Name: Pyrosequencing para la identificación microbiana y caracterización (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Aprende la técnica de pirosecuenciación para identificar bacterias mediante análisis de ADN ribosomal 16S. Este método permite secuenciar genomas microbianos y detectar mutaciones genéticas de resistencia antimicrobiana.

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Este proyecto se apoyó en parte por la Universidad Johns Hopkins, Oficina del Rector a través de la Iniciativa Científica Gateway y Qiagen Inc.

Introducción: Una sola colonia bacteriana se debe utilizar para inocular un caldo de cultivo apropiado que se incubó durante la noche. Un sedimento bacteriano se procesa a continuación para purificar ADN genómico usando un kit de aislamiento genómico disponibles comercialmente. El ADN genómico purificado debe tener una relación de 260/280 (nm)&gt; 1,8 para asegurar que la muestra está libre de contaminación de proteína. La cantidad de ADN genómico se requiere para la generación de la plantilla de pirosecuenciación es de 10-20 ng. A. Ampliación de la plantilla (Manual de PCR PyroMark; <a href="http://www.qiagen.com/handbooks" target="_blank">www.qiagen.com / manuales</a> 1) Configuración de la reacción de PCR Nota: Un cebador debe biotinilado en su extremo 5 &#39;, y se recomienda que sea HPLC purificada para la preparación de la plantilla. Recomendamos el PyroMark Ensayo Diseño de Software 2.0 para PCR y SEprimer diseño cuencia que están optimizados para la secuenciación de corta lectura, sin embargo, Primer-BLAST ( <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome" target="_blank">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome</a> ) de NCBI también puede ser utilizado para el diseño del cebador. <ol><li> Descongelar todas las soluciones requeridas (enumerados en la Tabla 1) y mezclar a fondo cada uno. Configurar la reacción de acuerdo con la Tabla 1. Todo el trabajo se puede realizar a temperatura ambiente. </li></ol> Nota: La mezcla maestra de PCR contiene MgCl 2 para una concentración final de 1,5 mM, que proporciona resultados satisfactorios en la mayoría de los casos. Si un mayor Mg 2 + de concentración se requiere, hasta 3,5 l de 25 mM de MgCl 2 se puede añadir a una reacción. <ol start="2"><li> Mezclar bien la mezcla de reacción con la pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo, luego dispensar volúmenes adecuados en tubos de PCR. </li><li> Añadir template ADN a cada tubo de PCR. Recomendamos 10 ng de ADN genómico. </li><li> Programe el termociclador de acuerdo a la Tabla 2. Un mantenimiento final a 4 º C se recomienda para la conveniencia. Si está utilizando un termociclador sin tapa térmica, las reacciones de superposición con 100 l de aceite mineral. </li><li> Coloque los tubos de PCR en el termociclador e iniciar el programa de ciclismo. </li></ol> B. Vacío Protocolo de estación de trabajo La inmovilización de los productos de PCR biotinilados <ol><li> Hacer una mezcla maestra de acuerdo con la Figura 4. </li></ol> Nota: Antes de pipeteado, agitar suavemente la botella de perlas de Sepharose recubiertas con estreptavidina para asegurar una suspensión homogénea. <ol start="2"><li> Dependiendo del volumen de producto de PCR utilizado, dispensar 60-75 mezcla maestra l en cada pocillo de una placa de PCR para dar un volumen total de 80 l por pocillo. </li><li> Añadir 5-20 l producto de PCR biotinilado a cada pocillo. </li><li> Selle los pocillos con cinta caps y agitar la placa de PCR a 1400 rpm durante 5-10 minutos a temperatura ambiente (15-25 ° C) utilizando un agitador orbital. </li></ol> La desnaturalización de ADN y la adición de cebador de secuenciación <ol><li> Diluir los cebadores de secuenciación a 0,3 mM con tampón de reasociación y dispensar 25 l en cada pocillo de una placa de reacción. Coloque la placa en la estación de trabajo. </li><li> Llenar los comederos de estaciones de trabajo de acuerdo con el diagrama de la figura 5. </li><li> Encienda la bomba de vacío, y asegúrese de que el interruptor de la herramienta de vacío está activada (Figura 6). Enjuague la sonda de filtro con agua de alta pureza (Milli-Q 18,2 MW x cm o equivalente) en el canal 5 (Figura 5). Vuelva a llenar la cubeta con agua de alta pureza fresca para su uso en el paso 12. </li><li> Trabajando rápidamente, coloque la placa de PCR con los granos en la estación de trabajo. Asegúrese de que ambas placas están en la misma orientación que cuando se cargaron las muestras. </li><li> Con el