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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Transformación bacteriana: Electroporación

Bacterial Transformation: Electroporation

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Bacterial Transformation: Electroporation

2.6: Bacterial Transformation: The Heat Shock Method

2.8: The ELISA Method

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12:19 min

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April 30, 2023

Overview

El término “transformación” refiere a la ingestión celular de ADN extraño. En la naturaleza, la transformación puede ocurrir en ciertos tipos de bacterias. En biología molecular, sin embargo, transformación es inducida artificialmente a través de la creación de poros en las paredes celulares bacterianas. Las células bacterianas que son capaces de tomar ADN del ambiente se denominan células competentes. Espectro de células se pueden producir en el laboratorio y la transformación de estas células se puede lograr mediante la aplicación de un campo eléctrico que crea poros en la pared celular a través del cual el ADN puede pasar.

El video explica el equipo utilizado en la electroporación como una cubeta electroporator y electroporación. El video también pasa a través de un procedimiento paso a paso sobre cómo crear células de espectro y electroporate las células de interés. Predicción del éxito de una transformación de un experimento, mediante la observación de la constante de tiempo, así como la importancia de eliminar la sal de las soluciones cuando electroporating, también se mencionan.

Procedure

Transformación bacteriana es un proceso natural, en el cual las bacterias ingieren ADN extraño y luego amplificarán o clonación. En el laboratorio, este proceso puede ser inducido artificialmente, mediante el uso de pulsos de campo eléctrico de alto voltaje para crear poros en la membrana celular bacteriana, a través de la cual el plásmido ADN puede pasar. La electroporación se refiere a este método y en el siguiente vídeo se demuestra sus principios, procedimiento paso a paso y aplicaciones.

Antes de hablar de la electroporación de bacterias, es importante entender el tipo de ADN utilizado en estos experimentos: el plásmido. Un plásmido es un pequeño, circular, extracromosómico de ADN que actúa como un vector, un portador de su secuencia de ADN específica.

Si esta secuencia es un gene para una proteína de la fluorescencia en Medusa o una enzima de las plantas, se inserta en el plásmido por medio de una región llamada la múltiple clonación sitio o MCS. Esta región contiene secuencias específicas que están divididas por restricción de endonucleasas o enzimas de restricción. Las mismas enzimas de la restricción puede utilizarse para cortar la secuencia de interés para que los extremos son complementarios a los extremos recién cortados del plásmido.

Plásmidos también contienen un origen de replicación, abreviado ORI, que indica el punto en el que se replicará. Cuando se trata de la transformación el gen de resistencia a los antibióticos es de vital importancia. Como su nombre lo indica este gen permite que las bacterias producen una enzima que neutraliza el antibiótico, lo que les permite sobrevivir en medios que contienen antibióticos.

Electroporación hace uso de un dispositivo especializado llamado un electroporator. Normalmente las células se colocan en una cubeta de electroporación, que tiene electrodos en cada lado que hacen contacto eléctrico con la máquina una vez insertada.

Mezclado con ADN de células bacterianas se cargan en la cubeta de electroporación y se aplica un campo eléctrico en el pedido de una 1000 a 10.000 voltios por centímetro durante unas milisegundos. Esto hace que la tensión a través de la membrana alcance 0.5-1 voltios, que se cree que conducen a un cambio del phospolipid bilayer que consta de la membrana celular que forman los poros. En este plásmido estado ADN pasará a través de la membrana y cuando termine pulsar la bicapa repararse a sí mismo.

Después de haber tomado el plásmido, pueden entonces desarrollarse bacterias en placas de agar que contiene antibióticos.

Ahora que hemos aprendido sobre los plásmidos y el mecanismo de la electroporación. Vamos a echar un vistazo a cómo se realiza el procedimiento.

Las células que pueden fácilmente tomar el ADN se conocen como células competentes. El tipo más común de bacterias competentes que se transforma en investigación de biología molecular es e. coli, las bacterias procariotas que tienen su hogar en su intestino inferior. E. coli que se preparan para la electroporación se denominan células de espectro.

Cuando maneje las bacterias, asegúrese de que el área de trabajo es tan limpio como sea posible.

Manipulación de bacterias también requiere una técnica aséptica una práctica. Esto implica típicamente el uso de un mechero de Bunsen para esterilizar instrumentos y crear una convección actual – que mantiene contaminantes en el aire lejos del área de trabajo.

Inmediatamente antes de la electroporación, medios precalentamiento a temperatura ambiente, llevar las placas de agar que contiene antibiótico a 37 ° C y cubetas de electroporación fresco en hielo.

