Microfluidic Reacción en el chip de captura-cicloadición para inmovilizar reversiblemente pequeñas moléculas o estructuras de múltiples componentes para aplicaciones de biosensores

El objetivo general del siguiente experimento es demostrar una estrategia rápida y generalizable para inmovilizar de forma reversible pequeñas moléculas y nanopartículas funcionalizadas en la superficie de los chips sensores. Esto se logra inmovilizando primero los anticuerpos anti GST en la superficie de un sensor. Como segundo paso, captura del antígeno GST.

Funcionalizado con grupos trans ciclo, octina o tetra zine proporciona una superficie reactiva para reacciones posteriores de cicloedición con derivados sinusoidales tet de moléculas pequeñas o conjugados de ciclooctano de tendencia de nanopartículas, que posteriormente se funcionalizan con derivados sinusoidales tet de moléculas pequeñas. A continuación, la superficie funcionalizada se puede utilizar para el análisis de interacción con un objetivo solubilizado deseado. En el último paso, la superficie se regenera, lo que permite la posterior captura de ciclos de edición cíclica. Los resultados de unión muestran en el barco las reacciones bioortogonales que preservan la capacidad de las moléculas pequeñas inmovilizadas o el lugar de dos nanopartículas funcionalizadas para interactuar con el objetivo FK BP 12 e ilustran cómo este enfoque puede ampliar la gama de aplicaciones para SPR.

La principal ventaja de esta técnica de edición del ciclo de captura en chip es que permite una rápida reversibilidad y movilización de moléculas pequeñas con control sobre la orientación y la densidad de movilización I. Por lo general, el proceso de edición del ciclo de captura se puede realizar en minutos, disminuyendo significativamente los tiempos de preparación de la superficie, lo que demuestra que el procedimiento será Jason Sandler, un estudiante de nuestro laboratorio Para comenzar este procedimiento a ocho microlitros de una solución de 50 milimolares T-C-O-N-H-S en DMSO a 100 microlitros de una solución de GST de un miligramo por mililitro en PBS. Después de agitar la mezcla a temperatura ambiente durante una hora, retire el exceso de reactivo con una columna desalinizadora de centrifugado Zeba.

A continuación, agregue seis microlitros de una solución de tetra NHS Ester de 25 milimolares en DMF a 75 microlitros de una solución de un miligramo por mililitro de GST en PBS y agite la mezcla a temperatura ambiente después de una hora. Diluir la mezcla de reacción con 25 microlitros de PBS y purificar con una columna de desalinización por centrifugación. A continuación, añada 100 microlitros de la solución de 50 milimolares T-C-O-N-H-S a 150 microlitros de una solución de nanopartículas emanadas y agite la mezcla de la misma manera que antes.

Después de mezclar, elimine el exceso de reactivo mediante filtración en gel utilizando una columna NAP 10. Aludido con búfer PBS. Recoja la banda de color que contiene el producto N-P-T-C-O.

Transfiera la muestra purificada a un tubo de centrífuga que contenga un dispositivo de filtro centrífugo con un límite de peso molecular de 100.000. A continuación, concentre la muestra hasta un volumen final de aproximadamente 150 microlitros después de la centrifugación. Añadir 50 microlitros de solución de anhídrido cínico 0,1 molar en DMSO a la solución N-P-T-C-O.

Después de agitar la mezcla a temperatura ambiente durante una hora, purifique el producto N-P-T-C-O utilizando una columna NAP 10 eluyendo con PBS utilizando un instrumento de resonancia de plasma de superficie, seleccione la inmovilización en las celdas de flujo uno y dos en la plantilla del asistente de inmovilización AM. Modificar el método Amin para activar los grupos carboxílicos de superficie mediante la inyección de una solución uno a uno de EDC 0,4 molar y NHS 0,1 molar durante 480 segundos. A un caudal de 10 microlitros por minuto, ajuste la inyección de etanolamina para enfriar los ésteres activados restantes a un tiempo de contacto número 422 a un caudal de 10 microlitros por minuto.

Introduzca el nombre del ligando anti GST y configúrelo para inyectar durante un tiempo de contacto de 420 segundos a un caudal de 10 microlitros por minuto. A continuación, coloque los viales de solución previamente preparados en el estante de reactivos dos. Asegurándose de hacer coincidir las posiciones con la lista de contenido después de asignar el nombre del archivo y el destino donde se guardarán los datos.

