Name: No Invasiva Intratraqueal Intubación para Estudiar la Patología y Fisiología de pulmón de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-08T22:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: Aprende intubación intratraqueal no invasiva para estudiar la fisiología y patología pulmonar en ratones. Este método permite la entrega precisa de tratamientos experimentales y su visualización mediante colorante verde.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional del Cáncer, el Centro para la Investigación del Cáncer.

El siguiente protocolo describe un método no invasivo, simple y rápida para entregar materiales de interés para los pulmones del ratón. Este procedimiento fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo del Instituto Nacional del Cáncer. 1. Anestesia <ol><li> En primer lugar, anestesiar el ratón utilizando una mezcla de ketamina y xilazina (100 mg / kg de peso corporal y 10 mg / kg de peso corporal, respectivamente). Este es el ACUC recomienda la anestesia y la dosis. Con esta cantidad, los ratones son inconscientes por lo menos durante ~ 20 min. </li><li> Aplique un ungüento veterinario para los ojos del ratón con el fin de prevenir la sequedad en los ojos durante la anestesia. </li><li> Después de varios minutos, pellizque un pie del ratón para comprobar si hay conciencia. Una vez confirmado inconsciente, coloque el ratón en un soporte intubación un ángulo de ~ 60 ° y mantenerlo en su lugar mediante la conexión de sus incisivos superiores sobre una banda pequeña de goma situado en la parte superior del soporte. </li></ol> 2. La intubación intratraqueal </p&gt; <ol><li> Retraer con suavidad la lengua del ratón a un lado usando un Q-tip. </li><li> Cuando se utiliza el sistema de iluminación de intubación BioLite, inserte con cuidado el sistema de intubación hasta la laringe se visualiza con la ayuda de la guía de luz de fibra óptica. </li><li> Una vez que la epiglotis y los cartílagos aritenoides se visualizan, insertar la fibra sobre la epiglotis y entre los cartílagos aritenoides, y avanzar hasta que se ha insertado la longitud adecuada de catéter. </li></ol> Nota: Con el fin de obtener la longitud adecuada de catéter para ser insertado, medir inicialmente la longitud entre la boca y el punto de bifurcación bronquial mediante el uso de un ratón de la práctica de un tamaño similar en avance (Figura 1). La longitud depende en gran medida del tamaño del ratón. La inserción del catéter debe detener por encima del punto de bifurcación (~ 1,5 cm para ratón con ~ 25 g de peso corporal). Esto asegura que el material intubado irá a todos los lóbulos. Al menos 50 prácticas micE puede ser requerido para una persona que realiza la intubación para alcanzar la competencia en la técnica (Competente significa que la tasa de éxito de la intubación es más del 95%). <ol start="4"><li> Una vez que se inserta el catéter, retire rápidamente la guía de luz de fibra óptica de la sonda para que el animal pueda respirar normalmente. Cuando no se utiliza el sistema de intubación Iluminación, insertar directamente un catéter según lo descrito. </li><li> Añadir una solución que contiene materiales de interés a un catéter. Asegúrese de que la solución se aspira en los pulmones inmediatamente después de la adición. Cincuenta microlitros de ~ se utiliza de forma rutinaria 25 g de peso corporal del ratón. </li></ol> 3. Recuperación de Animales <ol><li> Tan pronto como la solución se aspira en los pulmones, acabar con el ratón desde la base, y vuelva a colocarlo en la caja originales. </li><li> Observe el ratón hasta que empiece a moverse. </li><li> Una vez confirmado que el ratón está en buenas condiciones, volver a la jaula para un rack. </li></ol>