interruptor de vacío conectado, reduzca el vacíoherramienta en los pocillos de la placa de PCR de 20 segundos o hasta que todo el volumen ha sido aspirado. Las perlas serán capturadas por la herramienta de vacío (Figura 7). </li><li> Con el vacío todavía en ON, la herramienta de enjuague con etanol al 70% (a través de 1) durante 20 segundos o hasta que todo el volumen ha sido aspirado. </li><li> Con vacío conectado, lave la herramienta con una solución de desnaturalización (canal 2) durante 20 segundos o hasta que el volumen se ha aspirado. </li></ol> Nota: La solución de desnaturalización contiene hidróxido de sodio, que es un irritante de la piel y los ojos. Siempre use una bata de laboratorio, guantes y gafas de protección. <ol start="8"><li> Con vacío conectado, lave la herramienta con tampón de lavado (cubeta 3) durante 20 segundos o hasta que el volumen se ha aspirado. </li><li> Con vacío conectado, levante la herramienta de vacío a más de 90 ° en vertical durante 5 segundos, para permitir que todo el líquido se escurra fuera de la herramienta de vacío. Apague la bomba y alinear la herramienta de vacío con la placa de reacción. Mueva la herramienta de vacío en elpozos y agitar suavemente de un lado a otro para liberar las perlas en el cebador de secuenciación que contiene pozos. </li><li> Con el fin de limpiar la herramienta de vacío, agitar las sondas de filtro en agua de alta pureza (canal 4) para 10 seg. </li><li> Encienda la aspiradora y limpiar la herramienta con agua de alta pureza (canal 5) durante 20 segundos o hasta que el volumen se ha aspirado. </li><li> Levante la herramienta de vacío más allá de 90 ° C vertical, durante 5 segundos, luego cambia el vacío OFF y almacenar en la posición de &quot;estacionamiento&quot;. </li></ol> Recocido cebador de secuenciación a hebras de ADN <ol><li> Coloque la placa de reacción en un soporte de la placa precalentada. </li><li> Calentar la placa en un bloque de calentamiento a 80 ° C durante 2 min. </li><li> Retire la placa del soporte y el lugar en el mostrador para enfriar a temperatura ambiente durante 5 min. </li></ol> PyroMark Q24 Operación Nota: Encienda el instrumento con el interruptor de alimentación situado por encima del cable de alimentación. Estrellatup puede tardar hasta 1 minuto. <ol><li> Rellenar un cartucho según las instrucciones proporcionadas en el PyroMark Oro Q24 Reactivos Manual 2. Para determinar los volúmenes necesarios, configurar un archivo de ejecutar en el software del aparato, y en el menú Herramientas, seleccione Información Run Pre </li><li> Si el instrumento ya estaba en marcha, asegurarse de que no se está realizando una carrera y luego abra la tapa. Una señal acústica se emite si la tapa se abre cuando no es seguro hacerlo. </li><li> Abra la puerta del cartucho e inserte el cartucho con la etiqueta hacia arriba (Figura 8). Asegúrese de que el cartucho se ha insertado correctamente (una línea debe ser visible en la parte delantera) y cierre la puerta. </li><li> Abra el marco de la placa de sujeción y la posición de la placa con las muestras en el interior del instrumento. </li><li> Cierre el marco de la placa de sujeción y la tapa del instrumento (Figura 9). </li></ol> Inicio de una carrera <ol><li> Inserte la memoria USB con el archivo de ejecucións creado con el software del instrumento en el puerto USB en la parte frontal del instrumento. </li><li> Seleccione &quot;Ejecutar&quot; en el menú principal y pulse el botón &quot;OK&quot;. </li><li> Utilice las flechas de desplazamiento para seleccionar el archivo de ejecución deseado y pulse &quot;Seleccionar&quot;. </li></ol> Nota: El instrumento comenzará a dispensar reactivos cuando se alcanzan toda la presión preestablecida y temperatura (esto puede tardar varios minutos). Durante una ejecución, la pantalla muestra el instrumento de pirograma el pozo seleccionado en tiempo real. Utilice las flechas de desplazamiento para ver el pirograma de otros pozos. Completar una carrera <ol><li> Cuando el instrumento confirma que ha terminado la carrera y el archivo de ejecución se ha guardado en la memoria USB, pulse el botón &quot;Cerrar&quot;. </li><li> Retire el dispositivo USB. Si se retira antes de que termine la carrera, inserte la memoria USB. Seleccione &quot;Administración&quot; y luego &quot;Copiar Runs no guardados&quot;. </li><li> El archivo de ejecutar ahora se puede abrir y se analizó usando el software del instrumento y se comparaa una biblioteca de microbios conocidos usando el software Identifire. </li></ol>

