Pyrosequencing para la identificación microbiana y caracterización

El objetivo general del siguiente experimento es identificar una bacteria a través del análisis de la secuencia de ADN ribosómico de 16 s utilizando la metodología de secuenciación pirotécnica. Esto se logra amplificando primero el ADN objetivo a través de una reacción en cadena de la polimerasa utilizando un cebador biotinilado. A continuación, el amplicón biotinilado se inmoviliza utilizando perlas de estreptavidina recubiertas de estreptavidina y se purifica con tampones de lavado.

A continuación, el amplicón se desnaturaliza y los cebadores de secuenciación ribosómica de 16 s son ELL para las cadenas individuales de ADN. El objetivo de este paso es preparar el ADN para la secuenciación. Por último, la reacción de secuenciación del ADN tiene lugar mediante pirosecuenciación, un método rápido y preciso para secuenciar ácidos nucleicos basado en el principio de secuenciación por síntesis.

La alicon biotinilada es utilizada como molde por la ADN polimerasa para incorporar DN TPS una base a la vez, lo que conduce a la generación de pirofosfato. Una ureasa TP Sul convierte proporcionalmente el pirofosfato en A-T-P-A-T-P cataliza la conversión mediada por luciferasa de Lucifer a Lucifer, que genera luz que es proporcional a la cantidad de un TP. La luz se registra como un pico en la traza pirotécnica e indica la incorporación de nucleótidos. Los NTP de DN no incorporados se degradan por apras antes de que se agregue el siguiente DNTP para continuar con la síntesis.

La señal quimioluminiscente registrada en el rogram permite determinar la secuencia de ADN. Los resultados obtenidos son secuencias de SDNA ribosómico 16, que se utilizan para identificar la bacteria mediante la comparación con una base de datos de referencia de ADN ribosómico. La pirosecuenciación es una técnica versátil que facilita la secuenciación del genoma microbiano y puede utilizarse para identificar especies bacterianas, discriminar cepas bacterianas y detectar mutaciones genéticas que confieren resistencia a los agentes antimicrobianos.

En este video, se demostrará el procedimiento para la generación de amplicones bacterianos, la secuenciación pirotécnica de amplicones y el análisis de secuencias de ADN. Para comenzar el procedimiento de amplificación de plantillas, descongele todas las soluciones requeridas y mezcle cada una a fondo. Todo el trabajo se puede realizar a temperatura ambiente. Configure la reacción de PCR de acuerdo con esta tabla.

Tenga en cuenta que una concentración final de cloruro de magnesio de 1,5 milimolar proporcionará resultados satisfactorios en la mayoría de los casos. Sin embargo, si se requiere una mayor concentración de magnesio de hasta 3,5 microlitros de 25 milimolares, se puede agregar cloruro de magnesio a una reacción. Una imprimación debe estar biotinilada en sus cinco extremos principales, y se recomienda que la imprimación se purifique completamente por HPLC.

Mezcle la mezcla de reacción pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo, y luego dispense los volúmenes adecuados en los tubos de PCR. A continuación, añada ADN molde a cada tubo de PCR. Se recomiendan 10 nanogramos de ADN genómico por reacción.

Coloque los tubos de PCR en un ciclador y comience este programa de ciclo antes de hacer la mezcla maestra. Agite el frasco de estreptococos ávidos y perlas de seros recubiertas para asegurar una suspensión homogénea. Haz una mezcla maestra de acuerdo a este diagrama de flujo.

Combinación de perlas, tampón aglutinante y agua de alta pureza en un tubo de microcentrífuga. Dependiendo del volumen de producto de PCR utilizado, se dispensaron de 60 a 75 microlitros de mezcla maestra en cada pocillo de una placa de PCR para que el volumen total sea de 80 microlitros por pocillo. Agregue de cinco a 20 microlitros de producto de PCR biotinilado a cada pocillo.

El volumen por pocillo debería ser ahora de 80 microlitros. Selle los pocillos con tapas de tiras y agite la placa de PCR a 1.400 RPM durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente utilizando un agitador orbital. Comience este procedimiento diluyendo los cebadores de secuenciación a 0,3 micromolares con un tampón arrodillado y dispensando 25 microlitros en cada pocillo de la placa de reacción.

Coloque la placa en la estación de trabajo de vacío. Llene los canales de la estación de trabajo de acuerdo con este diagrama. 50 mililitros de etanol al 70% en un canal de 40 mililitros de solución de desnaturalización en un canal de 50 mililitros de tampón de lavado en un canal de tres 50 mililitros de agua de alta pureza en el canal cuatro y 70 mililitros de agua de alta pureza en un canal cinco.

Encienda la bomba de vacío y asegúrese de que el interruptor de la herramienta de vacío esté activado, enjuague las sondas del filtro con agua de alta pureza. En el canal cinco, coloque la placa de PCR con perlas en la estación de trabajo asegurándose de que tanto las placas de PCR como las de reacción estén en la misma orientación. Baje la herramienta de vacío en los pocillos de la placa de PCR.