<ol><li>Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+mouse+lung+intubation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple method of mouse lung intubation.</a> J. Vis. Exp. (73), e50318(2013).</li>
<li>Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+murine+intranasal+dosing+efficiency+using+luminescent+Francisella+tularensis%3A+effect+of+instillation+volume+and+form+of+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia.</a> PLoS One. 7, e31359(2012).</li>
<li>Rayamajhi, M., Redente, E. F., Condon, T. V., Gonzalez-Juarrero, M., Riches, D. W., Lenz, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-surgical+intratracheal+instillation+of+mice+with+analysis+of+lungs+and+lung+draining+lymph+nodes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (51), e2702(2011).</li>
<li>Riesenfeld, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhaled+salmeterol+and%2For+fluticasone+alters+structure%2Ffunction+in+a+murine+model+of+allergic+airways+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Res%22%5BJournal%5D)">Inhaled salmeterol and/or fluticasone alters structure/function in a murine model of allergic airways disease.</a> Respir. Res. 11, 22(2010).</li>
<li>Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+endotracheal+intubation+of+mice+and+rats+used+in+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp.+Top.+Lab+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies.</a> Contemp. Top. Lab Anim. Sci. 44, 52-55 (2005).</li>
<li>Bonniaud, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+transforming+growth+factor+beta1-induced+lung+fibrosis+is+blocked+by+an+orally+active+ALK5+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Res.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Progressive transforming growth factor beta1-induced lung fibrosis is blocked by an orally active ALK5 kinase inhibitor.</a> Am. J. Res. Crit. Care Med. 171, 889-898 (2005).</li>
<li>Bivas-Benita, M., Zwier, R., Junginger, H. E., Borchard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+pulmonary+aerosol+delivery+in+mice+by+the+endotracheal+route%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 61, 214-218 (2005).</li>
<li>Haegens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase+deficiency+attenuates+lipopolysaccharide-induced+acute+lung+inflammation+and+subsequent+cytokine+and+chemokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase deficiency attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung inflammation and subsequent cytokine and chemokine production.</a> J. Immunol. 182, 7990-7996 (2009).</li>
<li>Jackson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+pregnant+mice+to+carbon+black+by+intratracheal+instillation%3A+toxicogenomic+effects+in+dams+and+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Exposure of pregnant mice to carbon black by intratracheal instillation: toxicogenomic effects in dams and offspring.</a> Mutat. Res. 745, 73-83 (2012).</li>
<li>Bodewes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Influenza+A%2FH5N1+virus+infection+in+ferrets+differs+between+intranasal+and+intratracheal+routes+of+inoculation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Influenza A/H5N1 virus infection in ferrets differs between intranasal and intratracheal routes of inoculation.</a> Am. J. Pathol. 179, 30-36 (2011).</li>
<li>Winslow, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+lung+adenocarcinoma+progression+by+Nkx2-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1.</a> Nature. 473, 101-104 (2011).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Intubación intratraqueal aquí descrito es un método no invasivo simple, pero excelente para entregar de manera uniforme los materiales de interés para los pulmones del ratón. Este método permite el estudio del efecto y / o función del material administrado en la fisiología y / o patología de pulmón. Los materiales administrados pueden ser moléculas endógenas, tales como citocinas, o materiales exógenos tales como productos químicos xenobióticos / fármacos, carcinógenos, contaminantes, alérgenos, o virus que resultan en ...

Pulmón es un órgano donde muchas enfermedades devastadoras son comúnmente diagnosticados. Entre ellos, el cáncer de pulmón es el segundo cáncer más diagnosticado en hombres y mujeres, y la causa más común de muerte por cáncer. Enfermedad pulmonar obstructiva crónica, también conocida como el enfisema y la bronquitis crónica, es una enfermedad muy grave y la tercera causa principal de muerte en los Estados Unidos. En 2011, se estimó que 25,9 millones de estadounidenses tenían asma, incluyendo 7,1 millones de niños menores de 18 años. El asma es la tercera causa de hospitalización entre los niños menores de 15 años (American Lung Association, <a href="http://www.lung.org" target="_blank">http://www.lung.org</a> ). Con el fin de estudiar la fisiopatología y / o la etiología de estas enfermedades devastadoras y sus mecanismos subyacentes, el uso de modelos precisos es crítica en relación con la administración conveniente y no invasiva de varios materiales de interés para pulmón. Los ratones proporcionan una de las mejores modelos deestudiar los mecanismos moleculares que subyacen a la patología y fisiología de enfermedades pulmonares a causa de la creciente disponibilidad de knockout y los ratones transgénicos y una gran cantidad de información genética disponible. Varios métodos han sido utilizados por un número de investigadores en diferentes contextos para entregar materiales de interés para los pulmones del ratón, incluyendo inhalación, instilación intranasal, la instilación intratraqueal, y la intubación endotraqueal 1-4. Este último procedimiento no ha sido utilizado de forma rutinaria, ya que se considera más bien difícil de realizar. Intubación intratraqueal se describe en el presente documento es un método no invasivo, simple y rápida para entregar materiales de interés para los pulmones del ratón con el fin de estudiar el efecto de los materiales entregados en los patrones de expresión de genes, la patología y / o la fisiología del pulmón 5. Esta técnica asegura la entrega de materiales exógenos a todo un pulmón y no implica cualquier tipo de cirugía la supervivencia y por lo tanto se likely ser aprobado por los comités de cuidado y uso de animales institucionales.

