Transformación bacteriana: Electroporación
Transformación bacteriana es un proceso natural, en el cual las bacterias ingieren ADN extraño y luego amplificarán o clonación. En el laboratorio, este proceso puede ser inducido artificialmente, mediante el uso de pulsos de campo eléctrico de alto voltaje para crear poros en la membrana celular bacteriana, a través de la cual el plásmido ADN puede pasar. La electroporación se refiere a este método y en el siguiente vídeo se demuestra sus principios, procedimiento paso a paso y aplicaciones.
Antes de hablar de la electroporación de bacterias, es importante entender el tipo de ADN utilizado en estos experimentos: el plásmido. Un plásmido es un pequeño, circular, extracromosómico de ADN que actúa como un vector, un portador de su secuencia de ADN específica.
Si esta secuencia es un gene para una proteína de la fluorescencia en Medusa o una enzima de las plantas, se inserta en el plásmido por medio de una región llamada la múltiple clonación sitio o MCS. Esta región contiene secuencias específicas que están divididas por restricción de endonucleasas o enzimas de restricción. Las mismas enzimas de la restricción puede utilizarse para cortar la secuencia de interés para que los extremos son complementarios a los extremos recién cortados del plásmido.
Plásmidos también contienen un origen de replicación, abreviado ORI, que indica el punto en el que se replicará. Cuando se trata de la transformación el gen de resistencia a los antibióticos es de vital importancia. Como su nombre lo indica este gen permite que las bacterias producen una enzima que neutraliza el antibiótico, lo que les permite sobrevivir en medios que contienen antibióticos.
Electroporación hace uso de un dispositivo especializado llamado un electroporator. Normalmente las células se colocan en una cubeta de electroporación, que tiene electrodos en cada lado que hacen contacto eléctrico con la máquina una vez insertada.
Mezclado con ADN de células bacterianas se cargan en la cubeta de electroporación y se aplica un campo eléctrico en el pedido de una 1000 a 10.000 voltios por centímetro durante unas milisegundos. Esto hace que la tensión a través de la membrana alcance 0.5-1 voltios, que se cree que conducen a un cambio del phospolipid bilayer que consta de la membrana celular que forman los poros. En este plásmido estado ADN pasará a través de la membrana y cuando termine pulsar la bicapa repararse a sí mismo.
Después de haber tomado el plásmido, pueden entonces desarrollarse bacterias en placas de agar que contiene antibióticos.
Ahora que hemos aprendido sobre los plásmidos y el mecanismo de la electroporación. Vamos a echar un vistazo a cómo se realiza el procedimiento.
Las células que pueden fácilmente tomar el ADN se conocen como células competentes. El tipo más común de bacterias competentes que se transforma en investigación de biología molecular es e. coli, las bacterias procariotas que tienen su hogar en su intestino inferior. E. coli que se preparan para la electroporación se denominan células de espectro.
Cuando maneje las bacterias, asegúrese de que el área de trabajo es tan limpio como sea posible.
Manipulación de bacterias también requiere una técnica aséptica una práctica. Esto implica típicamente el uso de un mechero de Bunsen para esterilizar instrumentos y crear una convección actual – que mantiene contaminantes en el aire lejos del área de trabajo.
Inmediatamente antes de la electroporación, medios precalentamiento a temperatura ambiente, llevar las placas de agar que contiene antibiótico a 37 ° C y cubetas de electroporación fresco en hielo.
A continuación, descongelar células lavadas espectro en hielo.
Agregar 1-5uL de plásmido frío 1ng/μ que es sal gratis a las células bacterianas, mezclar suavemente y añadir la mezcla a la cubeta fría. Asegúrese de que no hay burbujas.
Establece la fuerza de tensión y campo de la electroporator en la configuración correcta para sus células. Aquí puede ver un electroporator está situado a 1700 voltios y produciendo una fuerza de campo de 17kV/cm.
Seque el exterior de la cubeta y colocar en el electroporator. Pulso de las células hasta que escuche un sonido.
Pulsación provoca una descarga eléctrica, que es observable como una chispa visible y audible pop. Esta descarga, conocida como arco eléctrico, puede ser el resultado de tener demasiada sal en tus células competentes o ADN.
Señalando la constante de tiempo, que es la duración que tarda la tensión decaiga después de aplicar el pulso se puede predecir el éxito de su transformación. Cuando la sal está presente y la electroporación solución es muy conductora, el decaimiento ocurre rápidamente, causando la descarga y así matando a muchas de sus células. Para bacterias, rango de constantes de tiempo de 5 a 10 milisegundos.