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La producción y el libre acceso a este artículo es patrocinado por Qiagen. Autores Ahmed, Durocher, Jessen y Vardi son empleados de Qiagen Inc., que produce reactivos e instrumentos utilizados en este artículo.

Varios de los nuevos métodos de secuenciación de nueva generación se han comercializado. Tres de los métodos más ampliamente utilizados son la secuenciación de iones de semiconductores, la secuenciación de una sola molécula en tiempo real, y la secuenciación por síntesis (SBS). 3-11 Cada uno de estos métodos depende de secuenciación por síntesis, pero emplean plataformas novedosos para la detección de los nucleótidos incorporados. En la secuenciación de semiconductores de iones, una sola hebra de ADN sirve como molde para la secuenciación de hebra. 12 polimerasa y los nucleótidos se añaden secuencialmente como en pirosecuenciación. Cuando se añade un nucleótido a la cadena de ADN creciente, se libera un ion de hidrógeno. El ion hidrógeno es detectado por un sensor basado en transistor de efecto de campo. Secuenciación en tiempo real molécula individual depende de la guía de ondas modo cero (ZMW). 13 El ZMW es una pequeña estructura en la que una sola molécula de polimerasa se ​​une a la parte inferior del pozo. Se ilumina de una manera tal que una floremolécula de olor puede ser detectado. Cada nucleótido está etiquetado con una molécula fluorescente. En cuanto se incorpora un nucleótido marcado con fluorescencia, detector identifica el nucleótido. Cuando se añade el siguiente nucleótido, la molécula fluorescente se escinde. 14 La secuenciación por síntesis (SBS) utiliza un método único para amplificar el ADN diana de tal manera que grupos de secuencias únicas se generan. 15 plantillas de cadena sencilla se generan y luego se sintetiza la hebra complementaria. Cada nucleótido está marcado con una molécula fluorescente y después de cada adición de base se registra la fluorescencia de la base añadida.

Pirosecuenciación es un método rápido y preciso para la secuencia de ácidos nucleicos que se basa en el principio de &quot;secuenciación por síntesis&quot;. &quot;La secuenciación por síntesis&quot; implica el uso de una sola hebra molde de ADN para sintetizar la cadena complementaria de una base a la vez, y la detección de la base incorporada (A, T, G o C) en cada paso por la detección de una señal quimioluminiscente. La reacción pirosecuenciación incluye ADN molde, los dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferina, luciferasa, y apirasa. La reacción de síntesis se inició mediante la adición de uno de los cuatro dNTPs y ADN polimerasa a la plantilla de ADN biotinilado de cadena sencilla. ADN polimerasa incorpora el dNTP complementario en la plantilla, con la posterior liberación de pirofosfato (Figura 1). ATP sulfurilasa convierte proporcionalmente el pirofosfato de ATP. ATP actúa como un catalizador para la conversión mediada por la luciferasa de la luciferina a oxiluciferina, la cualgenera luz (Figura 2). La intensidad de la luz es proporcional al número de nucleótidos incorporados y determina si está presente en la cadena molde de forma secuencial (Figura 3) uno o más de dNTP específica (dATP, dTTP, dGTP, dCTP o). Cualquier dNTP no incorporada se degrada por apirasa antes de la adición de la siguiente dNTP para la continuación de la reacción de síntesis. Este &quot;secuenciación por síntesis&quot; reacción se repitió con la adición de cada uno de los cuatro dNTPs hasta que se determine la secuencia de ADN de la plantilla de ADN de cadena única. Para ver una animación de la reacción pirosecuenciación <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405movie1.mov" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película</a> .