<table><tbody><tr><td>KetaVed</td><td>Vedco</td><td></td><td>Ketamina</td></tr><tr><td>AnaSed Inyección 20 mg</td><td>LLOYD</td><td></td><td>Xilacina</td></tr><tr><td>BioLite</td><td>Soporte Braintree Scientific</td><td>RIS100</td><td>Para ratones</td></tr><tr><td>BioLite Sistema de iluminación de intubación</td><td>Braintree Scientific</td><td>BIO MI-KIT</td><td>Para ratones</td></tr><tr><td>22 G, catéter intravenoso de 1 pulgada</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2225CA</td><td>Para ratones <fuerte>por debajo</fuerte> 30 g.&nbsp; El catéter se utiliza solo para el caso en el que no se utiliza el sistema de iluminación de intubación.</td></tr><tr><td>Catéter intravenoso de 20 g y 1 pulgada</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2025CA</td><td>Para ratones <fuerte>sobre</fuerte> 30 g. El catéter se utiliza solo para el caso en el que no se utiliza el sistema de iluminación de intubación.</td></tr></tbody></table>

no invasiva intratraqueal intubación para estudiar la patología y fisiología de pulmón de ratón

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

El uso de un modelo que imita el estado de las enfermedades pulmonares en los seres humanos es crítico para el estudio de la fisiopatología y / o la etiología de una enfermedad en particular y para el desarrollo de la intervención terapéutica. Con la creciente disponibilidad de knockout y transgénicos derivados, junto con una gran cantidad de información genética, los ratones proporcionan una de las mejores modelos para estudiar los mecanismos moleculares que subyacen a la patología y la fisiología de las enfermedades pulmonares. Inhalación, instilación intranasal, la instilación intratraqueal, y la intubación endotraqueal son las técnicas más utilizadas por varios investigadores para administrar los materiales de interés para los pulmones del ratón. Hay pros y los contras de cada técnica en función de los objetivos de un estudio. Aquí un método intubación endotraqueal no invasivo que puede entregar directamente materiales exógenos a los pulmones del ratón se presenta. Esta técnica se aplica para administrar bleomicina a los pulmones del ratón como un modelo para estudiar la fibrosis pulmonar. &lt;/ P&gt;

Inicialmente, la solución de color verde teñido se utiliza para intubar ratones durante la práctica. El pulmón fue resecado inmediatamente después de la intubación para examinar cómo de manera uniforme el color se distribuye en el pulmón (Figura 2). Esta técnica se ha aplicado para estudiar la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina utilizando ratones C57BL / 6. Cuando los ratones fueron intubados por vía intratraqueal con 1,2 U / kg de bleomicina o solución salina como control y la necropsia 3 semana...

El uso de un modelo que imita el estado de las enfermedades pulmonares en los seres humanos es crítico para el estudio de la fisiopatología y / o la etiología de una enfermedad en particular y para el desarrollo de la intervención terapéutica. Aquí un método intubación endotraqueal no invasivo que puede entregar directamente materiales exógenos a los pulmones del ratón se presenta.