Inmediatamente después de la pulsación, sacar la cubeta y añadir 1 ml de medios de comunicación directamente a las células. Esta célula que contiene los medios de comunicación se coloca en un tubo y se incubó a 37° C durante 1 hora, con agitación, en el orden de las células a recuperar.
Luego, utilizando una técnica aséptica Añadir 20-200uL de la célula a un antibiótico que contiene la placa de agar. Invertir las placas para que el agar está en la parte superior y para que condensación no caiga en tus células e incubar durante una noche a 37° C.
Las bacterias transformadas con el plásmido deben formar colonias. Contar las colonias y calcular la eficiencia de transformación, que es el número de transformantes éxito dividido por la cantidad total de ADN plateado.
El agar y medios de comunicación, que proporcionan la nutrición para la bacteria, deben ser previamente preparado y esterilizado mediante autoclave. Permite medio líquido a enfriar a temperatura ambiente antes de usar y deje enfriar el agar a 50-55˚C – la temperatura a la que pueden añadirse antibióticos y vertieron de placas. Luego, deje que platos se enfríen a temperatura ambiente para solidificar.
Puesto que las bacterias utilizadas en la transformación se almacenan en el congelador, primero debe descongelar en el hielo, extender sobre una placa de agar sin antibióticos y luego crecido durante la noche en 37˚C.
Utilizando una técnica aséptica Seleccione una colonia de bacterias de la placa de agar y crecer en una cultura más grande de 500mL durante la noche a 37° C en un incubador de agitación.
Mientras que las células crecen, prepare sobre un litro de agua desionizada y hacen un 10% de glicerol y agua, volumen a volumen de solución. Autoclave de las soluciones y se dejan enfriar a 4.
Las mediciones de absorbancia se utilizan para determinar si es o no la bacteria en su mediados fase logarítmica de crecimiento, lo cual significa que fácilmente se ocupan de ADN. Una vez que las células han alcanzado esta fase, coloque en hielo y mantenerlos allí durante todo el procedimiento.
A continuación, lave las células mediante la separación en dos tubos de centrífuga de gran vuelta a 4° C, retirar el sobrenadante y resuspender en frio 100mL de agua desionizada estéril. Repita este paso por lo menos una vez más. El propósito de este paso particular es quitar la sal, que afectará fuertemente a la técnica de electroporación.
Realizar dos lavados adicionales en 50 ml de glicerol al 10% en agua y finalmente resuspender las bacterias de esta misma solución.
Añadir 50μL de células en múltiples tubos Eppendorf. Estas células están ahora listas para uso de electroporación y deben conservarse a 4. O pueden ser flashes congelado y almacenado a - 80˚C.
Como usted está a punto de ver, electroporación tiene muchas aplicaciones.
Una alternativa a la electroporación es transformación de choque de calor, que se basa en la exposición de las bacterias al calor y cloruro de calcio para introducir ADN en tus células.
En general, el choque térmico es más suave en sus bacterias de electroporación y no requiere bajo en sal. Las reacciones de ligadura, los que implican la inserción de su gene de la blanco en el plásmido, pueden utilizarse directamente en la transformación de choque de calor. Transformación de choque de calor es más barato que la electroporación y no depende de costosos aparatos o cubetas. Por otro lado, golpes de calor conduce a disminuir la eficiencia de transformación de electroporación y demora más. También se limita a bacterias, levaduras y plantas protoplastos mientras que la electroporación se puede aplicar a células de mamíferos.
Aquí se puede apreciar fibroblastos embrionarios de ratón se carga en una cubeta de electroporación. Una vez completada la electroporación, eficiencias de transformación se pueden determinar mediante la observación de la medida en que las células producen una proteína de fluorescencia verde codificada por el plásmido. La transfección es el término dado a la transformación de células de mamífero, que típicamente requiere de intensidades de campo menor que las células bacterianas y las constantes de tiempo mayor.
La electroporación también se puede realizar en su totalidad animales como el embrión de pollo en desarrollo visto aquí. Plásmido ADN es inyectado en el cerebro de la chica y luego se utiliza una sonda de electroporación para aplicar un campo eléctrico en el tejido cerebral. Después de un día o dos, las proteínas fluorescentes verdes y rojas - codificadas por el plásmido - son hechas por las neuronas, y los científicos pueden observar cambios estructurales en el cerebro de pollito en desarrollo.
