Un ensayo cuantitativo para estudiar proteínas: DNA Interacciones, reguladores Descubra transcripcional de la expresión génica, e identificar agentes antitumoral

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un ensayo cuantitativo de unión al ADN, útil para examinar las interacciones proteína-ADN, descubrir reguladores transcripcionales de la expresión génica y detectar nuevos agentes anti-tumorales. Esto se logra primero preparando una placa de ensayo recubierta con estreptavidina y un objetivo de ADN BIOTINILADO adecuado. El segundo paso consiste en añadir proteínas de extracto nuclear con o sin inhibidores potenciales y permitir que se unan al objetivo de ADN.

A continuación, los factores de transcripción unidos se detectan mediante anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios acoplados a peroxidasa de rábano picante. El último paso consiste en añadir un sustrato de peroxidasa de rábano picante a los pocillos para inducir el desarrollo del color. Finalmente, el desarrollo del color se mide con el espectrofotómetro.

Con el tiempo, la cantidad de cambio de color indicará el grado de unión al ADN y el efecto de posibles inhibidores de dicha unión. La principal ventaja de esta técnica frente a otras, como el ensayo de retardo en electroforesis, es que se trata de un ensayo cuantitativo de unión de inhibidores al ADN. Para comenzar, prepare un número adecuado de cultivos celulares que consten de al menos tres veces 10 a la siete células para cada condición evaluada.

Aquí se utilizan células endoteliales de médula ósea humana, que expresan la proteína run X dos. Una vez que las células alcancen el 80 % de confluencia, trátelas con 0,2 microgramos por mililitro de no conazol para detener el crecimiento celular en el límite del ciclo celular G dos M.

Esto estabilizará la proteína de la corrida X dos y producirá una unión máxima al ADN después de 16 horas. Lise las células y aísle la proteína según lo indicado en el protocolo de texto adjunto. Una vez que la proteína haya sido aislada, mida la concentración de proteína utilizando un ensayo BCA estándar.

Luego, almacene las muestras a menos 80 grados Celsius en alícuotas de 10 microlitros con concentraciones entre dos y cinco miligramos por mililitro. Fije una placa de 96 pocillos con una solución 0,1 molar de carbonato de sodio agregando 300 microlitros de la mezcla por pocillo. Prepare suficientes pocillos para que cada muestra se analice por triplicado.

Incube la placa durante dos horas en una plataforma agitadora a temperatura ambiente. A continuación, lave la placa tres veces con 300 microlitros de tampón de lavado de estreptavidina y luego incube con 100 microlitros de oligonucleótidos bicatenarios marcados con biotina a 1,25 nanomoles por pocillo durante dos horas, agitando. A continuación, lave las placas tres veces adicionales con el tampón de lavado de estreptavidina.

Luego, agregue 100 microlitros por pocillo de la mezcla maestra que contiene un tampón de unión a ADN, proteínas de unión al ADN a tres o nueve microgramos por pocillo y poli DIGC a un microgramo por pocillo. A continuación, agregue la mezcla maestra que contiene cualquier inhibidor potencial, como la vitamina D3, o la dilución adecuada del control del disolvente, como etanol, a sus respectivos pocillos. Luego, cubra la placa y colóquela sobre una plataforma agitadora a cuatro grados Celsius durante la noche, tras la incubación con los extractos nucleares.

Lave la placa tres veces con el tampón de lavado strep avid. Luego, añada 90 microlitros por pozo de un anticuerpo monoclonal específico de tipo run X2 diluido a 0,2 nanogramos por microlitro en tampón de lavado strep avid. Tape la placa e incúbela a temperatura ambiente en una plataforma agitadora durante una hora.

Luego enjuague nuevamente los pocillos con strep avid y tampón de lavado, y agregue 90 microlitros por pocillo de la mezcla de anticuerpo secundario que contiene cinco nanogramos por microlitro de anticuerpo conjugado con HRP, específico para fab, purificado por afinidad, diluido en strep. AVID y tampón de lavado. Incube el anticuerpo secundario durante 30 minutos a temperatura ambiente en una plataforma agitadora.

Luego, lávese seis veces con 300 microlitros por pocillo de tampón de lavado Strp. A continuación, desarrolle los resultados añadiendo 50 microlitros de un sustrato de tetraetil bencidina a cada pocillo directamente desde el frasco de reserva para el monitoreo continuo de las muestras. Coloque las muestras en el espectrofotómetro y mida la absorbancia a 635 nanómetros de forma continua.

Para una medición única, incube las muestras durante 10 a 20 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad. Durante este tiempo, los pocillos deben cambiar de transparente a distintos grados de azul. Detenga la reacción añadiendo 50 microlitros de ácido sulfúrico a cada uno.

Luego, mida la absorbancia de cada pocillo a 450 nanómetros utilizando un lector de placas de 96 pocillos. La gráfica mostrada aquí es un ejemplo del monitoreo continuo del efecto de la vitamina D tres biológicamente activa sobre la unión de run X 2D NA. Las concentraciones ensayadas tuvieron poco efecto sobre la unión de run X 2D NA.

Aunque se ha demostrado que otros compuestos de vitamina D tres tienen efectos dramáticos, el compuesto 5 2 2 1 9 7 5 probado aquí fue identificado mediante el diseño asistido por computadora de fármacos. Tras la evaluación, el compuesto mostró una inhibición dependiente de la dosis del enlace rux dos, desde un nanomolar hasta 100 micromolar; el 50% de la unión de renx 2D NA pudo inhibirse con tan solo 0,01 micromolar del compuesto.

Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo realizar el ensayo de unión al ADN y probar inhibidores potenciales de la unión al ADN.