A continuación, descongelar células lavadas espectro en hielo.

Agregar 1-5uL de plásmido frío 1ng/μ que es sal gratis a las células bacterianas, mezclar suavemente y añadir la mezcla a la cubeta fría. Asegúrese de que no hay burbujas.

Establece la fuerza de tensión y campo de la electroporator en la configuración correcta para sus células. Aquí puede ver un electroporator está situado a 1700 voltios y produciendo una fuerza de campo de 17kV/cm.

Seque el exterior de la cubeta y colocar en el electroporator. Pulso de las células hasta que escuche un sonido.

Pulsación provoca una descarga eléctrica, que es observable como una chispa visible y audible pop. Esta descarga, conocida como arco eléctrico, puede ser el resultado de tener demasiada sal en tus células competentes o ADN.

Señalando la constante de tiempo, que es la duración que tarda la tensión decaiga después de aplicar el pulso se puede predecir el éxito de su transformación. Cuando la sal está presente y la electroporación solución es muy conductora, el decaimiento ocurre rápidamente, causando la descarga y así matando a muchas de sus células. Para bacterias, rango de constantes de tiempo de 5 a 10 milisegundos.

Inmediatamente después de la pulsación, sacar la cubeta y añadir 1 ml de medios de comunicación directamente a las células. Esta célula que contiene los medios de comunicación se coloca en un tubo y se incubó a 37° C durante 1 hora, con agitación, en el orden de las células a recuperar.

Luego, utilizando una técnica aséptica Añadir 20-200uL de la célula a un antibiótico que contiene la placa de agar. Invertir las placas para que el agar está en la parte superior y para que condensación no caiga en tus células e incubar durante una noche a 37° C.

Las bacterias transformadas con el plásmido deben formar colonias. Contar las colonias y calcular la eficiencia de transformación, que es el número de transformantes éxito dividido por la cantidad total de ADN plateado.

El agar y medios de comunicación, que proporcionan la nutrición para la bacteria, deben ser previamente preparado y esterilizado mediante autoclave. Permite medio líquido a enfriar a temperatura ambiente antes de usar y deje enfriar el agar a 50-55˚C – la temperatura a la que pueden añadirse antibióticos y vertieron de placas. Luego, deje que platos se enfríen a temperatura ambiente para solidificar.

Puesto que las bacterias utilizadas en la transformación se almacenan en el congelador, primero debe descongelar en el hielo, extender sobre una placa de agar sin antibióticos y luego crecido durante la noche en 37˚C.

Utilizando una técnica aséptica Seleccione una colonia de bacterias de la placa de agar y crecer en una cultura más grande de 500mL durante la noche a 37° C en un incubador de agitación.

Mientras que las células crecen, prepare sobre un litro de agua desionizada y hacen un 10% de glicerol y agua, volumen a volumen de solución. Autoclave de las soluciones y se dejan enfriar a 4.

Las mediciones de absorbancia se utilizan para determinar si es o no la bacteria en su mediados fase logarítmica de crecimiento, lo cual significa que fácilmente se ocupan de ADN. Una vez que las células han alcanzado esta fase, coloque en hielo y mantenerlos allí durante todo el procedimiento.

A continuación, lave las células mediante la separación en dos tubos de centrífuga de gran vuelta a 4° C, retirar el sobrenadante y resuspender en frio 100mL de agua desionizada estéril. Repita este paso por lo menos una vez más. El propósito de este paso particular es quitar la sal, que afectará fuertemente a la técnica de electroporación.

Realizar dos lavados adicionales en 50 ml de glicerol al 10% en agua y finalmente resuspender las bacterias de esta misma solución.

Añadir 50μL de células en múltiples tubos Eppendorf. Estas células están ahora listas para uso de electroporación y deben conservarse a 4. O pueden ser flashes congelado y almacenado a – 80˚C.

Como usted está a punto de ver, electroporación tiene muchas aplicaciones.

Una alternativa a la electroporación es transformación de choque de calor, que se basa en la exposición de las bacterias al calor y cloruro de calcio para introducir ADN en tus células.

En general, el choque térmico es más suave en sus bacterias de electroporación y no requiere bajo en sal. Las reacciones de ligadura, los que implican la inserción de su gene de la blanco en el plásmido, pueden utilizarse directamente en la transformación de choque de calor. Transformación de choque de calor es más barato que la electroporación y no depende de costosos aparatos o cubetas. Por otro lado, golpes de calor conduce a disminuir la eficiencia de transformación de electroporación y demora más. También se limita a bacterias, levaduras y plantas protoplastos mientras que la electroporación se puede aplicar a células de mamíferos.