Sólo ha visto introducción de Zeus a la transformación bacteriana por electroporación. Este video introducido el plásmido como el tipo más comúnmente transformado de ADN, discute el mecanismo biofísico cree que subyacen a la electroporación, demostrada un procedimiento generalizado para la realización de electroporación y describe cómo puede ser la electroporación utilizado en sistema de mammalisn. ¡Gracias por ver!
El término "transformación" refiere a la ingestión celular de ADN extraño. En la naturaleza, la transformación puede ocurrir en ciertos tipos de bacte…
Transformación bacteriana es un proceso natural, en el cual las bacterias ingieren ADN extraño y luego amplificarán o clonación. En el laboratorio, este proceso puede ser inducido artificialmente, mediante el uso de pulsos de campo eléctrico de alto voltaje para crear poros en la membrana celular bacteriana, a través de la cual el plásmido ADN puede pasar. La electroporación se refiere a este método y en el siguiente vídeo se demuestra sus principios, procedimiento paso a paso y aplicaciones.
Antes de hablar de la electroporación de bacterias, es importante entender el tipo de ADN utilizado en estos experimentos: el plásmido. Un plásmido es un pequeño, circular, extracromosómico de ADN que actúa como un vector, un portador de su secuencia de ADN específica.
Si esta secuencia es un gene para una proteína de la fluorescencia en Medusa o una enzima de las plantas, se inserta en el plásmido por medio de una región llamada la múltiple clonación sitio o MCS. Esta región contiene secuencias específicas que están divididas por restricción de endonucleasas o enzimas de restricción. Las mismas enzimas de la restricción puede utilizarse para cortar la secuencia de interés para que los extremos son complementarios a los extremos recién cortados del plásmido.
Plásmidos también contienen un origen de replicación, abreviado ORI, que indica el punto en el que se replicará. Cuando se trata de la transformación el gen de resistencia a los antibióticos es de vital importancia. Como su nombre lo indica este gen permite que las bacterias producen una enzima que neutraliza el antibiótico, lo que les permite sobrevivir en medios que contienen antibióticos.
Electroporación hace uso de un dispositivo especializado llamado un electroporator. Normalmente las células se colocan en una cubeta de electroporación, que tiene electrodos en cada lado que hacen contacto eléctrico con la máquina una vez insertada.
Mezclado con ADN de células bacterianas se cargan en la cubeta de electroporación y se aplica un campo eléctrico en el pedido de una 1000 a 10.000 voltios por centímetro durante unas milisegundos. Esto hace que la tensión a través de la membrana alcance 0.5-1 voltios, que se cree que conducen a un cambio del phospolipid bilayer que consta de la membrana celular que forman los poros. En este plásmido estado ADN pasará a través de la membrana y cuando termine pulsar la bicapa repararse a sí mismo.
Después de haber tomado el plásmido, pueden entonces desarrollarse bacterias en placas de agar que contiene antibióticos.
Ahora que hemos aprendido sobre los plásmidos y el mecanismo de la electroporación. Vamos a echar un vistazo a cómo se realiza el procedimiento.
Las células que pueden fácilmente tomar el ADN se conocen como células competentes. El tipo más común de bacterias competentes que se transforma en investigación de biología molecular es e. coli, las bacterias procariotas que tienen su hogar en su intestino inferior. E. coli que se preparan para la electroporación se denominan células de espectro.
Cuando maneje las bacterias, asegúrese de que el área de trabajo es tan limpio como sea posible.
Manipulación de bacterias también requiere una técnica aséptica una práctica. Esto implica típicamente el uso de un mechero de Bunsen para esterilizar instrumentos y crear una convección actual – que mantiene contaminantes en el aire lejos del área de trabajo.
Inmediatamente antes de la electroporación, medios precalentamiento a temperatura ambiente, llevar las placas de agar que contiene antibiótico a 37 ° C y cubetas de electroporación fresco en hielo.
A continuación, descongelar células lavadas espectro en hielo.
Agregar 1-5uL de plásmido frío 1ng/μ que es sal gratis a las células bacterianas, mezclar suavemente y añadir la mezcla a la cubeta fría. Asegúrese de que no hay burbujas.
Establece la fuerza de tensión y campo de la electroporator en la configuración correcta para sus células. Aquí puede ver un electroporator está situado a 1700 voltios y produciendo una fuerza de campo de 17kV/cm.
