de armónicos característica de las cuatro fibras de colágeno, podemos obtener imágenes de la membrana basal de la vasculatura. La disponibilidad de cinco canales fluorescentes permite al usuario una gran flexibilidad y adaptabilidad del novedoso modelo de duplicación descrito en este documento. Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta los productos peligrosos utilizados durante los procedimientos quirúrgicos.

También es esencial ser meticuloso y prestar especial atención a los detalles para garantizar que el tejido cerebral permanezca intacto a lo largo de las imágenes a largo plazo. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo crear un ratón quimérico con células progenitoras fluorescentes y, a su vez, ser capaz de capturar imágenes en tiempo real de alta resolución de la vasculatura intracraneal después de la implantación de células tumorales con o sin intervención terapéutica.