Aquí se puede apreciar fibroblastos embrionarios de ratón se carga en una cubeta de electroporación. Una vez completada la electroporación, eficiencias de transformación se pueden determinar mediante la observación de la medida en que las células producen una proteína de fluorescencia verde codificada por el plásmido. La transfección es el término dado a la transformación de células de mamífero, que típicamente requiere de intensidades de campo menor que las células bacterianas y las constantes de tiempo mayor.

La electroporación también se puede realizar en su totalidad animales como el embrión de pollo en desarrollo visto aquí. Plásmido ADN es inyectado en el cerebro de la chica y luego se utiliza una sonda de electroporación para aplicar un campo eléctrico en el tejido cerebral. Después de un día o dos, las proteínas fluorescentes verdes y rojas – codificadas por el plásmido – son hechas por las neuronas, y los científicos pueden observar cambios estructurales en el cerebro de pollito en desarrollo.

Sólo ha visto introducción de Zeus a la transformación bacteriana por electroporación. Este video introducido el plásmido como el tipo más comúnmente transformado de ADN, discute el mecanismo biofísico cree que subyacen a la electroporación, demostrada un procedimiento generalizado para la realización de electroporación y describe cómo puede ser la electroporación utilizado en sistema de mammalisn. ¡Gracias por ver!

Transcript

Bacterial transformation is a naturally occurring process, in which bacteria ingest foreign DNA and then amplify or clone it. In the lab, this process can be induced artificially, by using high voltage electric field pulses to create pores in the bacterial cell membrane, through which plasmid DNA can pass. Electroporation refers to this method and the following video will demonstrate its principles, step-by-step procedure, and applications.

Before we talk about electroporation of bacteria, it’s important to understand the type of DNA used in these experiments: the plasmid. A plasmid is a small, circular, extrachromosomal piece of DNA that acts as a vector, a carrier of your specific DNA sequence.

Whether this sequence is a gene for a fluorescence protein in jellyfish or an enzyme from plants, it is inserted into the plasmid via a region called the multiple cloning site or MCS. This region contains specific sequences that are cleaved by restriction endonucleases or restriction enzymes. The same restriction enzymes can be used to cut out your sequence of interest so that the ends are complementary to the newly cut ends of the plasmid.

Plasmids also contain an origin of replication, abbreviated ORI, that indicates the point at which it will be replicated. When it comes to transformation the antibiotic resistance gene is of vital importance. As its name implies this gene allows the bacteria to produce an enzyme that neutralizes antibiotic allowing them to survive in antibiotic containing media.

Electroporation makes use of a specialized device called an electroporator. Typically cells are placed into an electroporation cuvette, which has electrodes on each side that make electrical contact with the machine once inserted.

Bacterial cells mixed with DNA are loaded into the electroporation cuvette and an electric field on the order a 1000 to 10,000 volts per centimeter is applied for a few milliseconds. This causes the voltage across the membrane to reach 0.5-1 volts, which is believed to lead to a rearrangement of the phospolipid bilayer that comprises the cell membrane such that pores will form. In this state plasmid DNA will pass through the membrane and when pulsing is complete the bilayer will repair itself.

Having taken up the plasmid, bacteria can then grow on agar plates containing antibiotic.

Now that we’ve learned about plasmids and the electroporation mechanism. Let’s have a look at how the procedure is conducted.

Cells that can readily take up DNA are referred to as competent cells. The most common type of competent bacteria that is transformed in molecular biology research is E. coli, which are the prokaryotic bacteria that make their home in your lower intestine. E. coli that are prepared for electroporation are referred to as electrocompetent cells.

Whenever handling bacteria, make sure the work area is as clean as possible.

Handling bacteria also requires that one practice aseptic technique. Typically this involves the use of a Bunsen burner to sterilize instruments and to create a convection current – which keeps airborne contaminants away from the workspace.

Immediately before electroporation, pre-warm media to room temperature, bring agar plates containing antibiotic to 37°C, and cool electroporation cuvettes on ice.

Next, thaw washed electrocompetent cells on ice.

Add 1-5uL of 1ng/μL cold plasmid that is salt free to bacterial cells, mix gently, and add the mixture to the cold cuvette. Make sure there are no bubbles.

Set the voltage and field strength of the electroporator to the correct settings for your cells. Here you see an electroporator being set to 1700 volts and yielding a field strength of 17kV/cm.