Seque el exterior de la cubeta y colocar en el electroporator. Pulso de las células hasta que escuche un sonido.
Pulsación provoca una descarga eléctrica, que es observable como una chispa visible y audible pop. Esta descarga, conocida como arco eléctrico, puede ser el resultado de tener demasiada sal en tus células competentes o ADN.
Señalando la constante de tiempo, que es la duración que tarda la tensión decaiga después de aplicar el pulso se puede predecir el éxito de su transformación. Cuando la sal está presente y la electroporación solución es muy conductora, el decaimiento ocurre rápidamente, causando la descarga y así matando a muchas de sus células. Para bacterias, rango de constantes de tiempo de 5 a 10 milisegundos.
Inmediatamente después de la pulsación, sacar la cubeta y añadir 1 ml de medios de comunicación directamente a las células. Esta célula que contiene los medios de comunicación se coloca en un tubo y se incubó a 37° C durante 1 hora, con agitación, en el orden de las células a recuperar.
Luego, utilizando una técnica aséptica Añadir 20-200uL de la célula a un antibiótico que contiene la placa de agar. Invertir las placas para que el agar está en la parte superior y para que condensación no caiga en tus células e incubar durante una noche a 37° C.
Las bacterias transformadas con el plásmido deben formar colonias. Contar las colonias y calcular la eficiencia de transformación, que es el número de transformantes éxito dividido por la cantidad total de ADN plateado.
El agar y medios de comunicación, que proporcionan la nutrición para la bacteria, deben ser previamente preparado y esterilizado mediante autoclave. Permite medio líquido a enfriar a temperatura ambiente antes de usar y deje enfriar el agar a 50-55˚C – la temperatura a la que pueden añadirse antibióticos y vertieron de placas. Luego, deje que platos se enfríen a temperatura ambiente para solidificar.
Puesto que las bacterias utilizadas en la transformación se almacenan en el congelador, primero debe descongelar en el hielo, extender sobre una placa de agar sin antibióticos y luego crecido durante la noche en 37˚C.
Utilizando una técnica aséptica Seleccione una colonia de bacterias de la placa de agar y crecer en una cultura más grande de 500mL durante la noche a 37° C en un incubador de agitación.
Mientras que las células crecen, prepare sobre un litro de agua desionizada y hacen un 10% de glicerol y agua, volumen a volumen de solución. Autoclave de las soluciones y se dejan enfriar a 4.
Las mediciones de absorbancia se utilizan para determinar si es o no la bacteria en su mediados fase logarítmica de crecimiento, lo cual significa que fácilmente se ocupan de ADN. Una vez que las células han alcanzado esta fase, coloque en hielo y mantenerlos allí durante todo el procedimiento.
A continuación, lave las células mediante la separación en dos tubos de centrífuga de gran vuelta a 4° C, retirar el sobrenadante y resuspender en frio 100mL de agua desionizada estéril. Repita este paso por lo menos una vez más. El propósito de este paso particular es quitar la sal, que afectará fuertemente a la técnica de electroporación.
Realizar dos lavados adicionales en 50 ml de glicerol al 10% en agua y finalmente resuspender las bacterias de esta misma solución.
Añadir 50μL de células en múltiples tubos Eppendorf. Estas células están ahora listas para uso de electroporación y deben conservarse a 4. O pueden ser flashes congelado y almacenado a - 80˚C.
Como usted está a punto de ver, electroporación tiene muchas aplicaciones.
Una alternativa a la electroporación es transformación de choque de calor, que se basa en la exposición de las bacterias al calor y cloruro de calcio para introducir ADN en tus células.
En general, el choque térmico es más suave en sus bacterias de electroporación y no requiere bajo en sal. Las reacciones de ligadura, los que implican la inserción de su gene de la blanco en el plásmido, pueden utilizarse directamente en la transformación de choque de calor. Transformación de choque de calor es más barato que la electroporación y no depende de costosos aparatos o cubetas. Por otro lado, golpes de calor conduce a disminuir la eficiencia de transformación de electroporación y demora más. También se limita a bacterias, levaduras y plantas protoplastos mientras que la electroporación se puede aplicar a células de mamíferos.