Durante 20 segundos o hasta que se haya aspirado todo el volumen, las perlas serán capturadas por la herramienta de vacío con la aspiradora aún encendida. Enjuague la herramienta con etanol al 70% durante 20 segundos o hasta que se haya aspirado todo el volumen. A continuación, enjuague la herramienta con una solución de desnaturalización durante 20 segundos o hasta que se haya aspirado todo el volumen.

Después de eso, enjuague la herramienta con tampón de lavado durante 20 segundos o hasta que se haya aspirado todo el volumen con la aspiradora aún encendida. Eleve la herramienta de vacío más allá de los 90 grados verticales durante cinco segundos para permitir que todo el líquido se drene de la herramienta de vacío. Ahora apague la bomba y alinee la herramienta de vacío con tres placas de reacción.

Baje la herramienta de vacío en los pozos. A continuación, agite suavemente de lado a lado durante aproximadamente 10 segundos para liberar las perlas en los pocillos que contienen el cebador de secuenciación. Coloque la herramienta de vacío en el bebedero de agua para limpiarla y anáel el cebador de secuenciación al ADN.

Coloque la placa de reacción en un soporte de placa precalentada. Calienta el plato a 80 grados centígrados durante dos minutos. Retire la placa del soporte y colóquela sobre la encimera para que se enfríe a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Comience este procedimiento encendiendo el instrumento usando el interruptor de encendido ubicado encima del cable de alimentación para determinar los volúmenes necesarios. Configure un archivo de ejecución en el software del instrumento y, en el menú de herramientas, seleccione la información previa a la ejecución. Llene un cartucho de acuerdo con las instrucciones proporcionadas en la página de información previa a la ejecución.

Coloque la punta de la pipeta en la esquina de cada pocillo lo más abajo posible, asegurándose de que no haya burbujas de aire. Abra la compuerta del cartucho e inserte el cartucho con la etiqueta hacia adelante. Asegúrese de que el cartucho esté insertado correctamente y cierre la compuerta.

Abra el marco de sujeción de la placa y coloque la placa de reacción dentro del instrumento. Cierre el marco de sujeción de la placa y la tapa del instrumento. Inserte la memoria USB con los archivos de ejecución creados con el software del instrumento en el puerto USB en la parte delantera de la prensa del instrumento.

Está bien para ver el menú de archivos de ejecución deseados. Utilice las flechas de desplazamiento para seleccionar el archivo de ejecución deseado y pulse seleccionar. Cuando se alcanzan todos los niveles de presión y temperatura preestablecidos, el instrumento comenzará a dispensar reactivos durante una ejecución.

La pantalla del instrumento muestra la bomba del pozo seleccionado en tiempo real. Utilice las flechas de desplazamiento para ver las bombas de otros pozos. Cuando el instrumento confirme que la ejecución ha finalizado y que el archivo de ejecución se ha guardado en la memoria USB, pulse cerrar.

Retire la memoria USB. Aquí se muestran los resultados de una ejecución típica de secuenciación pirotécnica. Los cebadores de PCR directa e inversa están diseñados para regiones conservadas de la plantilla de ADN, que es la secuencia ribosómica 16 s.

En este ejemplo, el cebador de secuenciación se coloca inmediatamente aguas arriba de una secuencia de ADN hipervariable de identificación bien caracterizada dentro del amplicón que se muestra en azul. Esta secuencia hipervariable permite la identificación bacteriana de un gran número de especies bacterianas utilizando el cebador de secuenciación conservado como control de calidad interno, la secuencia de ADN que pone entre paréntesis la región variable se puede verificar para asegurar que se ha analizado la región de ADN correcta. El software de secuenciación pirotécnica permite la comparación y alineación de la secuencia generada con una base de datos interna de secuencias ribosómicas bacterianas para su identificación.

Además, se puede analizar una secuencia para determinar las mutaciones que confieren resistencia a los antibióticos. Por ejemplo, el análisis de mutaciones en los genes ribosómicos 23 s de helicobacter pylori revela dos patrones de mutación, GAA o GA que confieren resistencia a los antibióticos. La pirosecuenciación es una técnica versátil que facilita la secuenciación del genoma microbiano.

Las ventajas de la pirosecuenciación de las aplicaciones microbiológicas incluyen un cribado rápido y fiable de alto rendimiento y una identificación precisa de microbios y mutaciones del genoma microbiano. Además, la metodología de secuenciación pirogénica puede analizar toda la diversidad genética de la resistencia a los fármacos antimicrobianos, incluida la tipificación de mutaciones puntuales de SNP, inserciones y deleciones, así como la cuantificación de múltiples copias de genes que pueden ocurrir en algunos patrones de resistencia a los antimicrobianos. Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos de secuenciación.