<table><tbody><tr><td>PyroMark PCR Master Mix, 2x</td><td>Qiagen</td><td>978703</td><td></td></tr><tr><td>CoralLoad Concentrate, 10x</td><td>Qiagen</td><td>978703, 978705</td><td></td></tr><tr><td>Q-Solution, 5x</td><td>Qiagen</td><td>978703, 978705</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2, 25 mM</td><td>Qiagen</td><td>978703, 978705</td> imprimadores de 129112 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Qiagen</td><td>de agua sin RNasa</td></tr><tr><td></td>Los cebadores <td>Qiagen</td><td>978776 o 978777</td><td>deben comprarse a un fabricante de oligonucleótidos establecido (es decir, QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc.). Los cebadores liofilizados deben disolverse en TE para proporcionar una solución madre de 100 &mu;M.</td></tr><tr><td>Pyromark Gold Q24 Reactivos</td><td>Qiagen</td><td>970802</td><td></td></tr><tr><td>Agua de alta pureza (Milli-Q 18.2 M&Omega; x cm o equivalente)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina Sepharose Perlas de alto rendimiento</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5113-07</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de recocido PyroMark</td><td>Qiagen</td><td>979009</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Solución de desnaturalización</td><td>Qiagen 979007</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lavado PyroMark</td><td>Qiagen 979008</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24</td><td>Qiagen</td><td>9001514</td><td></td></tr><tr><td>Cartucho PyroMark Q24</td><td>Qiagen 979202</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q96 HS Caja portapuntas</td><td>Qiagen</td><td>979105</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24 Estación de trabajo de vacío</td><td>Qiagen</td><td>9001516</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24 Soporte de placas</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td>9022273</tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>Fisher</td><td>11-675-297</td><td></td></tr><tr><td>Bloque de calor</td><td>Fisher</td><td>11-718Q</td><td></td></tr></tbody></table>

pyrosequencing para la identificación microbiana y caracterización

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pirosecuenciación es una técnica versátil que facilita la secuenciación del genoma microbiano que se puede utilizar para identificar las especies bacterianas, discriminar las cepas bacterianas y detectar las mutaciones genéticas que confieren resistencia a los agentes anti-microbianos. Las ventajas de pirosecuenciación para aplicaciones de microbiología incluyen cribado de alto rendimiento rápido y fiable y precisa identificación de los microbios y las mutaciones del genoma microbianas. Pyrosequencing implica la secuenciación de ADN mediante la síntesis de la cadena complementaria de una sola base en un momento, mientras que la determinación del ser específica de nucleótidos incorporados durante la reacción de síntesis. La reacción se produce en inmovilizada plantilla de ADN de cadena sencilla en donde se añaden los cuatro desoxirribonucleótidos (dNTP) secuencialmente y los dNTPs no incorporados se degrada enzimáticamente antes de la adición de la siguiente dNTP a la reacción de síntesis. Detección de la base específica incorporado a la plantilla se controla por la generación de chemilumseñales inescent. El orden de dNTPs que producen las señales quimioluminiscentes determina la secuencia de ADN de la plantilla. La capacidad de secuenciación en tiempo real de la tecnología de pirosecuenciación permite la rápida identificación microbiana en un único ensayo. Además, el instrumento pirosecuenciación, puede analizar la diversidad genética completa de la resistencia a los medicamentos anti-microbiana, incluida la tipificación de SNPs, mutaciones puntuales, inserciones y deleciones, así como la cuantificación de múltiples copias de genes que pueden producirse en un poco de resistencia antimicrobiana patrones.