Aquí se puede apreciar fibroblastos embrionarios de ratón se carga en una cubeta de electroporación. Una vez completada la electroporación, eficiencias de transformación se pueden determinar mediante la observación de la medida en que las células producen una proteína de fluorescencia verde codificada por el plásmido. La transfección es el término dado a la transformación de células de mamífero, que típicamente requiere de intensidades de campo menor que las células bacterianas y las constantes de tiempo mayor.
La electroporación también se puede realizar en su totalidad animales como el embrión de pollo en desarrollo visto aquí. Plásmido ADN es inyectado en el cerebro de la chica y luego se utiliza una sonda de electroporación para aplicar un campo eléctrico en el tejido cerebral. Después de un día o dos, las proteínas fluorescentes verdes y rojas - codificadas por el plásmido - son hechas por las neuronas, y los científicos pueden observar cambios estructurales en el cerebro de pollito en desarrollo.
Sólo ha visto introducción de Zeus a la transformación bacteriana por electroporación. Este video introducido el plásmido como el tipo más comúnmente transformado de ADN, discute el mecanismo biofísico cree que subyacen a la electroporación, demostrada un procedimiento generalizado para la realización de electroporación y describe cómo puede ser la electroporación utilizado en sistema de mammalisn. ¡Gracias por ver!
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Transformación bacteriana es un proceso natural, en el cual las bacterias ingieren ADN extraño y luego amplificarán o clonación. En el laboratorio, este proceso puede ser inducido artificialmente, mediante el uso de pulsos de campo eléctrico de alto voltaje para crear poros en la membrana celular bacteriana, a través de la cual el plásmido ADN puede pasar. La electroporación se refiere a este método y en el siguiente vídeo se demuestra sus principios, procedimiento paso a paso y aplicaciones.
Antes de hablar de la electroporación de bacterias, es importante entender el tipo de ADN utilizado en estos experimentos: el plásmido. Un plásmido es un pequeño, circular, extracromosómico de ADN que actúa como un vector, un portador de su secuencia de ADN específica.
Si esta secuencia es un gene para una proteína de la fluorescencia en Medusa o una enzima de las plantas, se inserta en el plásmido por medio de una región llamada la múltiple clonación sitio o MCS. Esta región contiene secuencias específicas que están divididas por restricción de endonucleasas o enzimas de restricción. Las mismas enzimas de la restricción puede utilizarse para cortar la secuencia de interés para que los extremos son complementarios a los extremos recién cortados del plásmido.
Plásmidos también contienen un origen de replicación, abreviado ORI, que indica el punto en el que se replicará. Cuando se trata de la transformación el gen de resistencia a los antibióticos es de vital importancia. Como su nombre lo indica este gen permite que las bacterias producen una enzima que neutraliza el antibiótico, lo que les permite sobrevivir en medios que contienen antibióticos.
Electroporación hace uso de un dispositivo especializado llamado un electroporator. Normalmente las células se colocan en una cubeta de electroporación, que tiene electrodos en cada lado que hacen contacto eléctrico con la máquina una vez insertada.
Mezclado con ADN de células bacterianas se cargan en la cubeta de electroporación y se aplica un campo eléctrico en el pedido de una 1000 a 10.000 voltios por centímetro durante unas milisegundos. Esto hace que la tensión a través de la membrana alcance 0.5-1 voltios, que se cree que conducen a un cambio del phospolipid bilayer que consta de la membrana celular que forman los poros. En este plásmido estado ADN pasará a través de la membrana y cuando termine pulsar la bicapa repararse a sí mismo.
Después de haber tomado el plásmido, pueden entonces desarrollarse bacterias en placas de agar que contiene antibióticos.
Ahora que hemos aprendido sobre los plásmidos y el mecanismo de la electroporación. Vamos a echar un vistazo a cómo se realiza el procedimiento.
Las células que pueden fácilmente tomar el ADN se conocen como células competentes. El tipo más común de bacterias competentes que se transforma en investigación de biología molecular es e. coli, las bacterias procariotas que tienen su hogar en su intestino inferior. E. coli que se preparan para la electroporación se denominan células de espectro.
Cuando maneje las bacterias, asegúrese de que el área de trabajo es tan limpio como sea posible.
Manipulación de bacterias también requiere una técnica aséptica una práctica. Esto implica típicamente el uso de un mechero de Bunsen para esterilizar instrumentos y crear una convección actual – que mantiene contaminantes en el aire lejos del área de trabajo.
Inmediatamente antes de la electroporación, medios precalentamiento a temperatura ambiente, llevar las placas de agar que contiene antibiótico a 37 ° C y cubetas de electroporación fresco en hielo.