Iniciar la inmovilización. Edite el asistente de inmovilización para inyectar solo 20 microgramos por mililitro de la solución de ligando GST durante 420 segundos a cinco microlitros por minuto sobre la celda de flujo de referencia uno. Coloque los viales que contienen G-S-T-T-C-O-A previamente preparados, la solución de olaine TERAZ de 10 micromolares y la solución de regeneración en el estante de reactivos dos.

Seleccione el método de ejecución manual, establezca el caudal en cinco microlitros por minuto y la ruta del flujo en la celda de flujo dos. Inyecte la solución G-S-T-T-C-O durante 420 segundos, seguida de la solución de Teraz Benz Lamine durante 600 segundos. A continuación, regenere la superficie con dos inyecciones 32 de solución de regeneración.

Después de colocar la revista GST TERAZ, N-P-T-C-O, teraz Belamina y los viales de solución de regeneración en el estante de reactivos dos, seleccione el método de ejecución manual del instrumento, luego configure el caudal a cinco microlitros por minuto y la ruta del flujo a la celda de flujo dos. Inyecte una solución de GST Tetra zine durante 60 segundos, seguida de una solución de N-P-T-C-O durante 60 segundos. Finalmente, inyecte una solución de belamina tetras zine durante 60 segundos.

Cuando termine, regenere la superficie de la misma manera que antes. A continuación, seleccione un nuevo método e ingrese los parámetros generales, que incluyen la recopilación de datos, la detección de tasas, el compartimento de muestras, la temperatura, las unidades de concentración y la configuración del tampón. En el panel de pasos de ensayo, cree un nuevo paso y asígnele el nombre muestra.

A continuación, establezca la configuración basada en el propósito y la conexión para muestrear en el panel de tipos de ciclo, cree un nuevo paso de ciclo e inserte los siguientes comandos. Capture la regeneración de la muestra uno y la regeneración dos. Seleccione el comando de captura e introduzca G-S-T-T-C-O como ligando.

Nombra 120 segundos como el tiempo de contacto, cinco microlitros por minuto como el caudal. Y establezca la ruta de flujo en segundo. A continuación, seleccione el comando de muestra e introduzca un tiempo de contacto 182, un tiempo de disociación 62, un caudal de 30 microlitros por minuto y establezca la ruta de flujo en ambos.

Después de esto, seleccione el comando regeneration one e ingrese la solución de regeneración. Nómbralo un tiempo de contacto número 32 a 30 microlitros por minuto y establece la ruta del flujo en un segundo. Repita el mismo procedimiento para la regeneración.

Dos comandos seleccione establecer, ejecutar y establecer la ruta de flujo en dos guiones uno. Seleccione siguiente y llene la lista de muestras con la solución de analito tetra belamina y una serie de concentraciones de 1,5 a 20 micromolares en una dilución de uno a dos. A continuación, seleccione junto al panel de posición del bastidor.

Después de colocar los viales de solución en el bastidor de reactivos dos, coloque la serie de dilución. En una placa de 96 pocillos. Asegurándose de que las posiciones coincidan con la lista de contenido.

Guarde la plantilla de método e inicie el ensayo de unión. Supongamos que una vez que se ha seleccionado un nuevo método y los parámetros generales, cree y asigne un nombre a la muestra de captura y a los pasos de regeneración en el panel de pasos de ensayo. A continuación, seleccione el propósito correspondiente y conecte la configuración base.

A continuación, seleccione el panel Tipos de ciclo y cree tres pasos de ciclo. Captura, muestreo y regeneración. Inserte el comando de captura dos veces en el ciclo de captura.

Entra en la captura de un panel. Seleccione la solución de captura como variable. A continuación, ajuste el tiempo de contacto a 300 segundos a un caudal de cinco microlitros por minuto y ajuste la ruta del flujo a segundo en el panel de captura dos.

Seleccione la solución de captura como variable. Establezca el tiempo de contacto en 250 segundos a un caudal de cinco microlitros por minuto y establezca la ruta del flujo en segundos. A continuación, inserte el comando de ejemplo en el paso del ciclo de muestra.

Seleccione el panel de muestra y establezca el tiempo de contacto en 60 segundos. El tiempo de disociación a 200 segundos a un caudal de 30 microlitros por minuto y establecer la trayectoria del flujo en ambos. Inserte el comando de regeneración dos veces en el paso del ciclo de regeneración, seleccione el panel de regeneración, ingrese la solución de regeneración.