Los resultados de una ejecución típica pirosecuenciación usando el software muestra la ubicación de los cebadores directo e inverso usados ​​para la generación de amplicón, y el cebador de secuenciación utilizado para la reacción pirosecuenciación dentro de la secuencia 16S ribosómica conservado (Figura 10). La secuencia hipervariable entre el cebador permite a los sitios para la identificación de bacterias de un gran número de especies bacterianas utilizando el cebador de secuenciación conservada (5&#39;-TACATGCAAGTCGA). Como un control de calidad interno, la secuencia de ADN horquillado la región variable puede ser comprobado para asegurar que la región de ADN correcta se ha analizado . El software de pirosecuenciación permite la comparación y la alineación de la secuencia generada a una base de datos interna de secuencias ribosómicas bacterianas para la identificación bacteriana. Además, una secuencia puede ser analizada para determinar las mutaciones que confieren resistencia a los antibióticos. Por ejemplo, el análisis de mutaciones en los genes ribosómicos 23S de Helicobpylori rácter muestra dos patrones de mutación (GAA o AGA) que confieren resistencia a los antibióticos (Figura 11). Análisis de múltiples aislados de la misma paciente puede ser ensayada simultáneamente para realizar un seguimiento de la aparición de resistencia a los medicamentos en el tiempo para ayudar en las investigaciones epidemiológicas de brotes de resistencia a fármacos microbianos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig1.jpg" /> Figura 1. Producto de PCR biotinilado se utiliza como una plantilla para incorporar dNTPs por la ADN polimerasa, lo que lleva a la generación de pirofosfato (PPi). <img alt="La figura 2" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig2.jpg" /> Figura 2. ATP sulfurilasa convierte proporcionalmente pirofosfato de ATP. Actos ATP como un catalizador para la conversión mediada por la luciferasa de la luciferina a oxiluciferina, la cual genera luz que es Proproporcional a la cantidad de ATP. La luz se registra como máximo en la traza pirograma e indica la incorporación de nucleótidos. Los dNTPs no incorporados son degradados por apirasa antes de añadir el siguiente dNTP para la continuación de la síntesis. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig3.jpg" /> Figura 3. La intensidad de la luz generada indica si se incorpora una o más de dNTP específica (dATP, dTTP, dGTP, dCTP o) sobre la cadena molde secuencialmente. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig4.jpg" /> La Figura 4. Diagrama de flujo para la preparación de la mezcla maestra para inmovilizar el producto de PCR biotinilado. <img alt="La figura 5" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig5.jpg" /> ge = &quot;always&quot;&gt; Figura 5. PyroMark estación de trabajo, con la placa de PCR, placa PyroMark y lugares mínimas. <img alt="La figura 6" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig6.jpg" /> La Figura 6. Localización del interruptor de vacío posiciones ON y OFF. <img alt="La figura 7" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig7.jpg" /> Figura 7. Herramienta de vacío. Manejo adecuado de la herramienta de vacío. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig8.jpg" /> Figura 8. Abrió la puerta del cartucho con el cartucho en su lugar. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig9.jpg" /> La Figura 9. Cartucho insertado correctamente con la puerta cerrada. &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig10.jpg" /> La Figura 10. Pyrosequencing resultados de la identificación de bacterias basados ​​en. Cebadores de la PCR están diseñados para regiones conservadas de la plantilla de ADN, y el cebador de secuenciación se coloca inmediatamente aguas arriba de la identificación de una secuencia de ADN hipervariable bien caracterizado en el amplicón (que se muestra en azul). <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig11.jpg"/> La Figura 11. La detección de la resistencia a los antibióticos en Helicobacter pylori mediante pirosecuenciación. Análisis de mutaciones en los genes 23S que confieren resistencia antibacteriana en Helicobacter pylori contiene GAA o secuencias de AGA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405fig11large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . <table border="1"><tbody><tr> &lt;td&gt; Componente </td><td> Volumen por reacción </td><td> La concentración final </td></tr><tr><td> Pyro PCR Master Mix, 2x </td><td> 12,5 l </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Concentrado CoralLoad, 10x </td><td> 2,5 l </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl 2 (opcional) </td><td> Variable </td><td> ≥ 1,5 mM </td></tr><tr><td> Q-Solution, 5x (opcional) </td><td> 5 l </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Primer A / Primer B </td><td> Variable / Variable </td><td> 0.2 μM/0.2 mM </td></tr><tr><td> RNasa libre de agua </td><td> Variable </td><td> - </td></tr><tr><td> Volumen Total (después de añadir ADN molde) </td><td> 25 l </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Mezcla de reacción de PCR. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Y nbsp; </td><td></td><td> Comentarios adicionales </td></tr><tr><td> Etapa de activación inicial de PCR </td><td> 15 min </td><td> 95 ° C </td><td> HotStartTaq ADN polimerasa se activa </td></tr><tr><td> 3 etapa de ciclo: desnaturalización </td><td> 30 seg </td><td> 94 ° C </td><td></td></tr><tr><td> Recocido </td><td> 30 seg </td><td> 60 ° C 56 ° C </td><td> Para el ADN genómico Para bisulfito de ADN convertido </td></tr><tr><td> Extensión </td><td> 30 seg </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr><tr><td> Número de ciclos </td><td> 45 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> La extensión final </td><td> 10 min </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 2. Especificaciones del ciclo de PCR.