A continuación, descongelar células lavadas espectro en hielo.
Agregar 1-5uL de plásmido frío 1ng/μ que es sal gratis a las células bacterianas, mezclar suavemente y añadir la mezcla a la cubeta fría. Asegúrese de que no hay burbujas.
Establece la fuerza de tensión y campo de la electroporator en la configuración correcta para sus células. Aquí puede ver un electroporator está situado a 1700 voltios y produciendo una fuerza de campo de 17kV/cm.
Seque el exterior de la cubeta y colocar en el electroporator. Pulso de las células hasta que escuche un sonido.
Pulsación provoca una descarga eléctrica, que es observable como una chispa visible y audible pop. Esta descarga, conocida como arco eléctrico, puede ser el resultado de tener demasiada sal en tus células competentes o ADN.
Señalando la constante de tiempo, que es la duración que tarda la tensión decaiga después de aplicar el pulso se puede predecir el éxito de su transformación. Cuando la sal está presente y la electroporación solución es muy conductora, el decaimiento ocurre rápidamente, causando la descarga y así matando a muchas de sus células. Para bacterias, rango de constantes de tiempo de 5 a 10 milisegundos.
Inmediatamente después de la pulsación, sacar la cubeta y añadir 1 ml de medios de comunicación directamente a las células. Esta célula que contiene los medios de comunicación se coloca en un tubo y se incubó a 37° C durante 1 hora, con agitación, en el orden de las células a recuperar.
Luego, utilizando una técnica aséptica Añadir 20-200uL de la célula a un antibiótico que contiene la placa de agar. Invertir las placas para que el agar está en la parte superior y para que condensación no caiga en tus células e incubar durante una noche a 37° C.
Las bacterias transformadas con el plásmido deben formar colonias. Contar las colonias y calcular la eficiencia de transformación, que es el número de transformantes éxito dividido por la cantidad total de ADN plateado.
El agar y medios de comunicación, que proporcionan la nutrición para la bacteria, deben ser previamente preparado y esterilizado mediante autoclave. Permite medio líquido a enfriar a temperatura ambiente antes de usar y deje enfriar el agar a 50-55˚C – la temperatura a la que pueden añadirse antibióticos y vertieron de placas. Luego, deje que platos se enfríen a temperatura ambiente para solidificar.
Puesto que las bacterias utilizadas en la transformación se almacenan en el congelador, primero debe descongelar en el hielo, extender sobre una placa de agar sin antibióticos y luego crecido durante la noche en 37˚C.
Utilizando una técnica aséptica Seleccione una colonia de bacterias de la placa de agar y crecer en una cultura más grande de 500mL durante la noche a 37° C en un incubador de agitación.
Mientras que las células crecen, prepare sobre un litro de agua desionizada y hacen un 10% de glicerol y agua, volumen a volumen de solución. Autoclave de las soluciones y se dejan enfriar a 4.
Las mediciones de absorbancia se utilizan para determinar si es o no la bacteria en su mediados fase logarítmica de crecimiento, lo cual significa que fácilmente se ocupan de ADN. Una vez que las células han alcanzado esta fase, coloque en hielo y mantenerlos allí durante todo el procedimiento.
A continuación, lave las células mediante la separación en dos tubos de centrífuga de gran vuelta a 4° C, retirar el sobrenadante y resuspender en frio 100mL de agua desionizada estéril. Repita este paso por lo menos una vez más. El propósito de este paso particular es quitar la sal, que afectará fuertemente a la técnica de electroporación.
Realizar dos lavados adicionales en 50 ml de glicerol al 10% en agua y finalmente resuspender las bacterias de esta misma solución.
Añadir 50μL de células en múltiples tubos Eppendorf. Estas células están ahora listas para uso de electroporación y deben conservarse a 4. O pueden ser flashes congelado y almacenado a - 80˚C.
Como usted está a punto de ver, electroporación tiene muchas aplicaciones.
Una alternativa a la electroporación es transformación de choque de calor, que se basa en la exposición de las bacterias al calor y cloruro de calcio para introducir ADN en tus células.
En general, el choque térmico es más suave en sus bacterias de electroporación y no requiere bajo en sal. Las reacciones de ligadura, los que implican la inserción de su gene de la blanco en el plásmido, pueden utilizarse directamente en la transformación de choque de calor. Transformación de choque de calor es más barato que la electroporación y no depende de costosos aparatos o cubetas. Por otro lado, golpes de calor conduce a disminuir la eficiencia de transformación de electroporación y demora más. También se limita a bacterias, levaduras y plantas protoplastos mientras que la electroporación se puede aplicar a células de mamíferos.
