Una novela de alta resolución

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de alta resolución a nivel de célula individual de células progenitoras derivadas de médula ósea, tras seguir sus patrones de reclutamiento hacia la vasculatura cerebral normal y asociada a tumores cerebrales a lo largo del tiempo. Esto se logra extrayendo la tibia y el fémur de ratones donantes para obtener células progenitoras fluorescentes de la médula ósea, e inyectar luego estas células en ratones receptores irradiados. El segundo paso consiste en generar xenoinjertos intracraneales de GBM en ratones quiméricos dentro de una cámara con ventana craneal.

A continuación, los ratones reciben una variedad de regímenes de tratamiento, incluida la radiación guiada estereotácticamente. El paso final consiste en obtener imágenes de los ratones mediante un microscopio confocal de dos fotones. En definitiva, esta metodología puede utilizarse para estudiar dinámicamente los mecanismos de vascularización intracraneal en una variedad de modelos.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la histopatología de tejido ex vivo es que podemos estudiar información dinámica fundamental relacionada con la formación de vasos sanguíneos en el cerebro. De este modo, podemos responder preguntas clave sobre los mecanismos de la neovascularización intracraneal. Aunque este método puede utilizarse para obtener información sobre la neovascularización intracraneal, también puede aplicarse a otros sistemas y procesos patológicos en el cerebro, como la isquemia intracraneal o el accidente cerebrovascular, las enfermedades neurodegenerativas y los mecanismos de metástasis de células tumorales al cerebro.

Para los fines de este video, no fue posible seguir una técnica estrictamente aséptica. Por ello, se utiliza una campana de seguridad biológica con una abertura superior a 12 pulgadas y los animales no están cubiertos con campos quirúrgicos, lo que permite al espectador obtener una imagen más clara y un mejor acceso para orientarse en los procedimientos con fines experimentales. La técnica aséptica debe seguirse estrictamente.

Comience este procedimiento confirmando la expresión de fluorescencia del ratón donante GFP y sacrifíquelo de acuerdo con las directrices del comité institucional de cuidado animal. A continuación, limpie ambas extremidades traseras y retire la tibia y el fémur mientras trabaja en condiciones asépticas. Elimine todos los tejidos excesivos de los huesos.

Luego retire las placas terminales de ambos extremos de los cuatro huesos extraídos. Lávelos con una aguja de calibre 22 y un mililitro de PBS estéril. Se volverán transparentes una vez que se haya eliminado toda la médula ósea.

A continuación, mezcle bien la suspensión de médula ósea extraída. Debe contener aproximadamente 20 millones de células, cantidad suficiente para la reconstrucción en tres ratones huésped. Luego, prepare 3 agujas tuberculínicas de calibre 27 y aspire 300 microlitros de la suspensión de médula ósea en cada una de ellas.

Mientras el ratón esté colocado en el sujetador, marque la superficie dorsal de la cola para orientarse. A continuación, inyecte la suspensión en la vena lateral de la cola de tres ratones previamente irradiados.

Utilice ratones nod skid en este procedimiento trabajando bajo condiciones asépticas. Anestesie los ratones quiméricos de médula ósea nod skid y administre analgesia preventiva aprobada por el IACUC. Aplique gel lagrimal para prevenir la deshidratación corneal.

Limpie primero la cabeza con solución de Betadine, luego con alcohol y elimine el exceso de pelo. A continuación, limpie más a fondo el cuero cabelludo subyacente con alcohol. Haga una incisión desde el punto medio de las orejas hasta justo por encima de los ojos.

Retire el cuero cabelludo a ambos lados de la primera incisión para exponer unos cinco milímetros del cráneo subyacente. Luego identifique los puntos de referencia anatómicos de la superficie del cráneo. A continuación, identifique y levante el periostio inyectando una solución de lidocaína al 2% con epinefrina.

Posteriormente, separe el periostio de la superficie del cráneo con un instrumento afilado. Luego, utilice una fresa TR de 2,7 milímetros para debilitar una sección ósea circular de 2,7 milímetros en el hemisferio derecho del cráneo, equidistante de Lambda y bgma. No penetre el hueso con la fresa para proteger la duramadre y los tejidos subyacentes.

Ahora, retire la escotadura ósea debilitada utilizando la disección, pinzas y gancho dental con fuerza deliberada pero controlada. A continuación, cargue una jeringa Hamilton de calibre 30 con 10 microlitros de suspensión celular y coloque la aguja en el marco estereotáxico. Luego, coloque el ratón sobre el marco estereotáxico.

Alinee la aguja con el punto central de la ventana generada después, baje la aguja hasta que toque la superficie cortical. A continuación, restablezca las coordenadas digitales. Ahora baje la aguja 3,2 milímetros dentro del tejido cortical.

A continuación, retráigase 0,2 milímetros e inyecte a tres milímetros. La inyección en profundidad debe realizarse a una velocidad de 10 microlitros por minuto. Cuando se complete la inyección, deje la aguja en su lugar durante un minuto antes de retirarla lentamente.

A continuación, retire el ratón del soporte. Posteriormente, mantenga la superficie del cerebro hidratada mediante gotas de PBS estéril.