Pirosecuenciación es una técnica versátil que facilita la secuenciación del genoma microbiano que se puede utilizar para identificar las especies bacterianas, discriminar las cepas bacterianas, y detectar las mutaciones genéticas que confieren resistencia a los agentes anti-microbianos. En este vídeo, se demostrará el procedimiento para la generación de amplicón microbiana, amplicón pirosecuenciación, y el análisis de secuencia de ADN.

Pyrosequencing para la identificación microbiana y caracterización

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

El objetivo general del siguiente experimento es identificar una bacteria mediante el análisis de la secuencia de ADN ribosómico 16 s utilizando la metodología de pirosecuenciación. Esto se logra primero amplificando el ADN diana mediante una reacción en cadena de la polimerasa usando un cebador biotinilado. Luego, el amplicón biotinilado se inmoviliza utilizando esferas de perlas recubiertas con estreptavidina y se purifica usando tampones de lavado.A continuación, el amplicón se desnaturaliza y los cebadores para la secuenciación ribosómica 16 s se unen a las cadenas simples de ADN. El objetivo de este paso es preparar el ADN para la secuenciación. Finalmente, la reacción de secuenciación de ADN tiene lugar mediante pirosecuenciación, un método rápido y preciso para secuenciar ácidos nucleicos basado en el principio de secuenciación por síntesis.El alicón biotinilado se utiliza como molde por la ADN polimerasa para incorporar dNTPs una base a la vez, lo que conduce a la generación de pirofosfato. La ATP sulfuriaca convierte proporcionalmente el pirofosfato en ATP, y el ATP cataliza la conversión mediada por luciferasa de luciferina en oxiluciferina, lo que genera luz proporcional a la cantidad de ATP. La luz se registra como un pico en el trazado pirosecuenciador e indica la incorporación del nucleótido. Los dNTPs no incorporados son degradados por apirasa antes de que se añada el siguiente dNTP para continuar la síntesis.La señal quimioluminiscente registrada en el programa permite determinar la secuencia de ADN. Los resultados obtenidos son secuencias de ADN ribosómico 16S, que se utilizan para identificar la bacteria mediante comparación con una base de datos de referencia de ADN ribosómico. La pirosecuenciación es una técnica versátil que facilita la secuenciación del genoma microbiano y puede emplearse para identificar especies bacterianas, discriminar cepas bacterianas y detectar mutaciones genéticas que confieren resistencia a agentes antimicrobianos.En este video, se demostrará el procedimiento para la generación de amplicones bacterianos, la pirosecuenciación de amplicones y el análisis de secuencias de ADN. Para comenzar el procedimiento de amplificación de la plantilla, descongele todas las soluciones necesarias y mezcle cada una completamente. Todo el trabajo puede realizarse a temperatura ambiente. Prepare la reacción de PCR según esta tabla.Téngase en cuenta que una concentración final de cloruro de magnesio de 1,5 milimolar proporcionará resultados satisfactorios en la mayoría de los casos. Sin embargo, si se requiere una concentración más alta de magnesio, se pueden añadir hasta 3,5 microlitros de cloruro de magnesio 25 milimolar a la reacción. Uno de los cebadores debe estar biotinilado en su extremo cinco prima, y se recomienda que el cebador sea purificado completamente por HPLC.Mezcle la mezcla de reacción pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo, y luego distribuya volúmenes adecuados en tubos para PCR. A continuación, agregue ADN molde a cada tubo de PCR. Se recomiendan 10 nanogramos de ADN genómico por reacción.Coloque los tubos de PCR en un termociclador e inicie este programa de ciclado antes de preparar la mezcla maestra. Agite