Un ensayo cuantitativo para estudiar proteínas: DNA Interacciones, reguladores Descubra transcripcional de la expresión génica, e identificar agentes antitumoral

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un ensayo cuantitativo de unión al ADN, que es útil para examinar las interacciones entre proteínas y ADN, descubrir reguladores transcripcionales de la expresión génica e identificar nuevos agentes antitumorales. Esto se logra preparando primero una placa de ensayo recubierta de estreptavidina con un objetivo de ADN BIOTINILADO apropiado. El segundo paso es añadir proteínas de extracto nuclear con o sin inhibidores potenciales y permitir que se unan con el objetivo del ADN.

A continuación, se detectan los factores de transcripción unidos con anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios acoplados a peroxidasa de rábano picante. El paso final es agregar un sustrato de peroxidasa de rábano picante a los pocillos para provocar el desarrollo del color. En última instancia, el desarrollo del color se mide con el espectrofotómetro.

Con el tiempo, la cantidad de cambio de color indicará el grado de unión al ADN y el efecto de los posibles inhibidores de la unión al ADN. La principal ventaja de esta técnica sobre otras técnicas, como el ensayo de desplazamiento de la movilidad electroforética, es que se trata de un ensayo cuantitativo de unión a inhibidores del ADN. Para comenzar, prepare un número adecuado de cultivos celulares que consistan en al menos tres veces 10 a las siete células para cada condición probada.

En este caso, se utilizan células endoteliales de médula ósea humana, que expresan la proteína run X two. Una vez que las células están confluentes en un 80%. Trate las células con 0,2 microgramos por mililitro, sin conazol para detener el crecimiento celular en el límite del ciclo celular G dos M.

Esto estabilizará la proteína run X two y producirá la máxima unión al ADN después de 16 horas. Limente las células y aísle la proteína como se indica en el protocolo de texto adjunto. Una vez que se haya aislado la proteína, mida la concentración de proteína utilizando un ensayo estándar de BCA.

A continuación, almacene las muestras a menos 80 grados centígrados en alícuotas de 10 microlitros con concentraciones entre dos y cinco miligramos por mililitro. Fije una placa de 96 pocillos con una solución 0,1 molar de carbonato de sodio agregando 300 microlitros de la mezcla por hora. Bien Prepare lo suficientemente bien para que cada muestra se ejecute por triplicado.

Incubar la placa durante dos horas en una plataforma mecedora a temperatura ambiente. A continuación, lave la placa tres veces con 300 microlitros de estreptococos ávidos y tampón de lavado e incube con 100 microlitros de oligonucleótidos bicatenarios marcados con biotina a 1,25 nanomoles por pocillo durante dos horas mientras se balancea. A continuación, lave las placas tres veces más con el tampón de lavado estreptococo.

A continuación, añada 100 microlitros por pocillo de la mezcla maestra que contenga un tampón de unión a XDNA, proteínas de unión al ADN de tres a nueve microgramos por pocillo y poly DIGC a un microgramo por pocillo. A continuación, añadir a sus respectivos pocillos la mezcla maestra que contenga cualquier inhibidor potencial como la vitamina D 3 o la dilución adecuada del disolvente control, como el etanol. Luego cubra la placa y colóquela en una plataforma oscilante a cuatro grados centígrados durante la noche siguiente a la incubación con los extractos nucleares.

Lave la placa tres veces con el tampón ávido de estreptococos y lavado. A continuación, añada 90 microlitros por pocillo de un anticuerpo monoclonal específico diluido a 0,2 nanogramos por microlitro y tampón ávido de estreptococos y lavado. Cubra la placa e incube a temperatura ambiente en una plataforma mecedora durante una hora.

A continuación, enjuague los pocillos de nuevo con tampón de lavado y ávido de estreptococos y añada 90 microlitros por pocillo de la mezcla de anticuerpos secundarios que contiene cinco nanogramos por microlitro de anticuerpo conjugado HRP purificado por afinidad específica fabulosa diluido en el estreptococo. AVID y tampón de lavado. Incubar el anticuerpo secundario durante 30 minutos a temperatura ambiente en una plataforma oscilante.

A continuación, lávelo seis veces con 300 microlitros por pocillo de Strp y tampón de lavado. A continuación, desarrolle los resultados añadiendo 50 microlitros de un sustrato de tetraetilo benadina a cada pocillo directamente desde la botella de almacenamiento para un seguimiento continuo de las muestras. Coloque las muestras en el espectrofotómetro y mida la absorbancia a 635 nanómetros de forma continua.

Para una medición única, incube las muestras durante 10 a 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Durante este tiempo, los pozos deben cambiar de claros a diversos grados de azul. Detenga la reacción agregando 50 microlitros de ácido sulfúrico a cada uno.

A continuación, mida la absorbancia de cada pocillo a 450 nanómetros utilizando un lector de placas de 96 pocillos. El gráfico que se muestra aquí es un ejemplo de monitorización continua del efecto de la vitamina D tres biológicamente activa en la unión de NA Run X 2D. Las concentraciones ensayadas tuvieron poco efecto sobre la unión de NA Run X 2D.

Aunque se ha demostrado que otros compuestos de vitamina D tres tienen efectos dramáticos. El compuesto 5 2 2 1 9 7 5 analizado aquí se identificó mediante el diseño de fármacos asistido por ordenador. Tras las pruebas, el compuesto exhibió una inhibición dependiente de la dosis de la unión de rux dos de un nanomolar a 100 micromolares El 50% de la unión de renx 2D NA pudo inhibirse con solo 0,01 micromolares del compuesto.

Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo realizar el ensayo de unión al ADN y probar los posibles inhibidores de la unión al ADN.