Coloque un cubreobjetos de tres milímetros sobre la superficie del cerebro para sellar la ventana de 2,7 milímetros. Luego seque el hueso del cráneo circundante. A continuación, aplique vet bond para pegar el tejido del cuero cabelludo al hueso del cráneo y mantener el cubreobjetos en su lugar.

No aplique demasiado, ya que podría filtrarse por debajo del vidrio y reducir el potencial de imagen. A continuación, mezcle en la campana el polvo y la solución frescos de acrílico dental y aplique la mezcla sobre el vet bond utilizando una aguja de calibre 22. Para garantizar un sellado hermético, aplique el acrílico de manera que se superponga ligeramente con el borde del cubreobjetos de vidrio, pero sin cubrir el cubreobjetos de vidrio.

En este paso, coloque un ratón anestesiado en un sujetador craneal personalizado dentro del irradiador estereotáctico XAD 2 25 diseñado en la casa. Obtenga un escáner de tomografía computarizada de haz cónico de 360 grados con el tubo de rayos X funcionando a 40 kilovoltios pico y 0,05 miliamperios a través de un filtro de aluminio de dos milímetros. Utilice la imagen para posicionar la plataforma de manera que el centro ISO de la radiación esté dirigido al hemisferio derecho y sea central en la dirección dorsal-ventral.

Existe una amplia variedad de colimadores disponibles para dirigir la radiación, lo que demuestra la adaptabilidad del modelo. En este caso, utilizamos un colimador de ocho milímetros por 11 milímetros para la irradiación hemisférica. Inserte el colimador hemisférico en el irradiador estereotáctico X RAD 2 25.

Obtenga las imágenes ortogonales de TC individuales desde la parte superior y la inferior a través del colimador para asegurar la posición correcta de la cabeza, localizando las estructuras óseas anatómicas y ajustando manualmente la posición del estadio en el monitor. Cambie el filtro de aluminio XAD 2 25 IRRADIATOR por un filtro de tratamiento de cobre de 0,93 milímetros. Luego, ejecute el programa del tubo de rayos X a un voltaje pico de 225 kilovoltios y 13 miliamperios, y administre la mitad de la dosis de radiación desde la parte superior en dirección anteroposterior (AP).

Devuelva el gánon a la posición inferior y administre la segunda mitad de la dosis de radiación desde abajo en una dirección PA. En este procedimiento, anestesie el ratón con ventana intracraneal generada previamente y limpie la ventana utilizando un rocío de alcohol. Configure los canales en el microscopio confocal según lo determinado por los fluorocromos integrados en el ratón quimérico generado.

Alternativamente, reutilice configuraciones previas para reducir la variabilidad entre sesiones de imagen. Inyecte cualquier marcador necesario para la imagen en la vena lateral de la cola, en este caso dextrano para la vasculatura. Invierta al ratón sobre el sujetador de cabeza personalizado, sosteniéndolo con plastilina moldeable, asegurándose de que la cabeza esté perpendicular al láser y plana, y coloque el sujetador sobre la plataforma móvil del microscopio.

Encienda el láser del primer canal y colóquelo en el centro de la ventana intracraneal observando directamente el punto de intersección del haz láser sobre la ventana de la cámara. Tome una imagen de cada canal para toda la ventana con una lente de 5 x y utilícela como mapa para otras imágenes de mayor resolución con lentes de largo alcance de 10 x y 20 x. Este esquema resalta los errores técnicos asociados con el proceso quirúrgico y muestra el efecto que cada uno tendrá sobre las imágenes obtenidas.

El aire atrapado bajo la ventana será visible como burbujas en las imágenes. La acumulación de acrílico sobre el vidrio es autofluorescente en el canal de luz roja lejana y bloqueará parte del campo de visión. De manera similar, la suciedad sobre la ventana durante la adquisición de imágenes aparece como reflejos autofluorescentes en las imágenes.

Incluso la ventana intracraneal perfecta puede presentar problemas una vez que se encuentra bajo el microscopio. Los artefactos por la respiración generan imágenes con líneas, mientras que una mala posición del ratón en el soporte produce una imagen segmentada. Dado que el láser solo atraviesa una parte del tejido, es posible añadir un canal adicional para células marcadas con CFP, en el cual las imágenes de GFP pueden restarse de las imágenes de CFP para revelar la señal verdadera de CFP.

Además, aprovechando la característica de autofluorescencia por generación de segundo armónico de las fibras de colágeno tipo IV, es posible obtener imágenes de la membrana basal de la vasculatura. La disponibilidad de cinco canales fluorescentes ofrece al usuario una gran flexibilidad y adaptabilidad del novedoso modelo de reflejo descrito en este artículo. Al realizar este procedimiento, es importante tener en cuenta los productos peligrosos utilizados durante las intervenciones quirúrgicas.

También es fundamental ser meticuloso y prestar una atención específica al detalle para asegurar que el tejido cerebral permanezca intacto durante todo el proceso de imagenología a largo plazo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear un ratón quimérico con células progenitoras fluorescentes, y a su vez ser capaz de obtener imágenes en tiempo real de alta resolución de la vasculatura intracraneal tras el implante de células tumorales, con o sin intervención terapéutica.