suavemente el frasco de estreptavidina y perlas recubiertas de seros para asegurar una suspensión homogénea. Prepare una mezcla maestra de acuerdo con este diagrama de flujo.Combinar perlas, tampón de unión y agua de alta pureza en un tubo de microcentrífuga. Dependiendo del volumen del producto de PCR utilizado, dispensar entre 60 y 75 microlitros de la mezcla maestra en cada pocillo de una placa de PCR, de modo que el volumen total sea de 80 microlitros por pocillo. Añadir entre cinco y veinte microlitros del producto de PCR biotinilado a cada pocillo.El volumen por pocillo ahora debe ser de 80 microlitros. Selle los pocillos con tapas en tira y agite la placa de PCR a 1.400 RPM durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente utilizando un agitador orbital. Comience este procedimiento diluyendo los cebadores de secuenciación hasta 0,3 micromolar con un tampón amortiguador y dispensando 25 microlitros en cada pocillo de la placa de reacción.Coloque la placa en la estación de vacío. Llene las canaletas de la estación según este diagrama: 50 mililitros de etanol al 70% en la canaleta uno, 40 mililitros de solución de desnaturalización en la canaleta dos, 50 mililitros de tampón de lavado en la canaleta tres, 50 mililitros de agua de alta pureza en la canaleta cuatro y 70 mililitros de agua de alta pureza en la canaleta cinco.Encienda la bomba de vacío y asegúrese de que el interruptor en la herramienta de vacío esté configurado en "on" para lavar las sondas del filtro con agua de alta pureza. En el canal cinco, coloque la placa de PCR con perlas en la estación de trabajo, asegurándose de que tanto la placa de PCR como la placa de reacción tengan la misma orientación. Baje la herramienta de vacío dentro de los pocillos de la placa de PCR.Durante 20 segundos o hasta que todo el volumen haya sido aspirado, las perlas serán capturadas por la herramienta de vacío con el vacío aún activado. Enjuague la herramienta con etanol al 70 % durante 20 segundos o hasta que todo el volumen haya sido aspirado. A continuación, enjuague la herramienta con la solución de desnaturalización durante 20 segundos o hasta que todo el volumen haya sido aspirado.A continuación, enjuague la herramienta con tampón de lavado durante 20 segundos o hasta que todo el volumen haya sido aspirado con la bomba de vacío aún encendida. Eleve la herramienta de vacío a más de 90 grados respecto a la vertical durante cinco segundos para permitir que todo el líquido drene fuera de la herramienta. Ahora apague la bomba y alinee la herramienta de vacío con la placa de reacción de tres pocillos.Baje la herramienta de vacío en los pozos. Luego, agite suavemente de un lado a otro durante aproximadamente 10 segundos para liberar las perlas en los pozos que contienen el cebador de secuenciación. Coloque la herramienta de vacío en la cubeta de agua para limpiarla y así anillar el cebador de secuenciación al ADN.Coloque la placa de reacción en un soporte para placas precalentado. Caliente la placa a 80 grados Celsius durante dos minutos. Retire la placa del soporte y colóquela sobre la superficie de trabajo para enfriarla a temperatura ambiente durante cinco minutos.Comience este procedimiento encendiendo el instrumento mediante el interruptor de alimentación situado encima del cable de alimentación para determinar los volúmenes necesarios. Configure un archivo de corrida en el software del instrumento y, en el menú de herramientas, seleccione la información previa a la corrida. Llene un cartucho según las instrucciones proporcionadas en la página de información previa a la corrida.Coloque la punta de la pipeta en la esquina de cada pocillo lo más abajo posible, asegurándose de que no haya burbujas de aire. Abra la compuerta del cartucho e inserte el cartucho con la