No Invasiva Intratraqueal Intubación para Estudiar la Patología y Fisiología de pulmón de ratón

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la intubación intratraqueal para estudiar los efectos de tratamientos experimentales sobre la fisiología y la patología del pulmón contralateral. Esto se logra primero midiendo un ratón control de tamaño similar al del ratón experimental, desde la boca hasta el punto de bifurcación bronquial del pulmón. A continuación, utilice el sistema de iluminación para intubación BioLite para localizar la tráquea.La fibra óptica se retira rápidamente después de la inserción, dejando el catéter en su lugar. En el último paso, se añade una solución que contiene el tratamiento experimental a los pulmones a través del catéter. En última instancia, la distribución uniforme de la molécula de interés puede visualizarse en todo el pulmón mediante el uso de un colorante verde complementario.La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos de intubación es que, con nuestra técnica, el sistema de eliminación de fibra óptica facilita la localización de la tráquea así como la colocación del catéter, asegurando una administración óptima del material de interés en el pulmón. Quien demostrará el procedimiento estará presente en el lugar, un post-OC de mi laboratorio. Antes de comenzar el procedimiento, mida la longitud entre la boca y el punto bronquial utilizando un ratón de prácticas de tamaño similar para determinar la longitud adecuada del catéter que se insertará durante la intubación. A continuación, aplique pomada veterinaria en ambos ojos del animal experimental anestesiado.Después de varios minutos, pellizque una pata para confirmar la sedación y luego coloque el animal en un soporte para intubación. Colóquese en un ángulo de aproximadamente 60 grados. Enganche los incisivos superiores sobre una pequeña banda de goma ubicada en la parte superior del soporte para mantener al animal en su lugar, y luego use un hisopo para retraer suavemente la lengua del ratón hacia un lado.El aspecto más difícil de este procedimiento consiste en localizar claramente la tráquea, que es independiente del esófago y en la cual debe insertarse el catéter. Para tener éxito, asegúrese de que la laringe esté bien iluminada por la fibra óptica y tenga presente la dirección en la que debe insertarse el catéter. Inserte cuidadosamente el sistema de intubación hasta que la laringe sea visualizada con la ayuda de la guía tipo fibra óptica.Una vez que se visualicen la epiglotis y los cartílagos hioides, inserte la fibra por encima de la epiglotis y entre los cartílagos hioides, avanzando el sistema hasta que se haya introducido la longitud previamente determinada del catéter. Una vez que el catéter esté en su lugar, retire rápidamente la guía de fibra óptica para permitir que el animal respire normalmente, y luego administre la solución de interés a través del catéter. Una buena intubación hará que la solución sea inmediatamente aspirada a través del tubo hacia los pulmones.En cuanto la solución sea aspirada hacia los pulmones, retire al ratón del soporte y devuélvalo a su jaula original. Observe al ratón hasta que comience a moverse. Una vez que se confirme el estado de salud del animal, regrese la jaula a su estante.En los experimentos iniciales, se utilizó una solución de colorante verde para intubar a los ratones como práctica. Los pulmones se resecaron inmediatamente después de la intubación para examinar qué tan uniformemente se distribuyó el color. Se observó el colorante en la mayor parte del pulmón, lo que indicó una intubación exitosa.La técnica se aplicó luego para estudiar la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina utilizando ratones C 57 BL six, tres semanas después de la intubación intratraqueal con bleomicina o suero salino como control. Los pulmones se examinaron mediante análisis histológico para evaluar el desarrollo de la fibrosis inducida por bleomicina. No se observó fibrosis ni a baja ni a alta magnificación en los pulmones de los animales tratados con suero salino.En contraste, los ratones intubados con bleomicina desarrollaron fibrosis en todo el pulmón, como se observa en las imágenes con aumento bajo y alto. El contenido de hidroxiprolina fue mayor en los pulmones de los ratones tratados con bleomicina en comparación con los pulmones de los ratones tratados con solución salina. Lo anterior demuestra además que los ratones tratados con bleomicina desarrollan fibrosis pulmonar.Posteriormente, el área dañada se superpuso con una cuadrícula de 121 puntos y se contaron las intersecciones o puntos que caían sobre las áreas fibrosas, expresando el resultado como el porcentaje de un total de 121 puntos; el porcentaje de áreas dañadas contadas de esta manera fue proporcional a la cantidad de bleomicina administrada. Asegúrese de tener una idea previa de qué profundidad debe insertarse el catéter en la tráquea y de confirmar que la solución sea aspirada a través del catéter hacia el pulmón tan pronto como se agregue.

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Medicine

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