Aquí se puede apreciar fibroblastos embrionarios de ratón se carga en una cubeta de electroporación. Una vez completada la electroporación, eficiencias de transformación se pueden determinar mediante la observación de la medida en que las células producen una proteína de fluorescencia verde codificada por el plásmido. La transfección es el término dado a la transformación de células de mamífero, que típicamente requiere de intensidades de campo menor que las células bacterianas y las constantes de tiempo mayor.
La electroporación también se puede realizar en su totalidad animales como el embrión de pollo en desarrollo visto aquí. Plásmido ADN es inyectado en el cerebro de la chica y luego se utiliza una sonda de electroporación para aplicar un campo eléctrico en el tejido cerebral. Después de un día o dos, las proteínas fluorescentes verdes y rojas - codificadas por el plásmido - son hechas por las neuronas, y los científicos pueden observar cambios estructurales en el cerebro de pollito en desarrollo.
Sólo ha visto introducción de Zeus a la transformación bacteriana por electroporación. Este video introducido el plásmido como el tipo más comúnmente transformado de ADN, discute el mecanismo biofísico cree que subyacen a la electroporación, demostrada un procedimiento generalizado para la realización de electroporación y describe cómo puede ser la electroporación utilizado en sistema de mammalisn. ¡Gracias por ver!
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Q1: What is a plasmid and why is it used in bacterial transformation?
A plasmid is a small, circular, extrachromosomal piece of DNA that acts as a vector to carry your specific DNA sequence into bacterial cells. It contains a multiple cloning site where restriction enzymes insert your target gene, an origin of replication for DNA copying, and an antibiotic resistance gene that allows transformed bacteria to survive on antibiotic-containing media.
Q2: How does electroporation create pores in bacterial cell membranes?
Electroporation applies a high-voltage electric field of 1,000 to 10,000 volts per centimeter for milliseconds, causing the voltage across the membrane to reach 0.5-1 volts. This rearranges the phospholipid bilayer, creating temporary pores through which plasmid DNA passes. Once pulsing stops, the bilayer repairs itself, trapping the DNA inside the cell.
Q3: What are electrocompetent cells and how are they prepared?
Electrocompetent cells are bacteria prepared to readily take up DNA during electroporation. E. coli cells are grown to mid-log phase, then washed multiple times in deionized water and 10% glycerol solution to remove salt. Salt removal is critical because high salt content causes arcing, an electrical discharge that kills cells and indicates transformation failure.
Q4: Why is the time constant important in predicting electroporation success?
The time constant measures how quickly voltage decays after the electric pulse is applied. Good time constants for bacteria range from 5-10 milliseconds. Rapid decay indicates high salt concentration, causing arcing and cell death. Monitoring the time constant helps predict whether your transformation will succeed before observing colony growth.
Q5: How does electroporation compare to heat shock transformation?
Heat shock transformation uses calcium chloride and heat exposure instead of electrical pulses, making it gentler on bacteria and cheaper than electroporation. However, heat shock produces lower transformation efficiencies, takes longer, and works only on bacteria, yeast, and plant protoplasts. Electroporation achieves higher efficiency and applies to mammalian cells through a process called transfection.
Q6: What steps follow electroporation to identify successfully transformed bacteria?
After pulsing, add recovery media to cells and incubate at 37°C for one hour with shaking. Plate cells on antibiotic-containing agar and incubate overnight at 37°C. Only bacteria that successfully took up the plasmid survive the antibiotic. Count resulting colonies and calculate transformation efficiency by dividing successful transformants by total DNA plated.
Q7: What are the applications of electroporation beyond bacterial transformation?
Electroporation applies to mammalian cells through transfection, using lower field strengths and higher time constants than bacterial cells. Scientists also use electroporation in whole organisms like developing chicken embryos by injecting plasmid DNA into brain tissue and applying an electric field. This allows observation of fluorescent protein expression and structural changes in developing neural tissue.
Capítulos en este video
0:00
Overview
0:47
The Plasmid
2:17
Electroporation Basic Principles
3:26
Electroporating Bacteria
7:07
Preparing Electrocompetent Cells
9:36
Applications
11:43
Summary