etiqueta hacia adelante. Asegúrese de que el cartucho esté correctamente insertado y cierre la compuerta.Abra el marco de sujeción de la placa y coloque la placa de reacción dentro del instrumento. Cierre el marco de sujeción de la placa y la tapa del instrumento. Inserte la memoria USB con los archivos de corrida creados con el software del instrumento en el puerto USB situado en la parte frontal del instrumento.Aceptable para ver el menú de los archivos de corrida deseados. Utilice las flechas de desplazamiento para seleccionar el archivo de corrida deseado y presione seleccionar. Cuando se alcancen todos los niveles preestablecidos de presión y temperatura, el instrumento comenzará a dispensar los reactivos durante una corrida.La pantalla del instrumento muestra en tiempo real la piro del pocillo seleccionado. Utilice las flechas de desplazamiento para ver las piro de otros pocillos. Cuando el instrumento confirme que la corrida ha finalizado y que el archivo de la corrida se ha guardado en la memoria USB, presione cerrar.Retire el dispositivo USB. Aquí se muestran los resultados de un ensayo típico de secuenciación por pirosecuenciación. Los cebadores de PCR directo y reverso se diseñan para regiones conservadas de la plantilla de ADN, que es la secuencia ribosómica 16 s.En este ejemplo, el cebador de secuenciación se sitúa inmediatamente aguas arriba de una secuencia de ADN hipervariable identificativa bien caracterizada dentro del amplicón mostrado en azul. Esta secuencia hipervariable permite la identificación bacteriana de un gran número de especies bacterianas; utilizando el cebador de secuenciación conservado como control interno de calidad, se puede verificar la secuencia de ADN que flanquea la región variable para asegurar que se ha analizado la región de ADN correcta. El software de pirosecuenciación permite la comparación y alineación de la secuencia generada con una base de datos interna de secuencias ribosomales bacterianas para la identificación bacteriana.Además, se puede analizar una secuencia para determinar las mutaciones que confieren resistencia a fármacos antibióticos. Por ejemplo, el análisis de mutaciones en los genes ribosomales 23 s de Helicobacter pylori revela dos patrones de mutación, GAA o una GA, que confieren resistencia a antibióticos. La pirosecuenciación es una técnica versátil que facilita la secuenciación del genoma microbiano.Las ventajas de la pirosecuenciación en aplicaciones de microbiología incluyen la realización rápida y confiable de cribados de alto rendimiento y la identificación precisa de microorganismos y mutaciones en sus genomas. Además, la metodología de pirosecuenciación puede analizar la diversidad genética completa de la resistencia a fármacos antimicrobianos, incluyendo la tipificación de mutaciones puntuales de SNPs, inserciones y deleciones, así como la cuantificación de múltiples copias génicas que pueden presentarse en ciertos patrones de resistencia antimicrobiana. Gracias por ver este video y le deseamos mucho éxito en sus experimentos de secuenciación.

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Investigación

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Biología

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La identificación de bacterias metabólicamente activas en el intestino de la Generalista<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Vía ADN isótopos estables Uso<sup&gt; 13</sup&gt; C-glucosa

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Efficient Nucleic Acid Extracción y 16S rRNA genes de secuenciación para bacteriana Comunidad Caracterización

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Pyrosequencing para la identificación microbiana y caracterización

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