Asigne un tiempo de contacto de 30 segundos a 30 microlitros por minuto y establezca la ruta de flujo en segundos. Repita el mismo procedimiento para la regeneración. Dos paneles seleccionan la configuración, ejecutan y establecen la ruta del flujo en dos guiones, uno selecciona el siguiente e ingresa G-S-T-T-C-O y teraz AP 1, 497 conjugados como los nombres de la solución de captura, FKBP 12 como el nombre de la muestra y 1.5 a 96 nano molar en una dilución de uno a dos como la serie de concentración.

Después de colocar los viales de solución en el bastidor de reactivos dos y la serie de dilución en una placa de 96 pocillos, guarde la plantilla de método e inicie el ensayo de unión. La inmovilización reversible eficiente de moléculas pequeñas bioactivas con control sobre la orientación y la densidad desempeña un papel clave en el desarrollo de nuevas aplicaciones de biosensores. Aquí se muestra el monitoreo en tiempo real de la inmovilización de benjuí teraz zine.

Se inyecta una solución de G-S-T-T-C-O sobre una superficie anti GST preinmovilizada, lo que da como resultado un aumento de aproximadamente 400 R RU. En respuesta, una segunda inyección con Teraz zine Benzo Lamine muestra un rápido aumento de 15 RU en respuesta. No se observó disociación del antígeno dert después de cambiar a tampón corriente, lo que proporciona evidencia de la estabilidad de la estructura.

La superficie se regeneró en el último paso del ciclo para permitir múltiples ciclos de edición de ciclos. Utilizando este procedimiento y reemplazando la tetra zina, la fracción de bencilo lamina con el conjugado teraz zine AP 1, 497 genera una superficie bioactiva, que se utiliza para estudios de interacción con su objetivo. La interrupción de FK BP 12 de la interacción antígeno del anticuerpo regenera la superficie anti GST, lo que permite construir un nuevo ensamblaje molecular.

En este caso, una inyección de zine GST TERAZ es seguida por una inyección de N-P-T-C-O, inmovilizando efectivamente la nanopartícula a la superficie del sensor. Los grupos TCO no reaccionados en las nanopartículas están disponibles para la edición cyclo con lámina Benzo Teraz Zine inyectada. Alternativamente, el conjugado TET INE AP 1, 497 se utiliza para monitorear las interacciones funcionalizadas de la nanopartícula FK BP 12.

No se observó disociación de las estructuras multicomponente, lo que proporciona evidencia de la estabilidad de la estructura y la bioactividad, con capacidades para la inmovilización en tiempo real, el monitoreo de reacciones y la regeneración de la superficie. La caracterización directa de la tasa de asociación KA se lleva a cabo como se muestra aquí. El conocimiento de la cinética de reacción proporciona pautas para controlar la densidad de inmovilización y un parámetro importante para los ensayos de biosensores.

La inyección de concentraciones crecientes de teraz BELAMINA o N-P-T-C-O por duplicado sobre las superficies de glino G-S-T-T-C-O o GST teraz respectivamente genera los datos de unión. Los datos de unión para dos muestras secuenciales de analito de la misma concentración sobre la misma superficie son casi superimponentes, lo que refleja una pérdida mínima de la capacidad de unión de anticuerpos. Debido a los múltiples ciclos de edición y regeneración del ciclo de captura, el software de evaluación proporciona el análisis cinético más adecuado para las velocidades de reacción de la edición del ciclo.

Hemos desarrollado un enfoque que utiliza la captura de antígenos de anticuerpos, junto con reacciones de edición de ciclos rápidas y altamente específicas entre teraz zine y trans cyclina que permite la inmovilización rápida y reversible de moléculas pequeñas. Para los estudios basados en chips SPR, el método de edición del ciclo de captura requiere tiempos de contacto cortos con concentraciones de menos de 10 micromolares de ligandos de moléculas pequeñas. Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de cómo inmovilizar moléculas pequeñas o estructuras multicomponente en la superficie de un sensor utilizando el método de edición cíclica de captura.

Para lograr esto, es importante utilizar reactivos de buena calidad para las reacciones de conjugación y configurar correctamente los parámetros de ensayo en el instrumento SPR.