Wipe the outside of the cuvette dry and place it into the electroporator. Pulse the cells until you hear a beep.

Unsuccessful pulsing causes an electrical discharge, which is observable as a visible spark and audible pop. This discharge, referred to as arcing, can be the result of having too much salt in your competent cells or DNA.

The success of your transformation can be predicted by noting the time constant, which is the duration it takes for the voltage to decay after applying the pulse. When salt is present and the electroporation solution is very conductive, the decay happens rapidly, causing the discharge, and thereby killing many of your cells. For bacteria, good time constants range from 5-10 milliseconds.

Immediately after pulsing, remove the cuvette and add 1 ml of media directly to the cells. This cell containing media is placed in a tube and incubated at 37°C for 1 hour, with shaking, in order for the cells to recover.

Then, using aseptic technique add 20-200uL of the cell to an antibiotic containing agar plate. Invert the plates so that the agar is on top and so condensation does not fall into your cells and incubate overnight at 37°C.

Bacteria transformed with the plasmid should form colonies. Count the colonies and calculate the transformation efficiency, which is the number of successful transformants divided by the total amount of DNA plated.

The agar and media, which provide the nutrition for your bacteria, should be pre-prepared and sterilized via autoclaving. Allow liquid media to cool to room temperature before using and let the agar cool to 50-55˚C – the temperature at which antibiotic can be added and plates poured. Then, allow plates to cool to room temperature to solidify.

Since bacteria used in transformation are stored in the freezer, they must first be thawed on ice, spread on an agar plate without antibiotics and then grown overnight at 37˚C.

Using aseptic technique select a bacterial colony from the agar plate and grow it up in a larger 500mL culture overnight at 37°C in a shaking incubator.

While the cells are growing, prepare about a liter of deionized water and make up a 10% glycerol and water, volume to volume solution. Autoclave the solutions and let them cool at 4˚C.

Absorbance measurements are used to determine whether or not the bacteria are in their mid log phase of growth, which means they will readily take up DNA. Once cells have reached this phase, place them on ice and keep them there throughout the procedure.

Next, wash cells by separating them in two large centrifuge tubes and spin at 4°C, pour off supernatant and resuspend in cold 100mL sterile deionized water. Repeat this step at least one more time. The purpose of this step particular step is to remove salt, which will strongly affect the electroporation technique.

Perform two additional washes in 50 ml of 10% glycerol in water and finally resuspend the bacteria in this same solution.

Add 50μL of cells into multiple Eppendorf tubes. These cells are now ready for use in electroporation and should be kept at 4˚C. Or they can be flash frozen and stored at -80˚C.

As you are about to see, electroporation has many applications.

An alternative to electroporation is heat shock transformation, which relies on the exposure of the bacteria to both calcium chloride and heat in order to introduce DNA into your cells.

In general, heat shock is gentler on your bacteria than electroporation and doesn’t require low salt. Ligation reactions, those that involve inserting your target gene into the plasmid, can be used directly in heat shock transformation. Heat shock transformation is cheaper than electroporation and doesn’t rely on expensive equipment or cuvettes. On the other hand, heat shock leads to lower transformation efficiencies than electroporation and takes longer. Also it is limited to bacterial, yeast and plant protoplasts while electroporation can be applied to mammalian cells.

Here you see mouse embryonic fibroblasts being loaded into an electroporation cuvette. Once electroporation is complete, transformation efficiencies can be determined by observing the extent to which cells produce a green fluorescence protein encoded by the plasmid. Transfection is the term given to the transformation of mammalian cells, which typically requires lower field strengths than bacterial cells and higher time constants.

Electroporation can also be performed in whole animals like the developing chicken embryo you seen here. Plasmid DNA is injected into the brain of the chick and then an electroporation probe is used to apply an electric field to the brain tissue. After a day or two, green and red fluorescent proteins – encoded by the plasmid – are made by neurons, and scientists can observe structural changes in the developing chick brain.

You’ve just watched JoVE introduction to bacterial transformation by electroporation. This video introduced the plasmid as the most commonly transformed type of DNA, discussed the biophysical mechanism thought to underlie electroporation, showed a generalized procedure for conducting electroporation, and described how electroporation can be used in mammalisn system. Thanks for watching!

Tags

Bacterial Transformation Electroporation Plasmid DNA High Voltage Electric Field Pulses Bacterial Cell Membrane Vector Multiple Cloning Site Restriction Endonucleases Restriction Enzymes Origin Of Replication Antibiotic Resistance Gene